CN109081798A

CN109081798A - 一种高纯胆红素的制备方法

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Publication number: CN109081798A
Application number: CN201811055512.2A
Authority: CN
Inventors: 李国兵; 全灿; 刘兰云; 张旭斌; 蔡旺锋
Original assignee: Tianjin University; National Institute of Metrology
Current assignee: Tianjin University; National Institute of Metrology
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2038-09-11
Also published as: CN109081798B

Abstract

本发明提供一种胆红素纯化方法，包括：将市售胆红素原料经过如下精制步骤：(1)分级溶解、(2)液液萃取、和(3)溶剂结晶等步骤，最后制备得到所述胆红素高纯物质。本发明方法步骤简单、操作安全，可以制备出99.5％以上(胆红素IIIα和XIIIα之和不超过5％)高纯度的胆红素。

Description

一种高纯胆红素的制备方法

技术领域

本发明涉及胆红素纯化领域，进一步地说，是涉及一种采用分级溶解、液液萃取以及溶析结晶方法进行精制纯化，制备高纯胆红素的方法。

背景技术

胆红素Bilirubin(C₃₃H₃₆N₄O₆，分子质量584.65)是人类胆汁中的主要色素之一，来源于体内铁卟啉化合物的主要代谢产物。胆红素为金黄色或深红色单斜晶体，无臭无味，不溶于水，溶于苯、氯仿及二硫化碳等有机溶剂。胆红素具有毒性，可对大脑和神经系统造成不可逆的损害；同时胆红素又具有抗氧化剂功能，可以抑制亚油酸和磷脂的氧化。在临床检测中，胆红素水平是判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。此外，胆红素是合成中成药人工牛黄的主要成分，对乙型脑炎病毒和W256癌细胞具有强抑制功效。

根据胆红素在体内存在的形式可以分为：(1)α胆红素(游离胆红素/非结合胆红素)：它通过与血清蛋白结合通过血循环运输到肝脏，其结合过程可逆。由于该胆红素不溶于水，不能从肾小球滤出，且具有毒性，其含量增加会导致胆红素脑病以及核黄疸症状，α胆红素(Bu)含量是新生儿生理性黄疸的最好指标；(2)β胆红素(一元葡糖甘酸胆红素)：胆红素的两个丙酸侧链中的一个丙酸与一个葡糖酸醛以酯键相连的产物，其水溶性相比α胆红素有所增加，有利于胆红素排泄；(3)γ胆红素(二元葡糖甘酸胆红素)：胆红素的两个丙酸侧链分别与两个葡糖酸醛以酯键相连的产物，其水溶性很大，通常将β胆红素和γ胆红素统称为结合胆红素(Bc)，其含量是肠道梗阻解除后的最敏感指标；(4)δ胆红素：结合胆红素在血液循环中与白蛋白作用，白蛋白缓慢的置换了原葡萄糖醛酸酯而形成的胆红素存在形式，一般只在长期的高结合胆红素血症患者的血液内检测得到。健康人的结合胆红素只存在肠道中，而血清中只有非结合胆红素而不含结合胆红素。

胆红素的提取过程一般是以动物胆汁作为原料，通过一系列步骤提取纯化获得。目前主要的提取纯化工艺包括：

(1)钙盐法：将胆汁中的胆红素与碱土金属的氢氧化物反应生成不溶性胆红素钙盐，将钙盐分离后通过酸化、醇析、水洗和溶剂萃取和蒸发后，最终获得所需产品。

(2)改进的钙盐-氯仿提取法：将胆汁中的胆红素与碱土金属的氢氧化物反应生成不溶性胆红素钙盐，将钙盐分离后通过酸化、氯仿提取、蒸发氯仿、醇洗、冷冻结晶和干燥后，最终获得所需产品。

(3)离子交换树脂法：将动物胆汁过滤后用氢氧化钠调节pH值，然后通过离子交换树脂吸附、用稀硫酸亚硫酸氢钠溶液对吸附柱洗涤和调节pH值至1，先用75％和95％乙醇洗脱吸附柱中的胆酸、然后用氯仿将吸附柱中的胆红素洗脱，将氯仿洗脱液蒸馏至干，所得产品用无水乙醇洗涤和蒸馏、残液结晶和干燥，得到最终产品。

