CN116949118B - 一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然色素技术领域，具体涉及一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物及其制备方法。具体技术方案为：将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，与酰基供体加入到干燥后的反应介质中，连续搅拌至完全溶解后，加入脂肪酶，再加入

Description

一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物及其制备方法
技术领域
本发明涉及天然色素技术领域，具体涉及一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物及其制备方法。
背景技术
花色苷是一种黄酮类多酚化合物，是天然的水溶性色素。花色苷是花青素与糖通过糖苷键形成的类黄酮类化合物，花青素又称糖苷配基，基本结构为2-苯基-苯并吡喃，自然条件下游离状态的花青素极少见，一般与各种糖基结合以花色苷的形式存在。目前已知的花色苷种类已有700余种，食品中最常见的花青素有6大类，即矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、牵牛素、芍药素和锦葵素。花色苷是一种优良的天然抗氧化剂和自由基消除剂，具有增强视力、延缓脑神经衰老、降低血糖和血脂、抗肿瘤、抗过敏等多种功能，广泛应用于食品、染料、医药、化妆品等方面。
但花色苷作为离子型化合物，亲水性强，油溶性差的特点限制了它在亲脂体系中的应用。由于其油溶性低，在体内消化时，不易透过磷脂双分子层被细胞吸收，导致生物利用度低；花色苷对外界环境如pH、光、温度和氧气等敏感，极易降解，也大大限制了花色苷在食品中的应用。采用脂肪酸对花色苷进行酰化可以大大提高花色苷的油溶性，改善其稳定性，克服以上应用难点。但目前对花色苷酰化均采用饱和脂肪酸作为酰基供体，而油酸属于单不饱和脂肪酸，其营养价值优于饱和脂肪酸。研究表明，饱和脂肪酸摄入过多会同时升高低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)，多不饱和脂肪酸虽可降低血清胆固醇和LDL，同时也降低HDL。而摄入单不饱和脂肪酸，如油酸，能降低血清胆固醇和LDL，并且HDL无变化，将其用于花色苷脂肪酸酰化必然具有更佳的健康意义与应用前景。
现有提高花色苷亲脂性能的方法，例如文献《Enzymatic synthesis,structuralcharacterization and antioxidant capacity assessment of a new lipophilicmalvidin-3-glucoside–oleic acid conjugate》，该文献开发了一种新型亲脂性锦葵色素-3-葡萄糖苷-油酸结合物的酶促合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在装有活化的分子筛(100g/L)的试管中，加入锦葵色素-3-葡萄糖苷提取物(9.47μmol)和无水2-甲基-2-丁醇(2.5mL)。在这个溶液中，加入脂肪酸(100个当量)。反应从加入脂肪酶(20g/L)开始。在60℃的氩气气氛下搅拌反应48h。反应开始后，分别采用ESI-MS和HPLC-DAD检测。(2)通过分子筛和脂肪酶的过滤和真空溶剂蒸发停止反应。残渣在酸化甲醇中重新溶解，用庚烷提取部分杂质。蒸发甲醇馏分，加入乙酸乙酯和水，从原料中分离出锦葵色素-3-葡萄糖苷-油酸酯。乙酸乙酯蒸发后，将残渣溶解在85％的甲醇/水中，采用半制备HPLC法分离锦葵色素-3-葡萄糖苷-油酸偶联物。然后用TSK Toyopearl HW-40(S)凝胶(300mm×16mm内径)进行柱层析纯化化合物。在真空下除去甲醇，并在室温下避光。产物冻干，在氩气气氛下-18℃保存。
该方法的缺点是：①酰化效率低，转化率仅能达到21.2％。不饱和脂肪酸含有不稳定的双键结构，易被氧化，存在反应不稳定、产率低、反应副产物多、分离纯化困难等缺点，难于实现实际应用和产业化生产。②反应原料为高纯度花色苷，底物需要经过凝胶柱纯化，对提取和纯化工艺有诸多要求，设备要求高且效率较低，生产成本高，难以实现工业化生产，工业化前景欠佳。③虽然酰化花色苷具有一定生物活性，但作为一种新型化合物，对于其实际应用仍缺乏安全性和应用性能等方面的数据支撑。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物及其制备方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法，将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，与酰基供体加入到干燥后的反应介质中，连续搅拌至完全溶解后，加入脂肪酶，再加入分子筛吸收反应过程中产生的水，并将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在800～1500r/min转速搅拌和40～60℃氮气气氛条件下，反应12～84h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析提纯进行分离、干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
优选的，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：30～70mL，所述黑豆皮花色苷与酰基供体的摩尔比为1～15：1，所述助溶剂与反应介质的体积比为1：5～10。
优选的，所述脂肪酶在反应体系中的浓度为10～100mg/mL，分子筛的浓度为50～100mg/mL。
优选的，所述黑豆皮花色苷的主要成分为矢车菊素-3-O-葡萄糖，所述助溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，所述反应介质为叔丁醇或叔戊醇，所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸。
优选的，所述抽滤除酶的步骤为：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，抽滤除去酶和分子筛，收集滤液，减压蒸馏除去反应介质。
优选的，所述液液萃取的步骤为：
a.取经过滤后浓缩的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：1～2；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8～10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：3～8，转移至分液漏斗中；
d.静置3～5min，两相分离后，收集酸性甲醇相，重复3～5次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
优选的，所述正相硅胶柱层析的步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱；
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂溶解上样；
c.洗脱：上样后依次加入不同体积的洗脱溶剂进行洗脱；
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物。
