CN116970565A - 一种用于分离视网膜神经元的试剂盒及方法 - Google Patents
一种用于分离视网膜神经元的试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于分离视网膜神经元的试剂盒及方法，涉及生物细胞技术领域。本发明通过对各组分的具体配方的筛选，使得采用本发明的试剂盒分离得到的小鼠视网膜神经元具有高质量和高活性，其活性均在85％以上；采用本发明的试剂盒制备得到的视网膜神经元能完整地保留神经元的树突、胞体、轴突和其他特殊结构；本发明制备的高活性的视网膜神经元单细胞悬液进行单细胞测序能实现视网膜单个神经元的全部转录组信息的获取，能更全面地分析不同疾病发病过程中的细胞异质性、发现稀有细胞类型。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种用于分离视网膜神经元的试剂盒及方法。
背景技术
近几年来，单细胞测序技术在发现稀有细胞类型、鉴别疾病中的特殊细胞状态和剖析疾病的转录组异质性中发挥了重要作用，而高活性率的单细胞悬液是获取单细胞测序数据的前期基础。现有的用于单细胞测序的新鲜样品制备方法主要分为细胞悬液制备和细胞核悬液制备，细胞核悬液制备难度较低，但由于神经元的细胞核悬液丧失了神经元的细胞质、树突和轴突中起重要生物学作用的mRNA，核悬液获取的单细胞测序数据无法进一步研究细胞质、树突和轴突的转录组信息。而且由于新鲜组织的活细胞悬液后续测序所获得的数据比细胞和悬液获取的数据的噪音更低、能测出的基因更多等特点，高质量视网膜神经元单细胞悬液的制备显得尤为重要。
视网膜作为研究视觉的重要器官，由五大类神经元(感光细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞和视网膜神经节细胞)组成，视网膜的初级神经元树突会与下一级神经元的轴突形成连接，关于视网膜疾病的发病和治疗机制一直在研究中，部分原因是因为很难获取完整的高质量视网膜神经元。视网膜由于其富含种类不同的神经元和神经胶质细胞，利用现有的适用于类似的神经组织如脑组织的单细胞悬液制备方法效果不佳，而且由于每个科研项目研究对象的不同，如需要对视网膜神经元单细胞悬液进行特异细胞富集时，需要对单细胞悬液增加孵育、重悬和离心等操作，普通分离方法制备出来的视网膜神经元极易重新出现聚团现象，该聚团现象通过目前市面上常用的去碎片试剂盒、去髓鞘试剂盒都无法实现将细胞团重新解离成单细胞，而且去碎片和去髓鞘等步骤都需要重悬和离心，每增加一步离心步骤会导致细胞损失至少20％。以上原因都可导致不易获得的、珍贵的视网膜疾病模型样品丢失。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于分离视网膜神经元的试剂盒及方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种细胞营养液，包括以下浓度的组分：6.5～7.5g/L氯化钠，1.4～2.4g/L碳酸氢钠，0.2～0.4g/L氯化钾，0.07～0.27g/L二水氯化钙，0.05～0.25g/L硫酸镁，0.02～0.12g/L磷酸二氢钠，0.68～1.48g/L葡萄糖，0.02～0.12g/L左旋谷酰胺，0.01～0.05g/L环己六醇。本申请发明人经过大量的实验对组分的种类及含量进行筛选，最终得到上述配方的细胞营养液，该细胞营养液适合保持视网膜的各类细胞的活性，还能保持视网膜神经节细胞的电生理功能。采用该细胞营养液进行灌流不仅能去除红细胞，还能保护取材过程对组织的损伤。
本发明还提供一种细胞清洗液，包括所述的细胞营养液和0.20～0.30mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ。现有技术中对视网膜神经元单细胞悬液进行特异细胞富集时，需要在消化细胞后增加去髓鞘、裂红细胞、去死细胞、去碎片以及特定细胞群富集(上流式分选或者磁珠分选)等步骤，都需要增加许多孵育、离心和重悬等步骤。但视网膜的单细胞特点是容易在离心后聚团，且聚团不容易吹散成单个细胞。本申请发明人经过大量的实验发现，本发明的细胞清洗液既能解决聚团问题，其中富含的细胞营养液也能给神经元提供必要的营养成分、维持其活性。