(4)直接萃取法：胆汁过滤后加热至50-50℃，用4％NaOH溶液调节pH值至11-12，然后继续加热至98-100℃沸腾3min后降温至20-30℃，加入氯仿进行萃取，用盐酸和亚硫酸氢钠调节pH值至3-4，得到胆红素萃取液。萃取液在温度<80℃下进行溶剂抽提、溶剂洗涤和干燥，得到最终产品。

(5)胆绿素还原法：首先从猪肾中分离得到胆绿素还原酶，然后用市售的胆绿素在胆绿素还原酶和抗氧剂的作用下还原得到胆绿素，获得胆红素产品。

通过上述方法获得的胆红素产品纯度在90％以内，且其为三种异构体(胆红素IIIα、IXα、XIIIα)含量总和。其中胆红素IXα为血红素代谢的天然产物，胆红素IIIα和XIIIα为胆红素IXα的提取精制过程中的异构化反应产物。三者的结构式如下：

在胆红素的精制提纯过程中，胆红素的异构化反应速度与程度受到溶剂种类，光照强度、含氧量等因素的影响，最终所得产品中胆红素IIIα和XIIIα异构体含量达到20～30％，胆红素IXα的含量为60～70％。国内的胆红素产品质量是以总胆红素含量(三种异构体总和)为质量标准；而国外公司的胆红素产品单独将胆红素IXα的含量作为重要质量指标，一般要求异构体IIIα和XIIIα的含量不超过10％。因此有必要对胆红素的纯化精制分离过程进行研究，提高胆红素的纯度，降低异构体IIIα和XIIIα的含量。

发明内容

为了解决以上现有技术中存在的问题，本发明提出了一种胆红素纯化制备方法，采用本发明的制备方法能够获得纯度高达99.5％以上(胆红素IIIα和XIIIα的含量之和不超过5％)的胆红素。

本发明的目的是提供一种高纯胆红素的制备方法，包括以下步骤：

将胆红素经过(1)分级溶解、(2)液液萃取、和(3)溶析结晶步骤，得到所述高纯胆红素。

优选地，本发明的制备方法包括以下步骤：

(1)将胆红素加入到溶剂中，加热回流溶解后降温至常温，过滤分别得到滤饼和滤液，然后将滤饼加入到溶剂中，重复上述过程3～5次，然后过滤、真空干燥，其中回流溶解过程中需要进行避光隔绝氧气。

所述步骤(1)中，使用的溶剂可选择本领域常用的溶剂，优选为氯仿、二氯甲烷、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-乙醇、氯仿-甲醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、氯仿-二氯甲烷等，更优选是氯仿-乙酸乙酯或二氯甲烷-乙酸乙酯。

所述的胆红素与所加入的溶剂重量比是1:50～1：500，优选为1:100～1：150，所述回流溶解时间为0.5～4h，优选为1～1.5h。

所述步骤(1)中回流溶解过程中需要进行避光隔绝氧气，可采用通常的避光隔绝氧气方法，优选方法如下：装有胆红素的玻璃容器用黑布覆盖，回流冷凝器出口用软管接入水封与大气隔绝，加热前用高纯氮气对系统进行置换吹扫10～30min。

(2)将步骤(1)得到胆红素晶体溶解到溶剂相(a)中，再加入与溶剂相(a)互不相溶的溶剂相(b)，剧烈搅拌混合，澄清分相，往分相后得到溶剂相(a)中再加入新鲜溶剂相(b)，继续搅拌混合，澄清分相，重复上述过程2～10次，优选4-6次，更优选3～5次；

当溶剂(a)与步骤(3)采用的溶剂不同时，需对最后澄清分相后得到的溶剂相(a)进行蒸发浓缩结晶以及真空干燥过程，具体为：将最后澄清分相后得到的溶剂相(a)进行旋转蒸发浓缩结晶，过滤得到胆红素晶体产品，再用溶剂(a)进行洗涤，真空干燥得到胆红素固体产品；

