CN116970069B - 一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法及其应用。属于生物融合技术领域。本发明选用卵黄低密度脂蛋白作为头孢噻呋的载体,相较于传统血清低密度脂蛋白作为靶向载体,不仅降低了生产成本,而且提高了头孢噻呋的包载效率,通过优化融合技术,实现了卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的有效包载,降低了头孢噻呋的突释率。本发明还提供了一种采用上述融合方法得到的融合产物,以及该融合产物在制备头孢噻呋胞内杀菌药物中的应用,为头孢噻呋在制备治疗胞内菌感染药物中的应用,提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物融合技术领域,更具体的说是涉及一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法。
背景技术
低密度脂蛋白为自然界中天然存在的纳米颗粒,是体内脂质转运的四大类脂蛋白之一,其普遍存在于血清,乳汁和蛋黄中。低密度脂蛋白为球形的颗粒结构,直径为20-60nm,含有12%的蛋白质和88%的脂质,其中88%的脂质中又包括71% 三酰甘油酯、25% 磷脂( PC /PE 大约为 6. 1) 和 4% 胆固醇。其主要结构是由三酰基甘油和胆固醇所构成的脂质核心,以及脱辅基蛋白Apo B-100和磷脂构成的磷脂单分子膜组成。在磷脂单分子层中又会插入一些磷脂来增强膜的强度。与传统人工合成的纳米颗粒相比,低密度脂蛋白具有生物相容性和可生物降解性,同时降低了免疫原性以及逃避网状内皮系统识别和消除的天然能力。而且细胞表面的LDL受体可以识别并吞噬低密度脂蛋白,这就使包载于低密度脂蛋白中的药物拥有了跨膜转运和一定生物靶向性的能力。以上的优点使低密度脂蛋白成为一种非常具有应用前景的天然载药纳米颗粒。
头孢噻呋,是全球第一个畜禽专用的第三代头孢菌素,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的抗菌活性、体内动力学过程、极低的药物残留以及动物专用的属性,成为了新一代兽药代表,在兽医临床中具有广泛的应用前景。
但头孢噻呋在兽医临床应用中,由于不具备透膜性,仅对体液内的有害菌具有杀灭作用,但无法作用于细胞内的有害菌,导致头孢噻呋的应用受阻,针对上述问题,常采用血清低密度脂蛋白和头孢噻呋进行融合,但其包载效率低,无法充分发挥头孢噻呋的杀菌功效;且头孢噻呋具有特殊的结构,在中性溶液中容易变成水溶性较高的头孢噻呋钠,导致其易于从载体上脱落,突释率高。
卵黄低密度脂蛋白,是从鸡蛋黄中提取得到的一种低密度脂蛋白,与血清低密度脂蛋白同样具有良好的生物相容性、生物降解性以及被细胞表面的LDL受体识别吞噬的特性,可作为药物跨膜转运的载体。且相比于血清低密度脂蛋白成本低。针对卵黄低密度脂蛋白作为药物跨膜转运的载体,本发明申请人曾针对卵黄低密度脂蛋白和利福喷丁的融合方法进行过研究,但由于利福喷丁和头孢噻呋的性质不同,采用利福喷丁的融合方法对头孢噻呋进行融合,无法实现卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的有效融合,包载率为0。且现有技术不存在卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋融合方法的相关研究。
因此,如何提供一种低成本、高包载效率,低突释率的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,该方法采用卵黄低密度脂蛋白作为靶向载体和头孢噻呋融合,相比于传统的血清低密度脂蛋白作为载体,不仅降低了成本,也提高了头孢噻呋的包载效率,且本发明通过对卵黄低密度脂蛋白的改性,成功实现了卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋有效包载,降低了头孢噻呋的突释率。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,包括如下步骤:
(1)按照1:5的体积比,取浓度为3-5mg/mL卵黄低密度脂蛋白,缓慢滴加到浓度为5-15mg/mL的头孢噻呋溶液中,边滴加边搅拌,得混合液1;
(2)取NaOH溶液缓慢滴加到混合液1中,边滴加边搅拌至pH为6.0-6.5,结束滴加,得混合液2;
(3)将混合液2摇床恒温,避光反应6h,得反应液;
(4)将反应液,过滤除杂,超滤浓缩,得浓缩产物1;
(5)将浓缩产物1,以1.5mL/min流速通过层析柱,以PBS溶液淋洗层析柱,回收OD280nm处的基线洗脱物,将洗脱物进行超滤浓缩,得浓缩产物2;