本发明还提供一种用于分离视网膜神经元的试剂盒，所述试剂盒包括所述的细胞营养液和所述的细胞清洗液。
作为本发明所述用于分离视网膜神经元的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括消化液、消化中和液和细胞重悬液。
视网膜组织富含各种神经元和神经胶质细胞，由于神经元极其容易受到消化液等化学刺激以及温度等物理刺激，现有技术中存在消化效率不高、或消化过度以及单细胞悬液细胞活性低等缺点。本发明通过各种组分的配方进行筛选，最终得到一种用于分离视网膜神经元的试剂盒，采用该试剂盒进行网膜神经元进行分离，得到的视网膜神经元的活性均在85％以上，能在显微镜观察到神经元形态，其边界清晰，神经元胞体、轴突和树突明显。
作为本发明所述用于分离视网膜神经元的试剂盒的优选实施方式，所述消化液包括以下浓度的组分：30～50U/ml木瓜蛋白酶，5～17mM L-半胱氨酸，1.7～2.7mM乙二胺四乙酸，1.5～3.5mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ。
作为本发明所述用于分离视网膜神经元的试剂盒的优选实施方式，所述消化中和液包括所述的细胞营养液和消化中和液总体积5～15％的胎牛血清。
作为本发明所述用于分离视网膜神经元的试剂盒的优选实施方式，所述细胞重悬液包括1x磷酸盐缓冲液和细胞重悬液总体积0.03～0.05％的牛血清白蛋白。
本发明还提供所述的试剂盒分离视网膜神经元的方法，包括以下步骤：
(1)视网膜的获取；
(2)将视网膜转移到预热的消化液进行消化；
(3)在步骤(2)的消化液中加入消化终止液并吹打，得组织悬液；
(4)将组织悬液进行过滤，取滤液；
(5)将步骤(4)的滤液进行离心，取细胞沉淀；
(6)在细胞沉淀中加入细胞清洗液，吹打得细胞悬液；
(7)将细胞悬液进行离心，取细胞沉淀；
(8)在步骤(7)的细胞沉淀中加入细胞重悬液进行重悬，得所述视网膜神经元。
本发明的有益效果：本发明提供的一种用于分离视网膜神经元的试剂盒及方法，通过对各组分的具体配方的筛选，使得采用本发明的试剂盒分离得到的小鼠视网膜神经元具有高质量和高活性，其活性均在85％以上；采用本发明的试剂盒制备得到的视网膜神经元能完整地保留神经元的树突、胞体、轴突和其他特殊结构；本发明制备的高活性的视网膜神经元单细胞悬液进行单细胞测序能实现视网膜单个神经元的全部转录组信息的获取，能更全面地分析不同疾病发病过程中的细胞异质性、发现稀有细胞类型。
附图说明
图1为实施例1的细胞计数结果图。
图2为实施例2的细胞计数结果图。
图3为实施例3的细胞计数结果图。
图4为实施例1的分离的视网膜神经元光镜下高倍镜的视野图。
图5为实施例2的分离的视网膜神经元光镜下高倍镜的视野图。
图6为实施例3的分离的视网膜神经元光镜下高倍镜的视野图。
图7为对比例1制备的单细胞悬液图。
图8为对比例1制备单细胞悬液中的细胞团块的光镜下高倍镜的视野图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
本发明实施例的一种用于分离视网膜神经元的试剂盒，包括细胞营养液、消化液、消化中和液、细胞清洗液和细胞重悬液；
所述细胞营养液包括：7.0g/L氯化钠，1.9g/L碳酸氢钠，0.23g/L氯化钾，0.17g/L二水氯化钙，0.15g/L硫酸镁，0.07g/L磷酸二氢钠，1.08g/L葡萄糖，0.07g/L左旋谷酰胺，0.03g/L环己六醇；
所述消化液包括：40U/ml木瓜蛋白酶，11mM L-半胱氨酸，2.2mM乙二胺四乙酸，2mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
所述消化中和液包括：所述细胞营养液和消化中和液总体积10％的胎牛血清；
所述细胞清洗液包括：所述的细胞营养液和0.25mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
所述细胞重悬液包括：1x磷酸盐缓冲液和细胞重悬液总体积0.04％的牛血清白蛋白。
本实施例采用上述用于分离视网膜神经元的试剂盒分离小鼠视网膜神经元，具体包括以下步骤：
