CN116949092A - 一种转座子系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种转座子系统，包括突变性的转座酶，和/或含突变性ITR序列的转座子DNA。所述突变性的转座酶为BZ转座酶，其包含与SEQ ID NO：1相比具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，并且与SEQ ID NO：1相比具有一个或多个氨基酸置换突变。与氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型ZB转座酶相比，所述BZ转座酶具有提高的转座效率。所述突变性的ITR序列是在野生型的ITR序列上进行了突变，其与野生型ITR序列SEQ ID NO:11或12相比缺少CpG基序，不影响转座效率的基础上可以降低免疫原性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程化领域，具体涉及一种转座子系统及其应用。
背景技术
可转座遗传元件，也称为转座子，是可以在单细胞内从一个基因组位置移动到另一个基因组位置的DNA区段。转座子根据其转座机制可以被分为两大类：(1)对于被称为反转录转座子的元件，可以通过RNA中间体的反转录而发生转座，以及(2)对于DNA转座子，可以通过侧翼为末端反向重复序列(inverted terminal repeats，ITR)的DNA的直接转座而发生转座。活性转座子编码转座所需的一种或多种蛋白质，天然活性DNA转座子携带转座酶基因。转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中，并取得了很好的应用效果。
Tc1/Mariner转座子是自然界中分布最广泛的一类DNA转座子超家族，包括细菌、无脊柱动物和脊椎动物。在脊椎动物中，Tc1/Mariner转座子在硬骨鱼类中分布最为广泛。通过生物信息学和实验验证等手段，已报道15个具有天然转座活性的Tc1/Mariner超家族转座子成员，分别是Tc1、Tc3、Minos、Mos1、Bari3、Fot1、impala、Famar1、Osmar5、ISY100、Mboumar-9、Passport、Tana1、Thm3、SB、ZB转座子。
天然活性转座子可能造成基因组的不稳定，因此在进化中转座子会积累突变，逐渐降低乃至失去活性，例如在高等动物(如哺乳动物)中发现的Tc1/Mariner超家族转座子大部分由于转座酶开放阅读框中存在缺陷(如突变、移码、插入、缺失或存在终止密码子)而失去转座活性。鉴于上述原因，目前在临床基因治疗中应用的最广泛的睡美人(SleepingBeauty，SB)转座子、PiggyBac转座子往往都是经过生物信息学分子重构和/或工程化改造的高效突变型转座酶/转座子系统。
哺乳动物的先天免疫系统有能力识别并引导针对外来DNA的反应。触发这种反应的主要信号是微生物来源的DNA序列中的未甲基化CpG基序。这些基序在脊椎动物DNA中很少见，但在细菌和一些病毒DNA中却很丰富。由于基因治疗通常涉及从细菌来源的质粒或重组病毒中递送DNA，因此不可避免地会导致不同严重程度的急性炎症反应。例如阳离子脂质-DNA复合物组成的非病毒基因递送载体，反应最为严重，在较低剂量下产生副作用，在较高剂量下产生致死性。基因治疗中的质粒DNA(pDNA)如果含有非甲基化CG二核苷酸(CpG)，会引起靶向组织或细胞的炎症反应，降低转基因表达持续时间。即使在pDNA中保留单个CpG也足以引发炎症反应，而不含CpG的pDNA载体则不能。通过使用不含CpG的pDNA表达载体作为BZ转座子系统可以提高转座子整合基因的表达效率。本发明尝试消除或减少转座子质粒DNA载体中的TIR的CpG基序，减少CpG并提高非病毒载体安全性有效性。
本领域仍需更高效的转座酶/转座子系统。
发明内容
本发明涉及一种转座子系统，包括突变性的转座酶或含其编码序列的多核苷酸，和/或含末端反向重复序列的转座子DNA。本发明还涉及转座子系统在基因修饰中的用途。所述末端反向重复序列相比野生型末端反向重复序列含有或不含有突变。
本发明中突变性的转座酶为工程化的ZB转座酶，称为BZ转座酶。本发明的BZ转座酶或转座子系统比野生型ZB转座酶或ZB转座系统在整合效率和转基因表达量方面都有显著提高。本发明的BZ转座酶可以以病毒、质粒DNA、mRNA或蛋白等形式应用于稳定转染细胞、细胞系发育、基因组修饰、基因治疗、细胞治疗、转基因动物等方面。
在一些实施方案中，本发明的BZ转座酶，其包含与全长SEQ ID NO：1相比具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列，并且与SEQ ID NO：1相比具有一个或多个氨基酸置换突变。在一些实施方案中，与氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型ZB转座酶相比，所述BZ转座酶具有提高的转座效率。
在一个或多个实施方案中，所述BZ转座酶在其DNA结合和寡聚化域、DDE催化结构域或其组合中具有一个或多个氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的BZ转座酶，其包含与全长SEQ ID NO：1相比，在以下位置中的一个或多个位置上具有突变的氨基酸序列：5、21、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215、216、217、218、215-218、235和251，其中，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，所述BZ转座酶还在以下一个或多个位置上具有突变：79、120和208，其中，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。
