CN111304265B - 一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法 - Google Patents

一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法，属于天然色素技术领域，该方法利用
Figure DDA0002391385810000011
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂溶解后，按照1‑15:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，连续搅拌至完全溶解，加入脂肪酶，最后加入
Figure DDA0002391385810000012
分子筛吸收反应过程中产生的水，反应得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。本发明利用酶法修饰花色苷的方法，显著提高了花色苷的油溶性，水溶性花色苷经本方法酰化后可溶于油相，扩展了天然花色苷的应用范围；同时提高了花色苷的稳定性，提高了花色苷修饰后的纯化效率。

Description

一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法
技术领域
本发明涉及天然色素技术领域，特别是涉及一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法。
背景技术
花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属于类黄酮化合物，是植物的主要呈色物质，也是一种优良的天然抗氧化剂和自由基消除剂，具有增强视力、延缓脑神经衰老、降低血糖和血脂、抗肿瘤、抗过敏等多种功能，广泛应用于食品、染料、医药、化妆品等方面。花青素种类繁多，目前已知的有20种，自然状态下的花青素往往以糖苷形式存在，并常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。此外，花色苷中的糖苷基和羟基还可与一个或几个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸通过酯键形成酰基化的花色苷。
黑豆为豆科植物大豆(学名：Glycine max(L.)merr.)的黑色种子，具有重要的药用和营养价值，其黑豆皮富含花色苷。黑豆皮提取得到的一种天然花色苷，与其他种类的花色苷相似，黑豆皮花色苷主要以矢车菊素-3-葡萄糖苷为基本结构。从化学结构来看，花色苷具有缺少电子的特性，易于受到活性氧基团或自由电子的攻击，然而正是由于其化学结构的特性，使花色苷具有较大的不稳定性且易发生降解作用，从而影响其抗氧化性能，使其应用受到极大限制。其次，花色苷属于离子型化合物，不溶于非极性溶剂，如油中，极大地限制了其在食品、药品、化妆品等产业中的应用。因此，必须设法改善其缺陷，以提高花色苷的抗氧化性能和溶解性。
现有提高花色苷抗氧化性能的方法，例如申请号为CN201510098767.7、名称为“一种蓝莓花青素抗氧化性能增强方法”的发明专利，该专利公开了一种蓝莓花青素抗氧化性能增强方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)酚酸试剂制备：将无水酚酸、乙酸酐、吡啶按照摩尔比为1：(1-6)：(1-6)进行混合，并在氮气存在的常温环境中采用50-70r/min的搅拌速度进行搅拌处理20-30min，获得乙酰化的酚酸；再将乙酰化的酚酸和无水氯化亚砜按照摩尔比为1：(1-5)进行混合，并在氮气存在的30-100℃的温度下采用搅拌速度为80-100r/min搅拌反应1-24h，再采用非质子溶剂重结晶处理，获得乙酰化的酚酸酰氯；再将乙酰化的酚酸酰氯与丙酮相溶，丙酮的量为乙酰化的酚酸酰氯的1-1.5倍的重量，并将其搅拌混合均匀后，再将其置于冰浴中，并向其中采用50-80r/min的搅拌速度边搅拌边滴加氢氧化钠溶液，并持续搅拌3-5h，调节pH值为7-9，获得酚酸试剂；(2)蓝莓花青素改性处理：在氮气保护下，将步骤1)获得的酚酸试剂与蓝莓花青素按照摩尔比为1：(3-10)加入到二氧六环中，同时缓慢滴加摩尔比为(3-10)的三乙胺，搅拌速度为70-80r/min，在30-60℃下搅拌反应2-12h，对其进行减压蒸出二氧六环和三乙胺，再向其中加入盐酸调整pH值为1-4，并将其依次进行过滤、水洗、真空干燥，即可得到改性蓝莓花青素。
该方法的缺点是：①通过化学法改性蓝莓花色苷，无法控制反应位点，反应过程中可能会消耗花色苷的酚羟基，而花色苷中起抗氧化作用的主要为其中的酚羟基，酚羟基的消耗会使花色苷的抗氧化性能受到影响；②对蓝莓花色苷进行酰化改性仅仅是通过酰化后的空间位阻使花色苷不易受到水的攻击，难以向查尔酮和无色假碱结构转化，从而提高其抗氧化性能，其并没有从影响花色苷抗氧化性能的原理入手，因而酰化改性仅是通过提高花色苷的稳定性，并不能显著提高其抗氧化性能；③酰化过程中的酚酸试剂中使用的水杨酸或尼泊金酸或原儿茶酸或焦儿茶酸或龙胆酸或没食子酸或对香豆酸或咖啡酸本身就是一种抗氧化剂，其使用会增加工艺的成本；此外，酚酸试剂的制备工艺步骤较繁琐复杂，不利于工业化生产。
本发明在前期的实验中发现，将黑豆皮花色苷的主要单体(C3G)，以化学或者生物酶为催化剂，在非水环境中与酰基供体产生酰基化反应，得到的衍生物具有溶解于油相基质的特征，且对金属离子、温度、光线的稳定性显著提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法，
利用
Figure BDA0002391385790000031
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂预溶后，按照1-15:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为100mg：1-10mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为5-100mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure BDA0002391385790000032