优选的，所述洗脱溶剂为二氯甲烷、甲醇和甲酸。
优选的，步骤c中，洗脱溶剂依次加入的体积比为二氯甲烷:甲醇:甲酸＝20：1：1、18：1：1、17：1：1、15：1：1。
相应的，上述的制备方法制备得到的油酸黑豆皮花色苷酰化产物。
本发明具备以下有益效果：
1.本发明利用脂肪酶修饰黑豆皮中花色苷(矢车菊素-3-O-葡萄糖)的方法，提高了花色苷的亲脂性、稳定性和抗氧化活性。
不饱和脂肪酸酰化反应存在酰化效率低，酰化过程中容易发生氧化，反应原料多为高纯度花色苷，提取难度大，生产成本高等诸多问题，本发明首次将不饱和脂肪酸油酸作为酰基供体，实现采用低纯度花色苷提取物为原料进行酰基化反应，对花色苷底物纯度要求低(>35％)。反应利用氮气作为保护气体，抑制油酸的氧化，通过筛选合适的反应溶剂和条件，反应转化率大大提高，开发出高效制备不饱和脂肪酸与花色苷的酰化产物的方法对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷进行改性，制备出矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化物，且直接采用黑豆皮粗提物进行酶法酰化反应，不用事先纯化底物，减少花色素底物纯化步骤，大大节约了生产成本和时间。结合简单的液液萃取、硅胶柱层析，产物易于分离纯化，并成功提高花色苷的亲脂性、稳定性和抗氧化活性。
2.本发明中，采用液液萃取，硅胶柱层析，实现产物的简单分离纯化，易于实现工业化生产，产品纯度满足大部分工业需求；在此基础上，本发明通过改变花色苷的结构提高了花色苷的溶解性能，使其油溶性大大提升，同时改善了其稳定性和抗氧化性。目前，天然产物主要采用微胶囊法包埋，避免外界环境因素对其稳定性造成影响，常用的壁材如阿拉伯胶、麦芽糊精等均溶于水，而食品大部分均含有水体系，这就会对微胶囊壁材造成损伤，从而影响其包埋效果。而本发明从花色苷结构入手，通过改变其相关空间结构来提高其稳定性，延缓花色苷在不同条件下的降解，利用本发明方法获得的矢车菊素-3-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-葡萄糖苷相比，在不同pH(1，3，5，7，11)、不同温度(65、80、90℃)和不同光照(光照、黑暗)条件下的稳定性均大幅提高，因此酰化矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的稳定性进一步提高。同时，本发明方法获得的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-O-葡萄糖苷相比，抗氧化能力得到进一步提升，DPPH自由基清除能力提高25％，FRAP还原能力提高10％，β-胡萝卜素漂白能提高了1.18倍。
附图说明
图1为实施例3得到的油酸黑豆皮花色苷酰化产物的液相色谱图；
图2为本发明方法获得的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-葡萄糖苷的正辛醇/水分配系数图；
图3为本发明方法获得的矢车菊素-3-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-葡萄糖苷的DPPH自由基清除、铁离子还原和β-胡萝卜素漂白能力测定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明公开了一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法，具体步骤为：利用分子筛将反应介质干燥，再将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解(助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜)，与酰基供体按照1～15：1的摩尔比加入到干燥后的反应介质中(其中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：30～70mL，所述助溶剂与反应介质的体积比为1：5～10)，连续搅拌至完全溶解后，加入脂肪酶(脂肪酶可为来源于Candida Antarctica的固定化脂肪酶)，使脂肪酶在溶液中浓度为10～100mg/mL，再加入浓度为50～100mg/mL的/>分子筛吸收反应过程中产生的水，并连接氮气球，采用气体置换装置，将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在800～1500r/min转速搅拌和40～60℃氮气气氛条件下，反应12～84h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析提纯进行分离、干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物，即矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物(C3G-OA)。
其中，所述黑豆皮花色苷的主要成分为矢车菊素-3-O-葡萄糖(C3G)，所述助溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)，所述反应介质为叔丁醇或叔戊醇，所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸，需要氮气保护进行反应。所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于35％。
进一步的，所述抽滤除酶的步骤为：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，抽滤除去酶和分子筛，收集滤液，减压蒸馏除去反应介质，剩余液体中主要成分为未能旋干的助溶剂，以及酰化产物和一些杂质。
进一步的，所述液液萃取的步骤为：
a、取经过滤后浓缩的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：1～2；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8～10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：3～8，转移至分液漏斗中；
d.静置3～5min，两相分离后，收集酸性甲醇相，重复3～5次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
进一步的，所述正相硅胶柱层析的步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱；
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂溶解上样，所述起始溶剂为二氯甲烷、甲醇和甲酸，体积比为20：1：1。
c.洗脱：上样后依次加入〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝18：1：1〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝17：1：1〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝15：1：1〕的洗脱溶剂进行洗脱；
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物。
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法如下：