(6)将浓缩产物2加入生理盐水继续超滤浓缩,过滤除菌,得卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物;
或,将浓缩产物2,透析、过滤除菌,得卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物。
上述步骤(1)-(3)的有益效果为:将浓度为3-5mg/mL卵黄低密度脂蛋白,缓慢滴加到浓度为5-15mg/mL的头孢噻呋溶液,此时混合液1的pH会不断升高,头孢噻呋会变成头孢噻呋阴离子CFT-;取NaOH溶液缓慢滴加到混合液1中,此过程中对卵黄低密度脂蛋白进行了改性,卵黄低密度脂蛋白中载脂蛋白中的氨基酸残基被激活,形成了卵黄低密度脂蛋白阳离子heLDL+;进而孢噻呋阴离子CFT-与卵黄低密度脂蛋白阳离子heLDL+可有效融合,形成融合产物。
优选地,步骤(1)所述头孢噻呋溶液制备方法如下:按照质量体积比0.05-0.15:1(g/mL)取头孢噻呋,加入无水乙醇充分溶解,加NaOH调pH至6.4-6.6,然后加入PBS定容至头孢噻呋终浓度为5-15mg/mL,过滤除菌得头孢噻呋溶液。
所述PBS制备方法如下:取137mM NaCl、3mM KCl、8mM Na2HPO4、1.5mM K2HPO4混合,调pH至7.4,得PBS溶液。
优选地,步骤(1)所述卵黄低密度脂蛋白制备方法如下:
a:取鸡蛋的蛋黄,加入NaCl溶液一次稀释,4℃下搅拌,离心,取上清液相同条件下二次离心,加入NaCl溶液二次稀释,得蛋黄浆溶液;
b:将蛋黄浆溶液以1.5mL/ min 流速过层析柱;
c:淋洗,洗脱,回收OD280nm处的基线洗脱物,即得粗卵黄低密度脂蛋白;
d:将粗卵黄低密度脂蛋白,透析、浓缩、过滤除菌,即得卵黄低密度脂蛋白。
优选地,步骤a所述NaCl溶液的浓度为150mM,一次稀释NaCl溶液加入量为蛋黄体积的两倍,二次稀释加入量为上清液体积的四倍。
优选地,所述搅拌为:搅拌转速下搅拌1h ;所述离心为:10000g,4℃,离心45min。
优选地,步骤c所述淋洗过程如下:用150mM NaCl淋洗液,以1.5mL/ min的流速淋洗。
优选地,所述洗脱过程如下:使用pH为7.4,含有0.02%NaN3的1M的NaCl溶液,以1.5mL/ min的流速洗脱。
优选地,步骤d所述透析过程如下:使用含有0.02%NaN3的150mM的NaCl溶液对产物进行透析,透析时间24h,每8h更换一次透析液,透析袋截留分子量为8000-140000Da。
优选地,所述浓缩,过滤除菌过程如下:以PEG20000对产物进行浓缩,0.22μm 滤膜过滤除菌。
优选地,步骤(1)所述卵黄低密度脂蛋白的浓度为5mg/mL,头孢噻呋溶液的浓度为10mg/mL;所述滴加的速度为1.5mL/min;所述搅拌的转速为100r/min;
步骤(2)所述滴加的速度为0.5mL/min;所述搅拌的转速为100r/min;
步骤(3)所述摇床的培养温度为37℃,转速为120r/min;
步骤(4)中使用0.45μm滤膜进行过滤除杂;使用截留率为100kDa的超滤管超滤浓缩;
步骤(6)中使用截留率为100kDa的超滤管进行超滤浓缩;使用无菌生理盐水进行透析,透析时间24h,每8h更换一次透析液,透析袋截留分子量为8000-140000Da。
本发明的另一目的是提供一种根据上述方法制备的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物。
本发明的再一目的是提供上述卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物在制备头孢噻呋胞内杀菌药物中的应用。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明选用卵黄低密度脂蛋白作为头孢噻呋的载体,相较于传统血清低密度脂蛋白作为靶向载体,不仅降低了生产成本,而且提高了头孢噻呋的包载效率,通过优化融合技术,成功实现了卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的有效融合,降低了头孢噻呋的突释率,为头孢噻呋在治疗胞内菌感染中的应用,提供了技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为:卵黄脂蛋白与头孢噻呋融合产物SDS-PAGE电泳图片;
图2为:卵黄低密度脂蛋白(左)以及卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物(右)透射电镜图;