分子筛吸收反应过程中产生的水，在10-80r/min转速搅拌和50-90℃的条件下，反应20-80h，得到黑豆皮花色苷反应原液；
所述反应介质为叔丁醇或丙酮或叔戊醇或正丁醇中的一种；
所述酰基供体为脂肪酸；
所述黑豆皮花色苷为粉末，其中花色苷矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)纯度大于35％；
所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
进一步地，所述助溶剂为DMF或DMSO，所述助溶剂的用量为能溶解花色苷的最少量为宜，助溶剂用量与黑豆皮花色苷质量比为1：100-800(v:w)。
进一步地，所述酰基供体为饱和脂肪酸，所述反应介质为叔丁醇。
进一步地，所述前处理的具体步骤如下：
取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，过滤除酶，将滤液中反应介质及乙酸乙酯旋干，未旋干的体积为助溶剂的体积。
进一步地，所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取经过前处理的黑豆皮花色苷反应浓缩液，按反应前黑豆皮花色苷质量加入0.5-10％体积的饱和NaCl和饱和NaHCO3溶液，1-30％乙酸乙酯溶液，分液萃取；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干。
进一步地，所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：根据酰化反应前黑豆皮花色苷纯度，取含有0.2-3g反应前黑豆皮花色苷当量的经萃取浓缩的酰化反应物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.按步骤d-g依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
本发明还提供一种上述的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法制备的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用Novozym 435酶修饰花色苷C3G的方法，提高了花色苷的稳定性(修饰后的花色苷C3G的稳定性提高50％以上)，提高了花色苷修饰后的纯化效率(纯度为97％以上)。
化学修饰反应条件难以控制，反应产物复杂，后期分离纯化困难；本发明利用Novozym 435酶修饰花色苷矢车菊素-3-葡萄糖苷，酶法修饰由于其高度专一性、安全性、高效性、反应条件温和及便于控制等优点，且酶法修饰产物较单一，结合简单的液液萃取、硅胶柱层析，产物易于分离纯化。将黑豆皮花色苷的(C3G)，以Novozym 435酶为催化剂，在非水环境中与脂肪酸发生酰基化反应，得到的衍生物酰化矢车菊素-3-O-葡萄糖苷)的油溶性和稳定性均显著提高。
本发明中，采用液液萃取，硅胶柱层析，最大程度保证花色苷不被破坏；在此基础上，在维持花色苷原有活性基本不变(脂肪酸酰化发生在糖苷上，不消耗花色苷自身的酚羟基)的情况下，通过改变花色苷的结构来提高其稳定性，油溶性大大提升。目前，天然产物主要采用微胶囊法包埋，避免外界环境因素对其稳定性造成影响，常用的壁材如阿拉伯胶、麦芽糊精等均溶于水，而食品大部分均含有水体系，这就会对微胶囊壁材造成损伤，从而影响其包埋效果。而本发明从花色苷结构入手，通过改变其相关空间结构来提高其稳定性，延缓花色苷在不同条件下的降解，利用本发明方法获得的矢车菊素-3-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-葡萄糖苷相比，在常温、光照等条件下的稳定性提高了约50％以上，因此酰化矢车菊素-3-葡萄糖苷的稳定性进一步提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2得到的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的液相色谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
本发明实施例所用材料如下：
Figure BDA0002391385790000071
Figure BDA0002391385790000081
本发明实施例所用的黑豆皮花色苷可为商购得到，也可按照常规方法自制。
实施例1
油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法如下：
利用
Figure BDA0002391385790000082
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂预溶，按照1:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为100mg：9mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为10mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure BDA0002391385790000083
分子筛吸收反应过程中产生的水，在20r/min和55℃的条件下，反应48h，得到黑豆皮花色苷反应原液；
反应介质为叔丁醇；酰基供体为十二烷酸；助溶剂为DMSO，助溶剂的用量为花色苷质量的1：500。
所述黑豆皮花色苷为粉末，C3G纯度大于95％；
所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
所述前处理的具体步骤如下：
取出黑豆皮花色苷酰化反应原液，过滤除酶，将滤液中反应介质及乙酸乙酯旋干，未旋干的体积为助溶剂的体积。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取含有200mg反应前黑豆皮花色苷当量的经过前处理的反应原液，加入饱和20mL NaCl和饱和20mL NaHCO3溶液，50mL乙酸乙酯溶液，分液；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干。