当溶剂(a)与步骤(3)采用的溶剂相同时，则可以省略以上所述的蒸发浓缩结晶以及真空干燥过程，将最后澄清分相后得到的溶剂相(a)进行蒸发浓缩即可。

所述步骤(2)液液萃取步骤，利用胆红素异构体在互不相溶的两相溶剂中溶解度差异实现纯化胆红素的目的。

步骤(2)中，所述溶剂(a)与胆红素重量比为(500～10000):1，优选为(1000～3000):1；所述溶剂(a)与溶剂(b)的体积比为(0.5～5):1，优选为(1～2):1；所述搅拌混合时间为5～60min，优选为10～30min。

所述溶剂(a)可使用强亲脂性溶剂，所述溶剂(b)可使用弱亲脂性溶剂。

所述步骤(2)使用的溶剂(a)优选为二氯甲烷、氯仿、二氯甲烷-氯仿、二氯甲烷-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯；溶剂(b)优选为水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮。

(3)将步骤(2)所得到胆红素固体产品溶解于溶剂中或者直接取用步骤(2)所得浓缩胆红素溶剂相(a)，在快速搅拌过程中缓慢滴加溶析剂，直至晶体完全析出，抽滤、干燥得到高纯胆红素。

所述步骤(3)溶析结晶步骤，利用胆红素IX-α和胆红素III-α及XIII-α在溶剂中的溶解度差异，实现脱除步骤(2)胆红素产品中胆红素III-α及XIII-α的目的。

步骤(3)中，胆红素与所述溶剂的重量比为1:(1000～10000)，优选为1:(1000～3000)；溶析剂与溶剂的体积比(0.2～5):1，优选为(0.5～1.5):1，更优选为(0.8～1.3):1；滴加溶析剂时间为30～300min，优选为90～150min。

所述步骤(3)使用的溶剂可选择本领域常用的溶剂，优选为二氯甲烷、氯仿、二氯甲烷-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯、二氯甲烷-二甲基亚砜(DMSO)、氯仿-二甲基亚砜溶液。所述溶析剂为甲醇、乙醇、乙醚、正己烷等。

所述步骤(1)～(3)中所使用的溶剂在使用之前需要进行脱氧处理，优选的脱氧方法如下：将溶剂在密封的容器中用高纯氮气鼓泡0.5～1h，然后密封保存。

所述步骤(1)～(3)中操作过程中均需要进行避光。

根据本发明，上述精制方法所使用的胆红素初产品可以依据现有技术已知的各种方法制备得到或者采用市售的胆红素作为精制原料。

采用本发明所述的方法获得的胆红素高纯物质的含量高于99.5％以上(胆红素IIIα和XIIIα之和不超过5％)，本制备方法简单，适合于规模制备，具有广泛的市场应用前景。

本发明的特点在于：

1、采用了多次分级溶解方法对胆红素进行纯化，利用溶剂对三种胆红素异构体溶解饱和度关系，使溶解到溶剂里的胆红素IIIα和XIIIα的相对含量高于固体中胆红素IIIα和XIIIα的相对含量，从而使得残留固体中胆红素IXα含量提高，达到纯化胆红素目的；

2、采用液液萃取方法对胆红素产品进行提纯，筛选出合适的溶剂体系，利用胆红素异构体在两相溶剂体系中的溶解度不同，实现胆红素IXα与胆红素IIIα和XIIIα之间的有效分离，使产品纯度进一步提高；

3、采用溶析结晶方法对胆红素产品进行纯化，将少量水溶性杂质以及胆红素IIIα和XIIIα进一步从胆红素产品中分离出去，产品纯度达到99.5％以上。

附图说明

图1示出了实施例1制备出的胆红素高纯物质的LC-MS谱图。

图2示出了实施例1制备出的胆红素高纯物质的液相色谱定值谱图，其中，1-胆红素IIIα，2-胆红素IXα，3-胆红素XIIIα。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。需要指出的是，以下是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1