图3为:卵黄低密度脂蛋白(heLDL)和血清低密度脂蛋白(LDL)对于头孢噻呋的包载率对比图;
图4为:CFT-heLDL-FITC、DAPI以及Mergr,与细胞孵育不同时间时,细胞内药物蓄积的情况图;
图5为:CFT-heLDL和游离的CFT的胞内杀菌效果图;
图6为:CFT-heLDL相较于游离的CFT透过细胞膜在细胞内蓄积的效果对比图;
图7为:优化前包载方法和优化后包载方法对头孢噻呋的包载率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例中所采用的卵黄低密度脂蛋白,采用如下方法制备而成:
(1)新鲜鸡蛋1枚,去除蛋清和黏着在蛋黄膜上的白色卵带,收集蛋黄(约15mL)到一个冷却的无菌烧杯中,加入30mL 150mM NaCl溶液稀释,混合液在4℃,100r/min搅拌1h;10000g,4℃,离心45min,取上清液,在相同条件下离心,取上清液加入180mL 150mMNaCl溶液二次稀释,得蛋黄浆溶液;
(2)取60mL蛋黄浆溶液以1.5mL/ min 流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(F2.6*10cm);
(3)以150mM NaCl溶液淋洗层析柱至基线.流速1.5mL/ min ;使用pH为7.4,含有0.02% NaN3的1M的NaCl溶液,以1.5mL/ min的流速洗脱洗脱层析柱,层析柱下端连接核酸蛋白(紫外)检测仪,设定波长为OD280nm,回收仪器数值≥2的洗脱物,即为粗卵黄低密度脂蛋白;
(4)使用1L含有0.02% NaN3的150mM的NaCl溶液对20mL粗卵黄低密度脂蛋白进行透析,透析时间24h,每8h更换一次透析液,透析袋截留分子量为8000-140000Da;使用PEG20000对产物进行浓缩,0.22μm 滤膜过滤除菌,即得卵黄低密度脂蛋白。
实施例1
一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法
(1)头孢噻呋溶液的配置:称取0.4g头孢噻呋,加入4ml无水乙醇充分溶解后,加入NaOH调pH至6.5,使用PBS溶液(137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,pH7.4)将上述溶液定容至40ml,头孢噻呋终浓度=10mg/mL,0.22μm滤膜过滤除菌;
(2)取浓度为5mg/mL的卵黄低密度脂蛋白8mL以1.5mL/min的速度缓慢滴加到40mL浓度为10mg/mL的头孢噻呋溶液中,边滴加边以100r/min的速度搅拌,得混合液1;
(2)取NaOH溶液以0.5mL/min的速度缓慢滴加到混合液1中,边滴加边以100r/min的速度搅拌至pH为6.0-6.5,结束滴加,得混合液2;
(3)将混合液2摇床37℃恒温,避光反应6h,得反应液;
(4)取反应液,0.45μm滤膜过滤杂质,采用截留率为100kDa的超滤管超滤浓缩,得浓缩产物1;
(5)将超滤浓缩后的产物分5次以1.5mL/min流速通过Sephadex G-25层析柱(F1.6*15cm),以PBS溶液淋洗层析柱,在层析柱下连接核酸蛋白(紫外)检测仪,设定波长为OD280nm,这时检测仪的数值变化会先后出现两个峰值,回收第一次峰值中数值≥1的基线洗脱物,将洗脱物使用截留率为100kDa的超滤管超滤浓缩,得浓缩产物2;
(6)之后将浓缩产物2加入生理盐水继续超滤3遍,0.22μm滤膜过滤除菌,得卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物。
实施例2
(1)头孢噻呋溶液的配置:称取4g头孢噻呋,加入40ml无水乙醇充分溶解后,加入NaOH调pH至6.5,使用PBS溶液(137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,pH7.4)将上述溶液定容至400ml;头孢噻呋终浓度=10mg/ml,0.22μm滤膜过滤除菌;
(2)取浓度为5mg/mL的卵黄低密度脂蛋白80mL以1.5mL/min的速度缓慢滴加到400mL浓度为10mg/mL的头孢噻呋溶液中,边滴加边以100r/min的速度搅拌,得混合液1;
(2)取NaOH溶液以0.5mL/min的速度缓慢滴加到混合液1中,边滴加边以100r/min的速度搅拌至pH为6.0-6.5,结束滴加,得混合液2;
(3)将混合液2摇床37℃恒温,避光反应6h,得反应液;
(4)取反应液,0.45μm滤膜过滤杂质,采用截留率为100kDa的超滤管超滤浓缩,得浓缩产物1;
