CN116970045A - 幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原mcp及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种幽门螺杆菌重组蛋白MCP及其制备方法和用途。目前Hp疫苗的研究主要集中在尿素酶UreA、UreB或空泡毒素VacA等毒力因子上，还未见有对MCP蛋白是否能作为疫苗抗原成分的研究，本发明提供了一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP的编码核苷酸，以及制备方法和用途。该蛋白具有易纯化、纯度高、制备方法简便等优点，具有显著的经济效益，且动物实验证明其有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用，可作为预防幽门螺杆菌感染的疫苗抗原候选成分。

Description

幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种幽门螺杆菌重组蛋白MCP及其制备方法和用途。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，以下简称Hp)是一种微需氧，寄生于胃黏膜表面的革兰阴性致病菌，可引起慢性胃炎、胃溃疡、胃癌及黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生与发展。临床上治疗幽门螺杆菌感染的传统方法为含铋剂的四联疗法与混合疗法等均不能有效根除Hp，而在治疗过程中出现的抗生素耐药性、患者服用后不良反应等现象依旧严重。
疫苗是控制感染性疾病最有效的方法，疫苗接种能够刺激机体产生不同于自然感染导致的特异性免疫应答，可以达到预防或治疗幽门螺杆菌感染的目的。1994年研究人员利用Hp细菌裂解物对小鼠进行黏膜免疫，结果发现80％以上的小鼠能够检测到免疫抗体，这进一步证实Hp疫苗是可行的，目前Hp疫苗研究主要集中包括尿素酶UreA或UreB、空泡毒素VacA等毒力因子而且大部分研究已有在许多动物模型上获得成功，随后针对幽门螺杆菌常见抗原的疫苗被越来越多的学者研究。虽然其中有些抗原蛋白能够产生一定的免疫保护作用，但目前仍存在保护率不高、重组表达效率低导致蛋白大量制备困难等问题。因此，筛选更多的新型且有效Hp疫苗候选抗原成为急需解决的问题。
甲基接受趋化蛋白MCP(Methyl～accepting chemotaxis protein)是一类跨膜受体蛋白，在细菌趋化性运动中起着信号转导的作用并参与精确调控细胞生理活性，赋予细菌生存的优势。在细菌中典型的MCP信号转导机制如下：当MCP胞外信号接受域与相应配体结合后，信号通过跨膜螺旋结构域与HAMP结构域传递给胞内信号输出域，然后胞内信号通过与下游CheA/CheW复合物发挥作用，从而影响其同源反应调节蛋白CheY的磷酸化水平，最后通过MCP～CheA/CheW～CheY～Flim该信号传导系统调节其鞭毛的运动，使得细菌趋利避害。
目前还未有研究报道Hp菌株的MCP蛋白是否可以作为特异性抗原引起机体免疫反应。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：目前Hp疫苗的研究主要集中在尿素酶UreA、UreB或空泡毒素VacA等毒力因子上，还未见有对MCP蛋白是否能作为疫苗抗原成分的研究。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP。所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1抗原MCP的氨基酸序列
MGKDSEITELKKEVNLYQSLLNLCLHEGFVGIKNNKVVFKSGNLASLNNLEEQSVHFKENAESVNLQGVSYSLKSQNIDGVQYFSLAKKTGGVGEYHKNDLFKTFCTSLKEGLENAQESMQYFHQETGLLLNAAKNGEAHSTEGLGTVNKTGQDIESLYEKMQNATSLADSLNQRSNEITQVISLIDDIAEQTNLLALNAAIEAARAGEHGRGFAVVADEVRKLAEKTQKATKEIAVVVKSMQQEANDIQTNTHDINSIVGSIKSDVEELKSTVKNNMIITSHKSCRLGKWYYEGAGKENFANTSGYRALESHHASVHAEANDLVKAVQEDHVTDSKYLEHKVHLMEDSAKHVKENILE。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP中，编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2抗原MCP的编码核苷酸序列
CCATGGGCAAAGACAGTGAGATCACTGAATTAAAGAAGGAGGTTAACCTTTATCAGTCTCTGCTGAATTTATGTCTTCATGAGGGGTTCGTGGGCATTAAGAACAATAAAGTCGTATTTAAGTCTGGAAATTTGGCCAGCTTGAATAATTTAGAGGAACAGTCTGTTCACTTCAAGGAGAATGCCGAAAGCGTTAATCTTCAGGGAGTATCATATTCATTGAAGAGTCAAAACATCGACGGGGTACAGTACTTCTCGCTGGCTAAGAAGACCGGCGGTGTGGGCGAATACCATAAGAACGATCTTTTCAAAACGTTTTGCACCTCCTTGAAAGAAGGCCTGGAAAACGCCCAGGAATCAATGCAATACTTCCATCAAGAAACGGGATTACTTCTTAATGCGGCCAAGAATGGGGAGGCCCACTCTACGGAGGGATTAGGAACTGTCAATAAGACAGGTCAAGACATCGAATCTTTGTATGAAAAGATGCAGAATGCTACTTCACTTGCTGATTCGCTTAACCAGCGCAGTAACGAGATTACTCAAGTTATCTCTTTAATTGATGACATTGCCGAGCAGACTAACCTGTTGGCGTTAAATGCCGCGATCGAAGCCGCTCGCGCGGGTGAGCACGGGCGTGGATTCGCTGTAGTCGCAGACGAGGTCCGCAAACTGGCAGAGAAAACCCAGAAAGCGACTAAGGAAATCGCAGTAGTCGTCAAGTCGATGCAACAGGAGGCTAACGATATTCAGACAAACACCCACGACATCAATAGCATCGTGGGATCGATCAAAAGTGACGTTGAGGAATTGAAATCGACTGTTAAGAATAACATGATTATCACGTCCCATAAAAGCTGCCGTTTGGGAAAGTGGTATTACGAGGGAGCCGGGAAAGAAAACTTTGCAAATACCTCAGGGTACCGCGCTCTTGAGTCTCATCACGCTAGCGTACACGCCGAGGCGAATGACCTTGTTAAAGCCGTCCAAGAGGATCATGTGACGGACTCCAAATATTTAGAGCATAAAGTCCACTTGATGGAAGATTCCGCTAAACACGTAAAAGAGAACATCCTCGAG。
本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP的制备方法，包括以下步骤：
a、质粒构建，原核表达
将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因链接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；
c、包涵体洗涤及溶解
将步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行离心，并进行重悬清洗，使用A液重悬洗涤后的包涵体，2～8℃溶解过夜；
d、Ni柱亲和纯化
经过步骤c溶解后的获得的上清液，使用A液平衡层析柱，使用B液梯度洗脱；
e、Q柱阴离子交换层析；
经步骤d纯化的目的蛋白，使用C液平衡Q层析柱，D液复性，E液洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤a所述的表达载体为pET28a；宿主菌为E.coli BL21(DE3)；表达条件为16～37℃，120～220rpm；诱导浓度为0.1～0.5mM IPTG。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤b中所述的破菌液为pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl；破菌条件为外循环温度-4℃～0℃、压力600～850bar、功率20～30％、4～6个循环；离心条件为2000～5000g，10～30min。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤c中所述的包涵体洗涤液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～1％ Triton X～100，1～5mM EDTA，0.1～0.5M NaCl。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤c中所述的离心条件为12000～17000rpm，离心15～30min。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤c所述的A液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl和10～50mM咪唑，6～8M尿素。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤d中所述的Ni亲和填料为Ni Sepharose High Performance(cytiva，货号：17526802)；所述B液组成为pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl和0.5～1M咪唑，6～8M尿素。
其中，上述幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法中，步骤e中所述的Q柱阴离子交换层析柱填料为Q Sepharose High performance(cytiva，货号：17101401)；所述C液组成为：pH 6.0～8.0的10～30mM PB，0～10mM NaCl，6～8M尿素；所述D液组成为pH 6.0～8.0的10～30mM PB，0～10mM NaCl，0.1～0.6％精氨酸；所述E液组成为pH 6.0～8.0的10～30mM PB，0.5～1M NaCl，0.1～0.6％精氨酸。
本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP在预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
进一步的，所述的药物为疫苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过对Hp全基因序列中截取与其抗原决定簇有关的序列进行表达纯化，获得调控鞭毛运动中重要的蛋白MCP的氨基酸序列，并对该氨基酸序列进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，将其导入载体重组表达后，得到大肠杆菌表达的基因工程重组幽门螺杆菌抗原蛋白。
进一步的，本发明采用特别的蛋白纯化方法，从表达的重组单位基因工程蛋白MCP的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于95％，通过氨基酸序列预测本发明构建获得的蛋白MCP分子质量约为40.5KD，等电点在8.59左右。
并验证发现该重组蛋白能够有效刺激体液免疫应答，血清抗体IgG显著提高，也能有效刺激黏膜免疫应答，产生较高的抗体sIgA，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果，可以作为预防幽门螺杆菌感染的抗原成分使用，后续用来制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。