一种胆红素高纯物质的制备方法，包括以下步骤：

a.分级溶解：称取1g市售的胆红素原料加入到250ml的圆底烧瓶中，加入100ml二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比1:1)，装上回流冷凝管，冷凝管出口用软管与水封连接便于隔绝空气，圆底烧瓶用黑布覆盖用于避光，加热前用高纯氮对系统吹扫20min置换出系统内空气。然后开始通冷却水并开启电热套加热至沸腾，回流加热60min后关闭电热套电源，待温度降至常温后过滤将溶剂倾析出来，往系统新加入100ml二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比1:1)，重复上述过程4次。分级溶解完毕后，过滤、真空干燥得到橙黄色固体0.85g。

经过液相色谱检测，胆红素纯度为99.57％(其中胆红素IXα含量为91.89％，胆红素IIIα含量为4.15％，胆红素XIIIα含量为3.53％)，其他杂质为不明组分(含量按峰面积之比换算)。

b.液液萃取：将步骤(a)获得的0.5g产品加入到1000ml重相氯仿-乙酸乙酯(体积比为1:1)中，超声溶解后转移到2000ml分液漏斗中，再加入500ml轻相甲醇-水溶液(体积比为1:1)进行液液萃取，摇晃10min后澄清分相。分相后保留原有重相在分液漏斗中，加入500ml新鲜轻相继续液液萃取过程。上述过程重复4次。将最后澄清分相后得到的重相进行蒸发浓缩至原来体积的3/4。

将所得重相取样经过液相色谱检测，胆红素纯度为99.66％(其中胆红素IXα含量为94.1％，胆红素IIIα含量为3.21％，胆红素XIIIα含量为2.35％)，其他杂质为不明组分(含量按峰面积之比换算)。

c.溶析结晶：取步骤(b)经过蒸发浓缩所得的重相，边搅拌边往溶液中缓慢滴加甲醇800ml，滴加溶析剂时间为120min，将含有胆红素晶体悬浮液过滤，滤饼用甲醇洗涤3次(每次体积用量为20ml)，将所得晶体进行真空干燥，获得橙黄色晶体产品0.38g。

上述步骤(a～c)操作过程中均需要进行避光。

经过液相色谱检测，胆红素纯度为99.85％(其中胆红素IXα含量为95.21％，胆红素IIIα含量为2.89％，胆红素XIIIα含量为1.75％)其他杂质为不明组分(含量按峰面积之比换算)。

将实施例1所得的胆红素产品用液相色谱进行定值分析(见图2)。从图中可以看出，采用实施例1的制备纯化方法获得了高纯胆红素。

对比例1没有经过分级溶解步骤

一种高纯胆红素的制备方法，包括以下步骤：

a.液液萃取：将0.5g市售胆红素加入到1000ml重相氯仿-乙酸乙酯(体积比为1:1)中，超声溶解后转移到2000ml分液漏斗中，再加入500ml轻相甲醇-水溶液(体积比为1:1)进行液液萃取，摇晃10min后澄清分相。分相后保留原有重相在分液漏斗中，加入500ml新鲜轻相继续液液萃取过程。上述过程重复4次。将所得重相取样经过液相色谱检测，胆红素纯度为99.36％(其中胆红素IXα含量为92.85％、胆红素IIIα含量为3.76％、胆红素XIIIα含量为2.75％)，其他杂质为不明组分(含量按峰面积之比换算)。

b.溶析结晶：将步骤(a)所得的重相进行蒸发浓缩至原来体积的3/4，边搅拌边往溶液中缓慢滴加甲醇800ml，将含有胆红素晶体悬浮液过滤，滤饼用甲醇洗涤3次(每次体积用量为20ml)，将所得晶体进行真空干燥，获得橙黄色晶体产品0.375g。经过液相色谱检测，胆红素纯度为99.57％(其中胆红素IXα含量为94.35％、胆红素IIIα含量为3.07％、胆红素XIIIα含量为2.15％)，其他杂质为不明组分(含量按峰面积之比换算)。