(5)将超滤浓缩后的产物分5次以1.5mL/min流速通过Sephadex G-25层析柱(F1.6*15cm),以PBS溶液淋洗层析柱,层析柱下连接核酸蛋白(紫外)检测仪,设定波长为OD280nm,这时检测仪的数值变化会先后出现两个峰值,回收第一次峰值中数值≥1的基线洗脱物,将洗脱物使用截留率为100kDa的超滤管超滤浓缩,得浓缩产物2;
(6)将浓缩产物2移入截留分子量为8000-140000Da,透析介质为无菌生理盐水的透析袋中,透析24h,每隔8h更换一次透析液,透析结束后,0.22μm滤膜过滤除菌,得卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物。
将实施例1制备的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物以及单独的卵黄低密度脂蛋白进行SDS-PAGE电泳、透射电镜以及跨细胞膜相关试验。
融合产物以及单独的卵黄低密度脂蛋白的SDS-PAGE电泳图片如图1所示;融合产物以及单独的卵黄低密度脂蛋白的透射电镜图如图2所示。
实验结果表明:本发明融合方法制备的融合产物,可有效跨细胞膜,将头孢噻呋靶向作用于细胞内,实现了头孢噻呋靶向作用于胞内病原菌,有效治疗胞内病原菌疾病。
实施例3
将本发明实施例1卵黄低密度脂蛋白(heLDL)作为包载原料,同时设置血清低密度脂蛋白(LDL)对照组,采用本发明融合方法分别对头孢噻呋进行包载试验,测定试验组和对照组包载率,试验结果如图3所示。
本实施例所用的血清低密度脂蛋白(LDL)与英文文献“LDL acts as an opsoninenhancing the phagocytosis of group A Streptococcus by monocyte and wholehuman blood”中所用LDL相同。
结果分析:由图3可知,在相同试验条件下,卵黄低密度脂蛋白相较于血清低密度脂蛋白具有更好的包载头孢噻呋的能力。
实施例4
卵黄低密度脂蛋白浓度为100mg/mL的标记有绿色荧光标签(FITC)的CFT-heLDL-FITC(头孢噻呋结合卵黄低密度脂蛋白组)与细胞进行孵育0.5h、4h以及24h,孵育结束后,使用多聚甲醛固定细胞后,使用DAPI(蓝色荧光)染料染细胞核,之后在激光共聚焦显微镜下,观察细胞内药物蓄积的情况(绿色荧光),其结果如图4所示。
结果分析:当药物与细胞孵育4h时,细胞内可见大量的绿色荧光颗粒聚集,这说明药物已经成功进入细胞中。随着时间推移至24h,细胞内仍可见绿色的荧光颗粒,这说明药物在细胞内蓄积的时间可达到24h。
实施例5
以实施例2制备的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物(CFT-heLDL)作为试验组,以游离的头孢噻呋(CFT)作为对照组,进行胞内杀菌效果以及透过细胞膜在细胞内蓄积效果的对照实验,实验结果分别如图5和图6所示。
Pi为死细菌的染料,死亡的细菌可被此染料染为红色;syt9为活细菌的染料,活的细菌可被此染料染为绿色;DAPI为细胞核染料,细胞核可以着色为蓝色;merge释义为融合,常在激光共聚焦的图中表示多荧光共聚焦。
结果分析:如图5所示,其中绿色颗粒为活菌染色,红色为死菌染色,可以明显看出,卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物相比游离的头孢噻呋具有更好的胞内杀菌效果。
如图6所示,横坐标代表着头孢噻呋的浓度,纵坐标代表着每mg细胞蛋白中所含头孢噻呋的量,CFT-heLDL比CFT具有更好的细胞内蓄积的能力。
实施例6
以本发明融合方法作为优化后方法,对头孢噻呋进行包载,采用申请号为:201410030635.6,发明名称为:卵黄低密度脂蛋白的提取及与利福喷丁的融合技术中的融合方法作为优化前的方法,对头孢噻呋进行包载,对照不同融合方法的包载率,实验结果如图7所示。
采用优化前方法对头孢噻呋具体包载过程如下:
(1)、称取0.025g的头孢噻呋,加入1mL无水乙醇和1.5mL的10N NaOH,溶解药物后加入PBS定容至50mL;
(2)取30mL头孢噻呋溶液与10mL卵黄低密度脂蛋白混合,37℃避光放置30min,4℃避光放置12h;
(3)使用硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱纯化药物。
结果分析:由于优化前的方法没有使头孢噻呋和卵黄低密度脂蛋白以可以反应的离子形式存在,故包载不成功。且在利福喷丁与卵黄低密度脂蛋白的包载中,根据利福喷丁的化学特性,第一步加入碱性物质的目的在于增加其溶解度,而并非改变其在水中存在的方式,其包载原理主要为相似相溶,与本专利在原理上有十分明显的区别。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,包括如下步骤:
按照1:5的体积比,取浓度为3-5mg/mL卵黄低密度脂蛋白,缓慢滴加到浓度为5-15mg/mL的头孢噻呋溶液中,边滴加边搅拌,得混合液1;
取NaOH溶液缓慢滴加到混合液1中,边滴加边搅拌至pH为6.0-6.5,结束滴加,得混合液2;
将混合液2摇床恒温,避光反应6h,得反应液;
将反应液,过滤除杂,超滤浓缩,得浓缩产物1;
将浓缩产物1,以1.5mL/min流速通过层析柱,以PBS溶液淋洗层析柱,回收OD280nm处的基线洗脱物,将洗脱物进行超滤浓缩,得浓缩产物2;
将浓缩产物2加入生理盐水继续超滤浓缩,过滤除菌,得卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物;或将浓缩产物2,透析、过滤除菌,得卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物;
步骤(1)所述头孢噻呋溶液制备方法如下:按照质量体积比g/mL 0.05-0.15:1取头孢噻呋,加入无水乙醇充分溶解,加NaOH调pH至6.4-6.6,然后加入PBS定容至头孢噻呋终浓度为5-15mg/mL,过滤除菌得头孢噻呋溶液。
2.根据权利要求1所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,所述PBS组成为:137mMNaCl、3mMKCl、8mMNa2HPO4、1.5mMK2HPO4,pH 7.4。
3.根据权利要求1所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,步骤(1)所述卵黄低密度脂蛋白制备方法如下:
a:取鸡蛋的蛋黄,加入NaCl溶液一次稀释,4℃下搅拌,离心,取上清液相同条件下二次离心,加入NaCl溶液二次稀释,得蛋黄浆溶液;
b:将蛋黄浆溶液以1.5mL/min流速过层析柱;
c:淋洗,洗脱,回收OD280nm处的基线洗脱物,即得粗卵黄低密度脂蛋白;
d:将粗卵黄低密度脂蛋白,透析、浓缩、过滤除菌,即得卵黄低密度脂蛋白。
4.根据权利要求3所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,步骤a所述NaCl溶液的浓度为150mM,一次稀释NaCl溶液加入量为蛋黄体积的两倍,二次稀释加入量为上清液体积的四倍;所述搅拌为:100r/min搅拌1h;所述离心为:10000g,4℃,离心45min。
5.根据权利要求3所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,步骤c所述淋洗过程如下:用150mMNaCl淋洗液,以1.5mL/min的流速淋洗;所述洗脱过程如下:使用pH为7.4,含有0.02%NaN3的1M的NaCl溶液,以1.5mL/min的流速洗脱。
6.根据权利要求3所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,步骤d所述透析过程如下:使用含有0.02%NaN3的150mM的NaCl溶液对产物进行透析,透析时间24h,每8h更换一次透析液,透析袋截留分子量为8000-140000Da;所述浓缩,过滤除菌过程如下:以PEG20000对产物进行浓缩,0.22μm滤膜过滤除菌。
7.根据权利要求1所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合方法,其特征在于,步骤(1)所述卵黄低密度脂蛋白的浓度为5mg/mL,头孢噻呋溶液的浓度为10mg/mL;所述滴加的速度为1.5mL/min;所述搅拌的转速为100r/min;
步骤(2)所述滴加的速度为0.5mL/min;所述搅拌的转速为100r/min;
步骤(3)所述摇床的培养温度为37℃,转速为120r/min;
步骤(4)中使用0.45μm滤膜进行过滤除杂;使用截留率为100kDa的超滤管超滤浓缩;
步骤(6)中使用截留率为100kDa的超滤管进行超滤浓缩;使用无菌生理盐水进行透析,透析时间24h,每8h更换一次透析液,透析袋截留分子量为8000-140000Da。
8.一种根据权利要求1-7任一所述方法制备的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物。
9.如权利要求8所述的卵黄低密度脂蛋白和头孢噻呋的融合产物在制备头孢噻呋胞内杀菌药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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