附图说明
图1所示为重组质粒MCP/pET28a双酶切鉴定结果；M：Takara DL5000 DNAMarker；1：质粒MCP/pET28a；2：MCP/pET28a双酶切；鉴定结果显示分离片段约为5300bp和1100bp。
图2所示为MCP蛋白诱导鉴定结果；1：全菌液；2：破菌上清；3：破菌沉淀；M：ThermoScientific Protein Ruler；鉴定结果显示MCP蛋白约为40.5KD，沉淀表达。
图3所示为NI亲和层析电泳结果；1：溶解后沉淀；2：上样；3：流穿；4：5％B～1；5：5％B～2；6：10％B；7：20％B；8：30％B；M：Vazyme protein marker MP102。
图4所示为Q柱层析电泳结果；1：上样；2：流穿；M：Vazyme protein marker MP102；3：30％E～1；4：30％E～2；5：50％E。
图5所示为制备的LTs63k SDS～PAGE电泳结果，1：上样，2：流穿，3～5：目的蛋白洗脱，M：Vazyme protein marker MP102。
图6所示为血清特异性抗体IgG Elisa检测情况，***P<0.001。
图7所示为阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测情况，***P<0.001。
具体实施方式
本发明通过对Hp中调控鞭毛运动中重要的蛋白MCP结构及空间定位分析，结合“反向疫苗学”技术，筛选出氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的MCP蛋白。并对表达该蛋白的密码子进行了优化，获得了核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的编码基因。本发明的编码基因是根据宿主菌株BL21(DE3)的常用密码子把编码氨基酸的核苷酸序列进行优化，使得基因序列更容易在我们选择的宿主菌中表达。因此，本发明的重组载体在转化工程菌后可以进行大规模表达，经过纯化后获得重组蛋白，可用于制备基因工程亚单位疫苗。该重组蛋白具有制备工艺简单、成本低、可操作性强等优点，有望成为Hp基因工程疫苗候选抗原之一。
本发明通过对参与调节鞭毛运动的膜蛋白进行Hp疫苗候选抗原，对于Hp在胃内定植等十分重要，为筛选提供了更多的选择，也丰富了Hp疫苗候选抗原的种类和功能，对于Hp疫苗的开发具有深远的影响。
本发明成功构建了包含MCP蛋白的重组载体，并进行了高效的表达，表达的蛋白正确折叠且稳定，又通过采用Ni柱层析和Q柱层析结合的纯化方式，获得了纯度很高的目的蛋白。
本发明的MCP蛋白为包涵体表达，本发明通过离心来获取重组蛋白，此时沉淀还包含了破碎的细菌菌体残留的一些成分包括膜蛋白，脂类，核酸等，为了去除杂质，本发明特别的筛选得到适宜纯化包涵体的包涵体洗涤液，组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～1％Triton X～100，1～5mM EDTA，0.1～0.5M NaCl。同时，采用包涵体洗涤液和破菌液交替清洗的方式，能让由于离心聚集在一起的包涵体被清洗干净，纯化效果更好。本发明纯化过程工艺简单，成本低，纯化后的蛋白状态稳定，并且还能在动物实验中激起免疫反应，产生免疫保护作用，为幽门螺杆菌疫苗的开发提供了很好的理论支持。
特别的，根据本发明特定序列的重组蛋白，本发明根据蛋白的等电点不同、分子量大小，重组表达蛋白是否可溶还是包涵体等因素，调整了纯化参数，以适应本发明的重组蛋白获得更好的纯化效果。
最终，本发明制备重组蛋白的纯化方法中，从表达的重组亚单位基因工程蛋白MCP的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于95％，通过氨基酸序列预测本发明构建获得的蛋白MCP分子质量约为40.5KD，等电点在8.59左右。
本发明所述的纯化方法主要有Ni亲和纯化、Q柱阴离子交换层析，通过上述方法纯化的蛋白用15％ SDS-PAGE检测，呈单一目标蛋白条带，分子质量约为40.5KD。蛋白纯度为95％。纯化后的蛋白MCP与佐剂磷酸铝共同注射免疫Balb/C小鼠，结果发现蛋白MCP加免疫佐剂组血清中抗体IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)P<0.01；蛋白MCP与LTs63k佐剂滴鼻免疫Balb/c小鼠后可显著提高抗体sIgA效价，诱导产生黏膜免疫应答。这证明使用本发明纯化方法获得的抗原蛋白MCP可有效刺激机体产生较高的免疫应答，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所使用幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori ATCC700824购自美国菌种保藏中心；质粒pET28a购自Thermo Fisher公司，申请人保存；大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、T4DNA Ligase、蛋白Marker为Thermo Fisher产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒及超薄回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。
实施例1MCP基因的重组质粒pET28a/MCP的构建及鉴定
具体的操作步骤如下：
(1)根据幽门螺杆菌全基因组序列，应用反向疫苗学理论使用生物信息学技术筛选出了候选抗原MCP。该MCP是通过天然Hp全基因组序列并利用生信的方法预测出的含抗原决定簇等的蛋白，且具有免疫原性和特异性等特点。
(2)根据MCP的氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:1(下划线所示为酶切位点碱基序列)。