对比例2没有经过液液萃取步骤

将实施例1步骤(a)得到的0.4g胆红素产品加入到800ml氯仿-乙酸乙酯(体积比为1:1)中，超声溶解10min。待胆红素全部溶解后，边搅拌边往溶液中缓慢滴加甲醇800ml，将含有胆红素晶体悬浮液过滤，滤饼用甲醇洗涤3次(每次体积用量为20ml)，将所得晶体进行真空干燥，获得橙黄色晶体产品0.35g。经过液相色谱检测，胆红素纯度为99.81％(其中胆红素IXα含量为93.25％、胆红素IIIα含量为3.77％、胆红素XIIIα含量为2.79％)，其他杂质为不明组分(含量按峰面积之比换算)。

实施例2-6

制备方法步骤与实施例1基本相同，区别在于改变了步骤(a～c)的部分参数，具体参数变化见表1。

实施例所用溶剂在使用之前均进行了脱氧处理。

表1

其中实施例2-6中分级溶解过程加入的胆红素初产品量均为1g，液液萃取过程的初始原料量为0.5g。

实施例2-6中所得胆红素产品经过HPLC测定含量，表明采用实施例2-6的制备纯化方法获得了高纯胆红素。

上述实施例仅仅是本发明中的一些实例，但并不作为对本发明中的限定。

Claims

1.一种高纯胆红素的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

(1)将胆红素加入到溶剂中，加热回流溶解后降温至常温，过滤分别得到滤饼和滤液，然后将滤饼加入到溶剂中，重复上述过程3～5次，然后过滤、真空干燥，其中回流溶解过程中需要进行避光隔绝氧气；

(2)将步骤(1)得到胆红素晶体溶解到溶剂相(a)中，再加入与其互不相溶的溶剂相(b)，剧烈搅拌混合，澄清分相，往分相后得到溶剂相(a)中再加入新鲜溶剂相(b)，继续搅拌混合，澄清分相，重复上述过程2～10次，将最后澄清分相后得到的溶剂相(a)进行旋转蒸发浓缩结晶，过滤得到胆红素晶体产品，再用溶剂(a)进行洗涤，真空干燥得到胆红素固体产品；

或者将最后澄清分相后得到的溶剂相(a)进行蒸发浓缩；

(3)将步骤(2)所得到胆红素固体产品溶解于溶剂中或者直接取用步骤(2)所得浓缩胆红素溶剂相(a)，在快速搅拌过程中缓慢滴加溶析剂，直至晶体完全析出，抽滤、干燥得到高纯胆红素；

所述步骤(1)～(3)中所使用的溶剂在使用之前需要进行脱氧处理。

3.根据权利要求1或2所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，胆红素与溶剂重量比是1:50～1：500，所述回流溶解时间为0.5～4h。

4.根据权利要求1或2所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述溶剂选自氯仿、二氯甲烷、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-乙醇、氯仿-甲醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、氯仿-二氯甲烷。

5.根据权利要求1或2所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中，所述溶剂(a)与胆红素重量比为(500～10000):1，所述溶剂(a)与溶剂(b)的体积比为(0.5～5):1，所述搅拌混合时间为5～60min，萃取次数为4～6次。

6.根据权利要求5所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中，所述溶剂(a)与胆红素重量比为(1000～3000):1，所述溶剂(a)与溶剂(b)的体积比为(1～2):1，所述搅拌混合时间为10～30min。

7.根据权利要求1或2所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中，所述溶剂(a)选自二氯甲烷、氯仿、二氯甲烷-氯仿、二氯甲烷-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯；溶剂(b)选自水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮。

8.根据权利要求1或2所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中，胆红素与所述溶剂的重量比为1:(1000～10000)，溶析剂与溶剂的体积比(0.2～5):1，滴加溶析剂时间为30～300min。

9.根据权利要求8所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中，胆红素与所述溶剂的重量比为1:(1000～3000)，溶析剂与溶剂的体积比(0.5～1.5):1，滴加溶析剂时间为90～150min。

10.根据权利要求1或2所述的高纯胆红素的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中，所述溶剂选自二氯甲烷、氯仿、二氯甲烷-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯、二氯甲烷-二甲基亚砜、氯仿-二甲基亚砜，溶析剂选自甲醇、乙醇、乙醚、正己烷中的至少一种。