在一些实施方案中，本发明提供的BZ转座酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性，并在以下位置中的一个或多个位置上具有突变的氨基酸序列：5、21、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215、216、217、218、215-218、235和251，其中，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，所述BZ转座酶还在以下一个或多个位置上具有突变：79、120和208，其中，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。
在一些实施方案中，所述各位置上的突变独立选自下表A所示的突变：
表A
| 位置(SEQ ID NO：1) | 野生型 | 突变后 |
| 5 | N | S、T或C |
| 21 | F | C、T、S、K、R或H |
| 35 | V | I、G、A、L或V |
| 38 | S | R、K或H |
| 56 | R | L、I、G、A或V |
| 61 | A | R、K或H |
| 71 | Q | R、K或H |
| 73 | I | L、I、G、A或V |
| 110 | H | R或K |
| 125 | N | L、I、G、A或V |
| 134 | K | R或H |
| 137 | K | T、S或C |
| 138 | Q | G、L、I、A或V |
| 144 | E | A、L、I、G或V |
| 186 | V | N或Q |
| 188 | F | Y |
| 189 | G | A、L、I或V |
| 204 | T | V、A、L、I或G |
| 215 | N | D、E |
| 216 | G | A、L、I或V |
| 217 | E | V、A、L、I或G |
| 218 | M | K、R或H |
| 215-218 | NGEM | DAVQ |
| 235 | K | R、K或H |
| 251 | K | T、S或C |
在一些实施方案中，所述79位、120位和208位上的突变独立选自下表B所示的取代突变：
表B
| 位置(SEQ ID NO：1) | 野生型 | 突变后 |
| 79 | Q | R、K或H |
| 120 | K | S、T或C |
| 208 | H | V、A、L、I或G |
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变包括天冬氨酸或谷氨酸突变为中性氨基酸或碱性氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸置换基于Tc1/Mariner转座子家族的保守性原则。
在一些实施方案中，本发明的BZ转座酶为在SEQ ID NO：1的以下的位置上具有所示突变的BZ转座酶：5S、21C、21K、35I、38R、56L、61R、71H、71R、73L、110K、110R、125L、134R、137T、138G、138K、144A、144E、186N、188Y、189A、204V、215-218DAVQ、216A、217V、218K、235R或251T，其中，数值表示突变的位置，数值后的字母表示突变后的氨基酸残基。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶至少在71位和110位上具有取代突变。在一些实施方案中，除第71位和第110位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、35、38、56、61、73、79、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、216、217、218、235、251、120和208的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，除第71位和第110位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、79、120、125、134、137、138、144、189、208、216和251的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶至少在71位、79位和110位上具有取代突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位和第110位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189、208、216和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、208、216和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第208位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189、216和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、216和251。