(1)动物灌流：使用戊巴比妥将小鼠进行充分麻醉后，将小鼠固定在解剖台上，使用注射器针头固定住小鼠的四肢。用组织剪小心剪开小鼠胸部皮肤，剪开胸骨打开胸腔，避免损伤组织，充分暴露心脏。使用静脉注射针插入左心室后固定注射针的位置，再用组织剪剪开右心耳，经静脉注射针缓慢推注充分氧合后的预冷的细胞营养液约40～60ml。
(2)组织取材：充分灌流后，快速地将小鼠眼球取出，放置在预冷细胞营养液的培养皿中，使用1ml注射器针头在眼球的角巩膜缘下方戳开小孔，用维纳斯剪沿着小孔剪开角膜，分离眼前节组织和晶状体，小心去除玻璃体，分离出视网膜。分离后的视网膜再使用新的预冷细胞营养液洗涤一次，迅速放入已在水浴锅中预热的消化液中，并记录时间。
(3)组织消化：总消化时间约8～10分钟，每3～5分钟使用无酶1ml枪头上下吹打组织5次，使其充分消化。
(4)终止消化：往消化好的组织中加入两倍体积的消化中和液，使用无酶的1ml枪头吹打充分混匀直至组织完全吹散。使用消化中和液1～2ml提前润洗好细胞网筛(孔径为30～40μm)，轻柔地将上述组织悬液经润洗后的细胞网筛过滤，去除组织碎片。
(5)离心：将上述步骤过滤后的收集到溶液进行离心，离心转速为300g，离心时间为8～10分钟，离心机的温度设置为4℃，离心后小心移除上清液，获得细胞沉淀。
(6)清洗：往上述获得的细胞沉淀物中加入1ml的清洗液，此时细胞沉淀容易成团，再使用200μl的枪头轻轻吹打细胞沉淀物，直至细胞沉淀物完全散开，此过程保持手法轻柔，避免损伤神经元。
(7)离心：将步骤(6)的溶液进行离心，离心转速为300～500g，离心时间为8～10分钟，离心机的温度设置为4℃。离心后小心移除上清液，获得细胞沉淀。
(8)重悬：往细胞沉淀物中加入500μl的细胞重悬液进行重悬，取5～10μl混匀后的单细胞悬液加入5～10μl台盼蓝(0.4％，Invitrogen)中，充分混匀(体积比为1:1)。取10μl置于细胞计数板(Invitrogen)上，再使用自动细胞计数仪(Invitrogen，CountessⅡ)进行细胞计数和活率统计，在显微镜下观察神经元的形态。
实施例2
本发明实施例的一种用于分离视网膜神经元的试剂盒，包括细胞营养液、消化液、消化中和液、细胞清洗液和细胞重悬液；
所述细胞营养液包括：6.5g/L氯化钠，1.4g/L碳酸氢钠，0.2g/L氯化钾，0.07g/L二水氯化钙，0.05g/L硫酸镁，0.02g/L磷酸二氢钠，0.68g/L葡萄糖，0.02g/L左旋谷酰胺，0.01g/L环己六醇；
所述消化液包括：30U/ml木瓜蛋白酶，5mM L-半胱氨酸，1.7mM乙二胺四乙酸，1.5mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
所述消化中和液包括：所述细胞营养液和消化中和液总体积5％的胎牛血清；
所述细胞清洗液包括：所述的细胞营养液和0.20mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
所述细胞重悬液包括：1x磷酸盐缓冲液和细胞重悬液总体积0.03％的牛血清白蛋白。
采用本实施例的试剂盒分离小鼠视网膜神经元的方法与实施例1相同。
实施例3
本发明实施例的一种用于分离视网膜神经元的试剂盒，包括细胞营养液、消化液、消化中和液、细胞清洗液和细胞重悬液；
所述细胞营养液包括：7.5g/L氯化钠，2.4g/L碳酸氢钠，0.4g/L氯化钾，0.27g/L二水氯化钙，0.25g/L硫酸镁，0.12g/L磷酸二氢钠，1.48g/L葡萄糖，0.12g/L左旋谷酰胺，0.05g/L环己六醇；
所述消化液包括：50U/ml木瓜蛋白酶，17mM L-半胱氨酸，2.7mM乙二胺四乙酸，3.5mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
所述消化中和液包括：所述细胞营养液和消化中和液总体积5％的胎牛血清；
所述细胞清洗液包括：所述的细胞营养液和0.30mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
所述细胞重悬液包括：1x磷酸盐缓冲液和细胞重悬液总体积0.05％的牛血清白蛋白。
采用本实施例的试剂盒分离小鼠视网膜神经元的方法与实施例1相同。
对比例1
本对比例采用常规方法分离小鼠视网膜神经元，所述方法使用的试剂如下：
细胞营养液：DMEM细胞培养基；