1.利用分子筛将反应介质干燥，将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，黑豆皮花色苷与酰基供体按照1：1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：70mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为10mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的/>分子筛吸收反应过程中产生的水，并连接氮气球，采用气体置换装置，将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在800r/min转速搅拌和60℃氮气气氛条件下，反应72h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液。
其中，所述反应介质为叔戊醇，助溶剂为DMSO(二甲基亚砜)；所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸，需要氮气保护进行反应；所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于35％。所述助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜，助溶剂的用量与反应介质的体积比为1：8。
2.所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析分离提纯，干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
其中，所述抽滤除酶的具体步骤如下：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，反应原液抽滤除去酶和分子筛，收集滤液。减压蒸馏除去叔戊醇，剩余液体中主要成分为未能旋干的助溶剂，以及酰化产物和一些杂质。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取经过前处理的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：1；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：3，转移至分液漏斗中；
d.静置5min两相分离后，收集酸性甲醇相，重复3次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
所述正相硅胶柱层析的具体步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱。
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1〕溶解上样。
c.洗脱：上样后依次加入〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1(2.2L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝18：1：1(1L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝17：1：1(950mL)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝15：1：1(850mL)〕的洗脱溶剂进行洗脱。
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物，所得产品即为油酸黑豆皮花色苷油酸酰化产物。酰化率为21.9％。
实施例2
黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法如下：
1.利用分子筛将反应介质干燥，将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，黑豆皮花色苷与酰基供体按照1：5的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：30mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为50mg/mL，最后加入浓度为50mg/mL的/>分子筛吸收反应过程中产生的水，并连接氮气球，采用气体置换装置，将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在1500r/min转速搅拌和40℃氮气气氛条件下，反应84h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液。
其中，所述反应介质为叔丁醇，助溶剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)；所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸，需要氮气保护进行反应；所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于35％。所述助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜，助溶剂的用量与反应介质的体积比为1：5。
2.所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析，半制备液相分离提纯进行分离，干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
其中，所述抽滤除酶的具体步骤如下：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，反应原液抽滤除去酶和分子筛，收集滤液。减压蒸馏除去叔丁醇，剩余液体中主要成分为未能旋干的助溶剂，以及酰化产物和一些杂质。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取经过前处理的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：2；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：8，转移至分液漏斗中；
d.静置3min两相分离后，收集酸性甲醇相，重复5次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
所述正相硅胶柱层析的具体步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱。
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1〕溶解上样。
c.洗脱：上样后依次加入〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1(2.2L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝18：1：1(1L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝17：1：1(950mL)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝15：1：1(850mL)〕的洗脱溶剂进行洗脱。