在一些实施方案中，与SEQID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144和189；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138和144；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第138位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137和144；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位和第110位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、208、216和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、208、216和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位和第208位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、216和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、216和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144和189；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138和144；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144。在一些实施方案中，与SEQID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第138位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137和144；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144。优选地，所述71位上的取代突变为Q突变为R、K或H；所述79位上的取代突变为Q突变为R、K或H；所述110位上的取代突变为H突变为R或K。优选地，所述各位置上的取代突变分别选自表A和表B所示的取代突变。优选地，第22位上的突变为D突变为A、L、I、G或V。在一些实施方案中，上述各位置上的取代突变独立选自：5S、21K、22A、120S、125L、35I、56L、61R、71H、71R、73L、79R、94E、110K、110R、120G、120S、125L、125M、134R、137R、137T、138G、138K、138R、144A、144E、186N、188H、188Y、189A、204V、208V、216A、217A、217V、218K、235R和251T，其中，数值指代SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号，数值后的字母表示取代突变后的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的BZ转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下突变的BZ转座酶：
Q71R\H110R、
Q71R\Q79R\H110R、
G216A\Q71R\Q79R\H110R、
H208V\Q71R\Q79R\H110R、
H208V\G216A\Q71R\Q79R\H110R、
F21K\D22A\Q71R\H110R、
N005S\F21K/D22A\Q71R\Q79R\H110R、
K120S\N125L\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\G189A\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K137T\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\Q71R\H110R、
H208V\Q71R\H110R、
H208V\G216A\Q71R\H110R、
G216A\H208V\G189A\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K137T\Q71R\H110R、或