(3)对目的基因进行合成，通过Nco I和Xho I酶切位点，插入表达质粒pET28a中(武汉金开瑞生物工程有限公司完成)，质粒测序结果与提交合成的序列信息比对，核苷酸序列完全相同。
(4)将合成质粒用40μL无菌水溶解，取2μL转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃热休克90sec，迅速冰浴3min。加入1mL SOC培养基，混匀，置37℃摇床中220rpm振荡45min。
(5)取100μL菌液涂布于Kana抗性LB平板，置37℃培养箱中培养16h。
(6)pET28a/MCP/BL21(DE3)阳性重组质粒的筛选、鉴定：
a.挑取转化平板上分隔良好的单个菌落，接种于Kana抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
b.质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
c.质粒DNA进行Nco I和Xho I双酶切，双酶切反应体系如下表1，37℃酶切2h；
d.1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图1所示，表明基因重组质粒构建成功。
表1双酶切反应体系
试剂 体积μL
10×K Buffer 1
0.1％BSA 1
Xho I 0.4
Nco I 0.4
质粒 2
Water,nuclease-free Up to 10
实施例2重组蛋白MCP在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
具体的操作步骤如下：
(1)取过夜培养的pET28a/MCP/BL21(DE3)菌液100μL加入10mL卡那霉素+抗性的LB培养基中，220rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液200μL加入20mL卡那霉素+抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2h，二次活化至OD600为0.8时，加入IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷10μL，使其终浓度为0.5mM，再置于摇床220rpm 37℃诱导表达4h。
(2)将诱导表达后的菌液取出，以8000g离心15min，弃去上清，加入3mL破菌液(50mM磷酸盐缓冲液(PB)，0.1M NaCl，pH 7.0)混匀，冰浴超声裂解10min(超声5s，停止6s)，再4℃12000g离心30min，分离上清及沉淀。
(3)处理样品：在沉淀中加入3mL破菌液重悬，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL 5X蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，100℃10min，12000g离心3min。
(4)SDS-PAGE电泳：将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μL上样，进行15％的SDS-PAGE电泳。电泳结束后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，再置于脱色液中脱色，凝胶扫描成像系统(ChemiDoc MP，Bio-Rad)扫描。结果表明，pET28a/MCP/BL21(DE3)目的蛋白大小正确，为沉淀包涵体表达(如图2所示)。
实施例3MCP抗原的制备
具体的操作步骤如下：
(1)放大培养获取重组蛋白
取过夜培养的pET28a/MCP/BL21(DE3)菌液30mL加入3L Kana+抗性的TB培养基中，220rpm 37℃培养3h，培养至OD600为0.8～1.0时，加入1M IPTG 1.5mL，使其终浓度为0.5mM，220rpm 37℃诱导表达4h。将诱导后的菌液，8000g离心15min收集菌体，再加入160mL破菌液(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行高压均质破碎：外循环温度-4℃、压力650bar、功率25％、6个循环。12000g离心30min，取沉淀。
(2)重组蛋白MCP纯化
a、包涵体的洗涤及溶解
取上述沉淀，加入200mL包涵体洗涤液(50mM PB，1％ Triton X-100，1mM EDTA，0.1MNaCl，pH 7.0)洗涤1次，洗涤条件为：振荡、彻底分散重悬，12000rpm离心15min，弃上清，再向沉淀中加入200mL破菌液洗涤液洗涤1次，洗涤条件为：振荡、彻底分散重悬，12000rpm离心15min，弃上清；
重复此步骤3次，洗涤完成后向沉淀中加入200mL A液(50mM PB，0.15M NaCl，8M尿素，10mM咪唑，pH 7.0)室温搅拌溶解1h，4℃放置溶解过夜。
b、Ni柱亲和层析
取上述溶解液上清，12000rpm离心15min，取上清，过0.45μm滤膜备用。使用A液平衡Ni柱亲和层析柱，取过滤后上清液上样，再使用5％ B液(50mM PB，0.15M NaCl，8M尿素，1M咪唑，pH 7.0)+95％A液洗脱目的蛋白，电泳结果如图3所示。
c、Q柱阴离子交换层析
取(b)中洗脱的蛋白30mL加入C液(20mM PB，8M尿素，10mM NaCl，0.6％精氨酸，pH8.0)稀释至300mL备用。用C液平衡Q层析柱，取稀释液上样，C液冲洗平衡，再使用D液复性(20mM PB，0.6％精氨酸，10mM NaCl，pH 8.0)，再使用50％E液(20mM PB，1M NaCl，0.6％精氨酸，pH 8.0)+50％D液洗脱目的蛋白保存4℃备用。电泳结果如图4所示，获得了纯度大于95％的目的蛋白。
实施例4动物免疫
(1)抗原MCP与磷酸铝佐剂联合免疫小鼠
Balb/c小鼠，雌性，8～10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物分组如下表2所示：
表2MCP与磷酸铝佐剂联合免疫小鼠分组