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物，所得产品即为油酸黑豆皮花色苷油酸酰化产物。酰化率为28.3％。
实施例3
黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法如下：
1.利用分子筛将反应介质干燥，将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，黑豆皮花色苷与酰基供体按照1：10的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：50mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为100mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的/>分子筛吸收反应过程中产生的水，并连接氮气球，采用气体置换装置，将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在1200r/min转速搅拌和60℃氮气气氛条件下，反应72h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液。
其中，所述反应介质为叔丁醇，助溶剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)；所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸，需要氮气保护进行反应；所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于35％。所述助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜，助溶剂的用量与反应介质的体积比为1：10。
2.所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析，半制备液相分离提纯进行分离，干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
其中，所述抽滤除酶的具体步骤如下：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，反应原液抽滤除去酶和分子筛，收集滤液。减压蒸馏除去叔丁醇，剩余液体中主要成分为未能旋干的助溶剂，以及酰化产物和一些杂质。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取经过前处理的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：1；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复9次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：5，转移至分液漏斗中；
d.静置5min两相分离后，收集酸性甲醇相，重复5次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
所述正相硅胶柱层析的具体步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱。
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1〕溶解上样。
c.洗脱：上样后依次加入〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1(2.2L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝18：1：1(1L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝17：1：1(950mL)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝15：1：1(850mL)〕的洗脱溶剂进行洗脱。
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物，所得产品即为油酸黑豆皮花色苷油酸酰化产物。酰化率为54.3％。
实施例3得到的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物的液相色谱图如图1所示，可见，其保留时间为32.56min，峰面积为13463965mAU·min，峰面积归一化处理得520nm下面积％为96.56％。
实施例4
黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法如下：
1.利用分子筛将反应介质干燥，将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，黑豆皮花色苷与酰基供体按照1：15的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：40mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为70mg/mL，最后加入浓度为70mg/mL的/>分子筛吸收反应过程中产生的水，并连接氮气球，采用气体置换装置，将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在1000r/min转速搅拌和50℃氮气气氛条件下，反应48h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液。
其中，所述反应介质为叔丁醇，助溶剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)；所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸，需要氮气保护进行反应；所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于35％。所述助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜，助溶剂的用量与反应介质的体积比为1：7。
2.所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析，半制备液相分离提纯进行分离，干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
其中，所述抽滤除酶的具体步骤如下：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，反应原液抽滤除去酶和分子筛，收集滤液。减压蒸馏除去叔丁醇，剩余液体中主要成分为未能旋干的助溶剂，以及酰化产物和一些杂质。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取经过前处理的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：1；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：3，转移至分液漏斗中；