N005S\F21K/D22A\Q71R\H110R。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶至少在208位和216位上具有取代突变。在一些实施方案中，除第208位和第216位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、217、218、235、251、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，除第208位和第216位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、79、120、125、134、137、138、144、189和251的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第189位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第189位、216位、第208位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第138位、第189位、216位、第208位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144。优选地，所述各位置上的取代突变分别选自表A和表B所示的取代突变。优选地，第22位上的突变为D突变为A、L、I、G或V。在一个或多个实施方案中，BZ转座酶在上述任一方案中所述的位点的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27个位置具有突变。在一个或多个实施方案中，BZ转座酶在上述任一方案中所述的位点的至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27个位置具有突变。
在一些实施方案中，上述各位置上的取代突变独立选自：5S、21K、22A、120S、125L、35I、56L、61R、71H、71R、73L、79R、94E、110K、110R、120G、120S、125L、125M、134R、137R、137T、138G、138K、138R、144A、144E、186N、188H、188Y、189A、204V、208V、216A、217A、217V、218K、235R和251T，其中，数值指代SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号，数值后的字母表示取代突变后的氨基酸残基。在各种实施方案中，BZ转座酶可具有这些突变中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27个。在各种实施方案中，BZ转座酶可具有这些突变中的至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27个。
在一些实施方案中，本发明的BZ转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下突变的BZ转座酶：
G216A\H208V、
G216A\H208V\G189A、
G216A\H208V\K251T、
G216A\H208V\K251T\G189A、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E、或
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K137T。
在一些实施方案中，本发明的转座酶是一种融合转座酶，其包含本文任一实施方案所述的BZ转座酶与功能多肽，所述功能多肽优选为DNA序列特异性结合域和/或细胞核定位信号结构域(NLS)。
在一些实施方案中，所述DNA序列特异性结合域包含CRISPR/Cas结构域、TALE域、锌指域、AAV Rep DNA结合域或其任意组合。在一些实施方案中，所述细胞核定位信号结构域包括SV40 NLS、C-myc NLS、TAF1 NLS、TP53 NLS、STAT3 NLS或其任意组合。
在融合转座酶的一些实施方案中，所述BZ转座酶和所述DNA序列特异性结合域被连接体隔开。在一些实施方案中，所述连接体包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或至少50个氨基酸。在一些实施方案中，所述连接体的序列为(GGGS)n或A(EAAAK)nA，n为大于0的正整数，例如1、2、3、4或5；优选地，所述连接体的序列为GGGS。
在一个或多个实施方案中，所述转座子的DNA序列包括两端含有末端反向重复序列的基因表达元件。所述末端反向重复序列是野生型末端反向重复序列或其突变体。优选地，所述末端反向重复序列与野生型末端反向重复序列SEQ ID NO:2、11或12相比不含CpG基序；更优选地，所述末端反向重复序列中的CpG基序缺失或突变；进一步优选地，所述突变为将CpG基序突变为ApG、GpG、TpG、CpA或CpT，优选突变为TpG或CpA。
在一些实施方案中，本发明提供编码如本文任一实施方案所述的转座子系统的多核苷酸分子，包括编码所述转座酶的多核苷酸，和/或含突变性的ITR序列的转座子DNA。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的DNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA是化学修饰的。在一些实施方案中，所述转座子的末端反向重复序列如SEQ ID NO:2所示。在一些实施方案中，所述多核苷酸分子存在于核酸构建物例如DNA载体中。在一些实施方案中，所述DNA载体包括微环质粒、纳米质粒、doggybone等不含抗生素或/和复制子DNA序列的DNA形式。
本公开内容的又一方面提供了产生如本文所述的转座子系统的细胞。本公开内容的又一方面提供了含有如本文所述转座子系统的多核苷酸分子的细胞。
本公开内容的又一方面提供了一种方法，其包括：将如本文所述的转座子系统引入细胞中的步骤。