消化液：40U/ml木瓜蛋白酶，11mM L-半胱氨酸，2.2mM乙二胺四乙酸，2mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ；
消化中和液：DMEM细胞培养基和消化中和液总体积10％的胎牛血清；
细胞清洗液：以DMEM细胞培养基和占细胞清洗液总体积5％的胎牛血清；
细胞重悬液：1x磷酸盐缓冲液和细胞重悬液总体积0.04％的牛血清白蛋白。
步骤：对比例1分离小鼠视网膜神经元的方法步骤与实施例1相同。
实验例
在显微镜下观察实施例1～3、对比例1所得神经元细胞的形态，并采用自动细胞计数仪检测所制备的神经元细胞的活性和计数，结果如表1、图1～6所示。
表1
| 实施例 | 视网膜数量 | 获取的细胞总数 | 细胞活性 | 细胞密度 |
| 实施例1 | 1 | 2.455×106个 | 95％ | 4.91×106个/ml |
| 实施例2 | 1 | 2.07×106个 | 90％ | 1.38×106个/ml |
| 实施例3 | 1 | 2.11×106个 | 88％ | 2.11×106个/ml |
图1～3分别为实施例1～3的细胞悬液经台盼蓝染色后在细胞计数仪上的报告，可以看出实施例1～3的细胞活性均在85％以上，细胞状态很好，细胞的大小分布涵盖了视网膜所有神经元种类的大小。由图4～6可以看出，实施例1～3分离得到的视网膜神经元形态清晰，能完整地保留神经元树突、胞体、轴突分支。
图7～8为采用对比例1分离的视网膜神经元，由图7可以看出采用对比例1的方法分离视网膜神经元，制备单细胞悬液出现严重的细胞团聚现象，即使使用移液枪上下的吹打多次都无法将该细胞团吹散。图8为该细胞团块在光镜下高倍镜的视野图，可以看出该团块主要由细胞组成，细胞密度很高，且细胞与细胞间黏连紧密。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种细胞营养液，其特征在于，包括以下浓度的组分：6.5～7.5g/L氯化钠，1.4～2.4g/L碳酸氢钠，0.2～0.4g/L氯化钾，0.07～0.27g/L二水氯化钙，0.05～0.25g/L硫酸镁，0.02～0.12g/L磷酸二氢钠，0.68～1.48g/L葡萄糖，0.02～0.12g/L左旋谷酰胺，0.01～0.05g/L环己六醇。
2.一种细胞清洗液，其特征在于，包括权利要求1所述的细胞营养液和0.20～0.30mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ。
3.一种用于分离视网膜神经元的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的细胞营养液和权利要求2所述的细胞清洗液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括消化液、消化中和液和细胞重悬液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述消化液包括以下浓度的组分：30～50U/ml木瓜蛋白酶，5～17mM L-半胱氨酸，1.7～2.7mM乙二胺四乙酸，1.5～3.5mg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述消化中和液包括权利要求1所述的细胞营养液和消化中和液总体积5～15％的胎牛血清。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞重悬液包括1x磷酸盐缓冲液和细胞重悬液总体积0.03～0.05％的牛血清白蛋白。
8.采用权利要求3～7任一项所述的试剂盒分离视网膜神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)视网膜的获取；
(2)将视网膜转移到预热的消化液进行消化；
(3)在步骤(2)的消化液中加入消化终止液并吹打，得组织悬液；
(4)将组织悬液进行过滤，取滤液；
(5)将步骤(4)的滤液进行离心，取细胞沉淀；
(6)在细胞沉淀中加入细胞清洗液，吹打得细胞悬液；
(7)将细胞悬液进行离心，取细胞沉淀；
(8)在步骤(7)的细胞沉淀中加入细胞重悬液进行重悬，得所述视网膜神经元。
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