d.静置4min两相分离后，收集酸性甲醇相，重复4次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
所述正相硅胶柱层析的具体步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱。
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1〕溶解上样。
c.洗脱：上样后依次加入〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1(2.2L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝18：1：1(1L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝17：1：1(950mL)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝15：1：1(850mL)〕的洗脱溶剂进行洗脱。
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物，所得产品即为油酸黑豆皮花色苷油酸酰化产物。酰化率为29.8％。
实施例5
黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法如下：
1.利用分子筛将反应介质干燥，将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，黑豆皮花色苷与酰基供体按照1：10的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：60mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为80mg/mL，最后加入浓度为80mg/mL的/>分子筛吸收反应过程中产生的水，并连接氮气球，采用气体置换装置，将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在900r/min转速搅拌和60℃氮气气氛条件下，反应12h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液。
其中，所述反应介质为叔丁醇，助溶剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)；所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸，需要氮气保护进行反应；所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于35％。所述助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜，助溶剂的用量与反应介质的体积比为1：6。
2.所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析，半制备液相分离提纯进行分离，干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
其中，所述抽滤除酶的具体步骤如下：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，反应原液抽滤除去酶和分子筛，收集滤液。减压蒸馏除去叔丁醇，剩余液体中主要成分为未能旋干的助溶剂，以及酰化产物和一些杂质。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取经过前处理的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：2；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复9次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：7，转移至分液漏斗中；
d.静置5min两相分离后，收集酸性甲醇相，重复3次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
所述正相硅胶柱层析的具体步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱。
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1〕溶解上样。
c.洗脱：上样后依次加入〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝20：1：1(2.2L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝18：1：1(1L)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝17：1：1(950mL)〕、〔V(二氯甲烷):V(甲醇):V(甲酸)＝15：1：1(850mL)〕的洗脱溶剂进行洗脱。
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物，所得产品即为油酸黑豆皮花色苷油酸酰化产物。酰化率为38.0％。
实施例6
酰化产物的亲油性能通过测量正辛醇/水的分配系数(Log P)来确定。测定Log P前，将正辛醇和酸化水(2％ HCl)水在振荡器上振荡24h，使其相互饱和，静置分层后，用分液漏斗将两相分离，分别保存备用。将矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物(上述任意实施例制备的产物都可以)溶解于预饱和正辛醇中，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷溶解于预饱和酸化水中，浓度均为0.4mg/mL。然后，在矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物(C3G-OA)和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)溶液中分别加入等体积的预饱和酸化水和预饱和正辛醇，涡旋1h，2000×g离心10分钟。分别取上层溶液和下层溶液，经0.22μm尼龙滤膜过滤，采用HPLC-DAD分析，在520nm处记录化合物的吸光度。用相应标准品的校准曲线计算各化合物的浓度。采用以下公式计算Log P值：
式中：Cn-o指正辛醇中物质的平衡浓度，Cw指水相中物质的平衡浓度。
结果如图2所示。
实施例7
DPPH自由基清除实验：取制备的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物(1000μM)溶于DMSO中，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为对照，分别取30μL，与270μL含60μM 2,2-二苯基-1-苦酰基肼(DPPH)的甲醇溶液混合，25℃下反应30min，在515nm处检测吸光度值，以Trolox的校准曲线进行计算，抗氧化活性用Trolox当量(μM)表示。
铁离子还原能力(FRAP)测定实验：取上述实施例制备的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(1000μM)样品溶液30μL，加入270μL FRAP试剂充分混合，37℃下反应4min，在593nm处测定吸光度值，校准曲线与DPPH测定中使用的曲线相同，还原能力用Trolox当量(μM)表示。