在方法的一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的多核苷酸接触。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的DNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA是化学修饰的。
在方法的一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子的核酸构建物例如DNA载体接触。在一些实施方案中，所述DNA载体包括微环质粒、纳米质粒、doggybone等不含抗生素或/和复制子DNA序列的DNA形式。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子和编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的多核苷酸的核酸构建物(如质粒载体)接触。
在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与所述BZ转座酶或所述融合转座酶接触，优选通过将所述BZ转座酶或所述融合转座酶直接添加至含有所述细胞的培养基(优选地添加至靶生物细胞的细胞培养基)中来提供转座酶蛋白质。在根据本发明的BZ转座酶或融合转座酶与靶细胞直接接触中，可以不使用任何改变蛋白质跨过细胞膜的穿透的试剂、载体或方法。
在一些实施方案中，在本发明提供了一种用于对细胞进行基因工程化的方法，其中该方法不包含蛋白质转染步骤，特别地，优选的是该方法不包含为了将转座酶蛋白质引入细胞中蛋白质转染试剂或程序的使用。换言之，本发明的方法包含不使用改变蛋白质跨过细胞膜的穿透(penetration)的任何载体、试剂或方法引入转座酶蛋白质的步骤。
在方法的一些实施方案中，所述转座子包含位于两个末端反向重复序列之间的DNA元件组合，DNA元件组合包括但不局限于启动子、增强子、表达基因、5-UTR、3-UTR等本领域内技术人员所熟知的序列元件。在一些实施方案中，所述两个末端反向重复序列(二者反向互补)任一包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述引入包括借助于电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、阳离子聚合物、树状聚体、脂质体、微粒轰击、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、impalefection、磁转染、核转染或其任意组合转染所述细胞。在一些实施方案中，所述引入包括对所述细胞进行电穿孔。
在方法的一些实施方案中，所述细胞是从受试者分离的原代细胞。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是患有疾病的患者。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述细胞从所述受试者的血液中分离。在一些实施方案中，所述细胞包含原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代白细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代T细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞包含γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任意组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含CD3+细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞选自：胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、支气管肺泡干细胞、乳腺干细胞、间充质干细胞、肠干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞及其任意组合。在一些实施方案中，所述干细胞包含诱导多能干细胞。
本公开内容的又一方面提供了一种治疗方法，其包括：(a)将转座子和识别该转座子的如本文所述的BZ转座酶或融合转座酶引入细胞中，从而生成遗传修饰的细胞；(b)将所述遗传修饰的细胞施用于需要所述治疗的患者。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞包含由所述转座子引入的转基因。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述施用包括将所述遗传修饰的细胞输注到所述患者的血管中。
3、本发明技术方案带来的有益效果
1)野生型转座酶效率太低，工程化野生型ZB转座酶改造，显著提高了转座酶的转座基因整合效率，使其具有现实的应用价值。
2)工程化BZ转座酶提高效率后，筛选了最优的TIR序列突变，降低了细胞毒性，提高了其应用于细胞治疗和转基因可行性。
3)以mRNA形式的工程化BZ转座酶应用于细胞治疗和转基因，进一步提高了安全性。
4)以非转染形式的工程化BZ转座酶蛋白应用于细胞治疗和转基因，进一步提高了安全性。
附图说明
图1显示筛选BZ转座酶所使用的ZB转座酶表达质粒和含有EGFP基因表达框转座子质粒
图2显示BZ转座酶单突变体库的转座效率筛选结果。
图3显示BZ转座酶组合突变体在CHO中提高转座和表达效率。
图4显示BZ转座酶组合突变体在PBMC中提高转座和表达效率。