所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：取含有200mg反应前黑豆皮花色苷当量的花色苷酰化产物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物，酰化率14.661％。
实施例2
油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法如下：
利用
Figure BDA0002391385790000091
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂预溶，按照10:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为200mg：3mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为80mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure BDA0002391385790000101
分子筛吸收反应过程中产生的水，在30r/min和60℃的条件下，反应65h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；
反应介质为叔丁醇；酰基供体为月桂酸；助溶剂为DMF，助溶剂的用量为花色苷质量的1：800。
所述黑豆皮花色苷为粉末，C3G纯度大于35％；
所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
所述前处理的具体步骤如下：
取出黑豆皮花色苷反应原液，过滤除酶，将滤液中反应介质及乙酸乙酯旋干，未旋干的体积为助溶剂的体积。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取含有3g反应前黑豆皮花色苷当量的经过前处理的反应原液，加入饱和20mLNaCl和饱和20mL NaHCO3溶液，50mL乙酸乙酯溶液，分液；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干。
所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：取含有3g反应前黑豆皮花色苷当量的花色苷酰化产物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物，酰化率66.586％。
实施例2得到的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的液相色谱图如图1所示，可见，其保留时间为41.711min，峰面积为6647784mAU·min，面积％为97.580。
实施例3
油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法如下：
利用
Figure BDA0002391385790000112
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂预溶，按照13:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为100mg：9mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为30mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure BDA0002391385790000111
分子筛吸收反应过程中产生的水，在70r/min和65℃的条件下，反应60h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；
反应介质为叔丁醇；酰基供体为月桂酸；助溶剂为DMF，助溶剂的用量为花色苷质量的1：200。
所述黑豆皮花色苷为粉末，纯度大于95％；
所述黑豆皮花色苷反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
所述前处理的具体步骤如下：
取出黑豆皮花色苷反应原液，过滤除酶，将滤液中反应介质及乙酸乙酯旋干，未旋干的体积为助溶剂的体积。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取含有200mg反应前黑豆皮花色苷当量的经过前处理的反应原液，加入饱和20mL NaCl和饱和20mL NaHCO3溶液，50mL乙酸乙酯溶液，分液萃取；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干。
所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：取含有200mg反应前黑豆皮花色苷当量的花色苷酰化产物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物，酰化率75.685％。
实施例4
油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法如下：
利用
Figure BDA0002391385790000131
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂预溶，按照15:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为100mg：9mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为50mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure BDA0002391385790000132