β-胡萝卜素漂白实验：将β-胡萝卜素(0.1mg/mL)溶于4mL氯仿中，与40mg亚油酸和400mg吐温-40混合，于40℃下通过旋转蒸发去除氯仿，加入100mL去离子水，剧烈震摇形成β-胡萝卜素-亚油酸悬浮液。在96孔板中，每孔加入25μL溶于DMSO的花色苷或其酰化产物和225μLβ-胡萝卜素溶液。以DMSO作为空白对照组，在50℃下处理0和90min，于450nm下读取吸光度值，计算脂质过氧化抑制率。
结果如图3所示。
实施例8
1.颜色稳定性是将酰化花色苷作为着色剂使用的关键标准。将矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分别置于不同的pH条件(1、3、5、7和11)下，不同温度(65、80、90℃)和光照(光照、黑暗)条件下，通过测定样品在520nm处的吸光度来评价其颜色稳定性。
2.将矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-油酸酰化产物和矢车菊素-3-O-葡萄糖溶解在0.1M的SDS溶液(含20％甲醇)中(1mM浓度)。用NaOH和HCl将溶液的pH调整为1、3、5、7和11，以确定酰化花色苷的pH稳定性。
3.样品分别在65℃、80℃和90℃的水浴中加热，进行热稳定性评价。
4.光稳定性评价过程中，将样品分别置于室温下的黑暗环境和光照环境(距离光源20cm)中。每2小时取样品等份(200μL)，置于96孔板中，用酶标仪在520nm处测量其吸光度值。并对样品进行了热降解动力学分析。速率常数(k)和半衰期(t1/2)由方程计算，以分析C3G与C3G-OA的颜色稳定性。
活化能(Ea)使用Arrhenius方程估算：
其中R是通用气体常数(8.314J·mol–1·K–1)，k0是频率因子，T是绝对温度(K)。
结果见表1、表2所示，表1和表2为本发明方法获得的矢车菊素-3-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-葡萄糖苷在不同pH、温度、光照条件下的稳定性比较结果。
表1结果显示，通过测定样品在520nm处的吸光度值，评估花色苷和酰化花色苷的颜色稳定性。虽然在不同pH(1，3，5，7，11)，不同温度(65℃、80℃和90℃)条件的加热过程中，花色苷及其酰化产物都有不同程度的降解，且半衰期(t1/2)和反应速率常数(k)值表明，C3G和C3G-OA的热稳定性随着温度升高而降低。但在各选定温度下，本发明方法制备的C3G-OA的半衰期均高于C3G的半衰期，C3G-OA的降解活化能(Ea)均高于C3G的Ea值，表明花色苷经油酸酰化后热稳定性得到明显改善，与天然花色苷相比，经油酸修饰后的花色苷的褪色率降低，稳定性得到显著提升。
表2显示，花色苷和酰化花色苷在不同pH下的光稳定性：在不同的pH值(1、3、5、7和11)下考察C3G和C3G-OA对光的耐受性。样品普遍在黑暗避光的条件下比光照条件下拥有更高的半衰期，说明光照会明显影响花色苷和酰化花色苷的颜色稳定性。不同pH条件下的半衰期(t1/2)和反应速率常数(k)均显示，C3G-OA的光稳定性要明显强于C3G，说明油酸酰化促进了花色苷的稳定性。
表1 C3G和C3G-OA的热降解参数
注：括号内为线性回归拟合度。
表2 C3G和C3G-OA的光降解参数
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以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种黑豆皮花色苷油酸酰化产物的制备方法，其特征在于：将黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，与酰基供体加入到干燥后的反应介质中，连续搅拌至完全溶解后，加入Novozym435脂肪酶，再加入4Å分子筛吸收反应过程中产生的水，并将反应容器内的气体氛围置换为氮气，在800～1500r/min转速搅拌和40～60℃氮气气氛条件下，反应12～84h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；反应原液经过抽滤除酶、液液萃取和正相硅胶柱层析提纯进行分离、干燥，即可得到紫褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷油酸酰化产物；
所述酰基供体为不饱和脂肪酸油酸；
所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为3g：30～70mL，所述黑豆皮花色苷与酰基供体的摩尔比为1～15：1，所述助溶剂与反应介质的体积比为1：5～10；
所述Novozym 435脂肪酶在反应体系中的浓度为10～100mg/mL，4Å分子筛的浓度为50～100mg/mL；
所述黑豆皮花色苷的主要成分为矢车菊素-3-O-葡萄糖，所述助溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，所述反应介质为叔丁醇或叔戊醇。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述抽滤除酶的步骤为：取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，抽滤除去酶和分子筛，收集滤液，减压蒸馏除去反应介质。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述液液萃取的步骤为：
a.取经过滤后浓缩的黑豆皮花色苷反应浓缩液，加入乙酸乙酯溶液和饱和氯化钠溶液，用量体积比为1：1～2；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8～10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明，将乙酸乙酯相收集，旋干；
c.将残渣在酸性甲醇中重新溶解，用庚烷作第二次萃取，加入酸性甲醇溶液和庚烷溶液，用量体积比为2：3～8，转移至分液漏斗中；
d.静置3～5min，两相分离后，收集酸性甲醇相，重复3～5次，直至庚烷与酸性甲醇相两相分界处无明显的白色絮状杂质沉淀，将甲醇相收集合并，减压蒸馏除去有机溶剂，收集粉末。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述正相硅胶柱层析的步骤如下：
a.装柱：用选定的二氯甲烷、甲醇与甲酸体积比为20：1：1的混合溶剂作为起始溶剂，预装好体积为200mL的正相层析硅胶柱；
b.将萃取收集的粉末用2mL起始溶剂溶解上样；
c.洗脱：上样后依次加入不同体积的洗脱溶剂进行洗脱；
d.收集：将深红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶剂，收集产物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述洗脱溶剂为二氯甲烷、甲醇和甲酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤c中，洗脱溶剂依次加入的体积比为二氯甲烷:甲醇:甲酸＝20：1：1、18：1：1、17：1：1、15：1：1。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的黑豆皮花色苷油酸酰化产物。
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