a、首次免疫，50μg抗原和磷酸铝佐剂混合后，4℃吸附30min，小鼠双侧大腿肌肉注射(100μL/鼠)；
b、第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
c、第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
d、第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上。
(2)抗原MCP与LTs63k佐剂联合滴鼻免疫小鼠
Balb/c小鼠，雌性，8～10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63k自制(制备方法如文献：冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003)，制备结果如图5所示，动物分组如下表3所示。
表3MCP与LTs63k佐剂联合免疫小鼠分组
a、首次免疫，50μg抗原和LTs63k佐剂混合后，混匀仪4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔小鼠：10μL/侧，共20μL/鼠；
b、第二次免疫，第14天进行二次免疫，免疫剂量与免疫方式同上；
c、第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，免疫剂量与免疫方式同上；
d、第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，免疫剂量与免疫方式同上。
实施例5血清特异性抗体IgG与阴道灌洗液抗体sIgA检测
(1)抗原MCP与磷酸铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgG Elisa检测
第四次免疫后5天，采集Balb/c小鼠眼眶静脉血，4℃静置3h后3000rpm离心5min分离血清，用Elisa检测MCP特异性IgG水平变化。
a、抗原包被：取包被液将MCP纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
c、标本稀释：将血清从1:16000开始进行系列倍比稀释至1:256000。
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：D110087～0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween～20。e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na2HPO4 100mM。f中终止液为2M H2SO4。
结果显示：检测MCP蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:256000；MCP免疫小鼠对重组MCP的抗体IgG几何平均滴度为1:115697.65；免疫后抗体阳性率达到100％，如表4和图6所示，说明MCP重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
表4IgG几何平均滴度
(2)抗原MCP与LTs63k佐剂联合滴鼻免疫小鼠后阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测
第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集Balb/c小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，300μL/鼠。采集后涡旋1min，然后12000g离心3min取上清液用于Elisa检测MCP特异性sIgA水平变化。
a、抗原包被：取包被液将MCP纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
c、标本稀释：将灌洗液样本从1:16开始进行系列倍比稀释至1:256。
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释灌洗液样本，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween～20。e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween～20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na2HPO4 100mM。f中终止液为2M H2SO4。
结果：检测MCP重组蛋白抗原免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:256；免疫小鼠对重组MCP的几何平均滴度为1:132.5，如表3所示；免疫后抗体阳性率达到100％，如表5和图7所示，表明MCP重组蛋白可诱导小鼠产生黏膜免疫应答。
表5MCP免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度
实施例6MCP重组蛋白免疫后攻毒保护力评价
具体的操作步骤如下：
(1)小鼠灌胃：在末次滴鼻免疫后10天进行口服灌胃H.pylori ATCC700824进行攻毒实验，灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×107CFU，灌胃后2h恢复水食。
(2)平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠取其胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋3min，然后将其洗涤原液与10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B0.2mg/mL)的Skirrow平板上(月示蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)、pH7.4)，37℃微需氧(5％O2、10％CO2、85％N2)培养3d后观察。