分子筛吸收反应过程中产生的水，在80r/min和50℃的条件下，反应80h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；
反应介质为叔丁醇；酰基供体为月桂酸；助溶剂为DMF，助溶剂的用量为花色苷质量的1/100。
所述黑豆皮花色苷为粉末，C3G纯度大于98％；
所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
所述前处理的具体步骤如下：
取出黑豆皮花色苷反应原液，过滤除酶，将滤液中反应介质及乙酸乙酯旋干，未旋干的体积为助溶剂的体积。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取含有200mg反应前黑豆皮花色苷当量的经过前处理的反应原液，加入饱和20mL NaCl和饱和20mL NaHCO3溶液，50mL乙酸乙酯溶液，分液萃取；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干。
所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：取含有200mg反应前黑豆皮花色苷当量的花色苷酰化产物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物，酰化率84.879％。
实施例5
油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法如下：
利用
Figure BDA0002391385790000151
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂预溶，按照5:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为100mg：6mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为40mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure BDA0002391385790000152
分子筛吸收反应过程中产生的水，在10r/min和70℃的条件下，反应60h，得到黑豆皮花色苷反应原液；
反应介质为叔戊醇；酰基供体为棕榈酸；助溶剂为DMSO，助溶剂的用量为酰基供体质量的1/300。
所述黑豆皮花色苷为粉末，C3G纯度大于35％；
所述黑豆皮花色苷反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
所述前处理的具体步骤如下：
取出黑豆皮花色苷反应原液，过滤除酶，将滤液中反应介质及乙酸乙酯旋干，未旋干的体积为助溶剂的体积。
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取含有2g反应前黑豆皮花色苷当量的经过前处理的反应原液，加入饱和20mLNaCl和饱和20mL NaHCO3溶液，50mL乙酸乙酯溶液，分液萃取；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干。
所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：取含有2g反应前黑豆皮花色苷当量的花色苷酰化产物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种油溶性黑豆皮花色苷酰化产物的制备方法，其特征在于，
利用
Figure FDA0002819430130000011
分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和黑豆皮花色苷用助溶剂溶解，按照10:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，所述黑豆皮花色苷与反应介质的固液比为200mg：3mL，连续搅拌至完全溶解，加入Novozym 435脂肪酶，使Novozym 435脂肪酶在溶液中浓度为80mg/mL，最后加入浓度为100mg/mL的
Figure FDA0002819430130000012
分子筛吸收反应过程中产生的水，在30r/min转速搅拌和60℃的条件下，反应65h，得到黑豆皮花色苷酰化反应原液；
所述反应介质为叔丁醇；
所述酰基供体为月桂酸；
所述黑豆皮花色苷为粉末，C3G纯度大于35％；
所述助溶剂为二甲基甲酰胺，助溶剂的用量为花色苷质量的1：800；
所述黑豆皮花色苷酰化反应原液经过前处理，然后通过液液萃取和层析进行分离，干燥，即可得到棕褐色粉末状的油溶性黑豆皮花色苷酰化产物；
所述液液萃取的具体步骤如下：
a.取含有3g反应前黑豆皮花色苷当量的经过前处理的反应原液，加入饱和20mL NaCl和饱和20mL NaHCO3溶液，50mL乙酸乙酯溶液，分液萃取；
b.采用乙酸乙酯反复萃取，重复8-10次，直至乙酸乙酯相颜色接近透明；
c.将乙酸乙酯相收集，旋干；
所述层析的具体步骤如下：
a.装硅胶柱：取150mL硅胶粉，加200mL二氯甲烷，搅拌，装入玻璃柱中；
b.上样：取含有3g反应前黑豆皮花色苷当量的花色苷酰化产物，加入1mL的洗脱剂，超声使其完全溶解，上样；
c.按步骤d-g依次加入洗脱溶剂；
d.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝20:1:1 420mL；
e.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15:1:1 340mL；
f.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝13:1:1 560mL，洗脱至粉色带洗出；
g.加入二氯甲烷：甲醇：甲酸＝10:1:1 200mL，将深色色带洗出(目标产物色带)；
h.将步骤g收集的洗脱溶剂旋干，收集粉末产品，即为油溶性黑豆皮花色苷酰化产物。
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