(3)结合Hp菌落特征，快速尿素酶试剂以及镜检等方式来检测平板上是否存在Hp，以此来确定小鼠是否成功感染Hp，统计Hp感染阳性率与其保护率。其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率-免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率×100％。
结果：对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如下表，对照组20只小鼠平板培养检测均为阳性，感染率为90％，实验组小鼠20只小鼠中有11只小鼠平板培养阳性，感染率为55％，那么本疫苗的保护效率为38.9％。
因此，本发明制备的MCP抗原具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能一定程度抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植，如下表6所示。
表6小鼠免疫后攻毒Hp感染阳性率统计
小鼠编号 对照组 实验组 小鼠编号 对照组 实验组
1 + － 11 + +
2 + － 12 + －
3 + + 13 － －
4 + － 14 + +
5 + + 15 + +
6 + － 16 + －
7 + + 17 + +
8 － + 18 + －
9 + － 19 + +
10 + + 20 + +
注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“－”表示为快速尿素酶试剂与镜检为阴性。

Claims (10)

1.幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP，其特征在于：编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1或2所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、质粒构建，原核表达
将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因链接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；
c、包涵体洗涤及溶解
将步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行离心，并进行重悬清洗，使用A液重悬洗涤后的包涵体，2～8℃溶解过夜；
d、Ni柱亲和纯化
经过步骤c溶解后的获得的上清液，使用A液平衡层析柱，使用B液梯度洗脱；
e、Q柱阴离子交换层析；
经步骤d纯化的目的蛋白，使用C液平衡Q层析柱，D液复性，E液洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法，其特征在于：步骤a所述的表达载体为pET28a；宿主菌为E.coli BL21(DE3)；表达条件为16～37℃，120～220rpm；诱导浓度为0.1～0.5mM IPTG。
5.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法，其特征在于：步骤b中所述的破菌液为pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl；破菌条件为外循环温度-4℃～0℃、压力600～850bar、功率20～30％、4～6个循环；离心条件为2000～5000g，10～30min。
6.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法，其特征在于：步骤c中所述的包涵体洗涤液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～1％Triton X～100，1～5mM EDTA，0.1～0.5M NaCl。
7.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法，其特征在于：步骤c中所述的离心条件为12000～17000rpm，离心15～30min；所述A液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl和10～50mM咪唑，6～8M尿素。
8.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法，其特征在于：步骤d中所述的Ni亲和填料为Ni Sepharose High Performance(cytiva，货号：17526802)；所述B液组成为pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl和0.5～1M咪唑，6～8M尿素。
9.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗抗原MCP的制备方法，其特征在于：步骤e中所述的Q柱阴离子交换层析柱填料为Q Sepharose Highperformance(cytiva，货号：17101401)；所述C液组成为：pH 6.0～8.0的10～30mM PB，0～10mM NaCl，6～8M尿素；所述D液组成为pH 6.0～8.0的10～30mM PB，0～10mM NaCl，0.1～0.6％精氨酸；所述E液组成为pH 6.0～8.0的10～30mM PB，0.5～1M NaCl，0.1～0.6％精氨酸。
10.权利要求1或2所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原MCP在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
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