图5显示一些实施方案的BZ转座酶组合突变体提高了转座效率(EGFP％)。
图6显示一些实施方案的BZ转座酶组合突变体提高了转座子基因表达效率(gMFI)。
图7显示另一些实施方案的BZ转座酶组合突变体提高了转座效率(EGFP％)。
图8显示另一些实施方案的BZ转座酶组合突变体提高了转座子基因表达效率(gMFI)。
图9显示基于ZB的融合转座酶转座效率不受融合蛋白的类型影响。
图10显示以蛋白形式加入转座酶的转座效率。
图11显示工程化改造的BZ转座酶用于CAR-T细胞治疗时细胞增殖水平不受影响，可以达到PiggyBac高效转座酶的水平。
图12显示工程化改造的BZ转座酶用于CAR-T细胞治疗时，转座效率可以达到PiggyBac高效转座酶的水平。
图13显示显示工程化改造的BZ转座酶用于CAR-T细胞治疗时，制备的Car-T细胞对肿瘤细胞L363的杀伤效果无显著性差异。
图14显示ITR中CpG基序突变对BZ转座子系统的基因整合影响。
具体实施方式
因为野生型ZB转座酶或ZB转座子系统存在转座活性偏低的缺点，无法在转基因或细胞治疗真实应用场景中达到预期的最佳效果，所以本发明通过工程化方法优化转座酶氨基酸序列和/或转座子DNA序列的方式来提高ZB转座系统的整体活性。在本发明中将经工程化的ZB转座酶或ZB转座子系统称为BZ转座酶或BZ转座子系统。
与免疫细胞(例如T淋巴细胞)的病毒转导相比，通过DNA转座子递送转基因具有多个优点：易用性，递送大基因片段的潜力，实现临床应用速度快以及低生产成本，转基因能长期且高水平稳定的表达，相较逆转录病毒而言显著较少的诱变、非致癌性和可逆性。基于非病毒载体的基因转移递送系统进行的非转化原代人T淋巴细胞的离体遗传修饰极其困难。目前已报道的成熟案例仅限于Sleeping beauty睡美人转座子、PiggyBac转座子、TcBuster转座子。本发明通过提高BZ转座酶介导的转座效率从而使其适用于细胞免疫治疗的临床应用。
CN105018523A证明ZB转座子是将转基因插入细胞的有效非病毒工具，但对于细胞或基因治疗来说其仍然存在安全性风险，使用转座酶编码DNA导致在靶细胞中转座酶蛋白质持续表达时间延长，缺乏控制的转座酶暴露的时间和动力学带来了持续且不受控制的转座风险，这引起了有关不利的治疗性细胞产品的转化的安全性担忧。为确保转座酶清除和避免输入异常或不稳定的细胞产物，进行中的试验的工程化T细胞在CAR基因递送后被培养2-4周，这会降低细胞适应性和治疗效果。因此，迫切需要提高转座酶/转座子系统的控制性和安全性，这也是一般细胞和基因治疗的关键要求。为了控制这种转座酶暴露风险，本发明一些实施方案中使用了基于mRNA表达工程化改造高活性BZ转座酶的方法，该方法缩短了蛋白质表达的时间，降低了免疫细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)等细胞的细胞毒性。
在一般情况下转座酶通常难以重组生产并且表现出在生理条件下溶解度低的特征，阻碍了有效的蛋白质递送。已知应用较广的PiggyBac和TcBuster转座酶都未报道采用蛋白质的方案。仅见专利CN113661247A报道了通过对sleeping beauty转座酶的突变提高了该酶的可溶性，克服了SB蛋白聚集、低稳定性和溶解度的缺点，从而实现更高的应用价值。本发明意外的发现，工程化改造高活性BZ转座酶纯化蛋白天然具有高稳定性、可溶性、可自主跨过细胞膜并进入细胞核通过转座介导基因组修饰，这种活性对于大分子蛋白质是不常见的。因为在现有技术方法中，转座酶需要使用例如蛋白质转染试剂或程序(例如电穿孔)有效的转染到细胞中。在本发明的进一步的优化方法中，使用了纯化的工程化改造的高活性BZ转座酶蛋白质的方式实现外源基因在细胞中的转座整合。本发明涉及以下发现：BZ转座酶自发地穿透哺乳动物细胞并能够与转座子DNA一起被递送以基因修饰各种细胞系、胚胎、造血和诱导多能干细胞。本发明提供了在对细胞进行基因工程化以及使用转座酶作为穿梭(shuttle)将DNA元件组合递送至靶细胞甚至靶细胞器中的方法中应用转座酶的细胞穿透功能的方法和化合物。上述方法和发现提高了基因工程和基因治疗安全性。
DNA转座子可以通过非复制性的“切割和粘贴”机制转座。这需要由催化酶即转座酶识别两个末端反向重复序列，该酶可切割其靶标，从而从其供体模板上释放DNA转座子。在切下后，该DNA转座子随后可以整合到被相同转座酶切割的接受体DNA中。在它们的一些天然构型中，DNA转座子的侧翼是两个末端反向重复序列，并且可含有编码催化转座的转座酶的基因。
基于DNA转座子的基因组编辑应用，包括含转座酶组件和转座子组件的二元系统，转座酶组件为转座酶或其编码核酸(mRNA或DNA)，转座子组件为含有侧翼为末端反向重复序列的目的基因的转座子DNA。将转座子组件和转座酶组件共同递送到靶细胞中实现依赖于切割和粘贴机制的转座整合效果。
本文讨论了使用工程化高活性BZ转座酶应用于细胞基因整合，尤其是增强向人造血和/或免疫系统细胞中的基因转移的协同方法有关的各种装置、系统和方法。本公开内容涉及改进的工程化高活性BZ转座酶、转座子系统、转座子载体序列、转座酶递送方法和转座子递送方法。在一个实施方式中，本研究鉴定了用于制备高活性BZ转座酶的特定通用位点。在另一个实施方式中，描述了作为化学修饰的体外转录的mRNA来递送高活性BZ转座酶的改进方法。在另一个实施方式中，描述了作为DNA的“微型”环来递送BZ转座子载体的方法，其中几乎所有原核序列都已通过重组方法除去。在另一个实施方式中，描述了直接递送纯化的高活性BZ转座酶蛋白的改进方法。在另一个实施方式中，描述了使用BZ转座酶融合核定位信号结构域的方法。上述实施方式可以单独地或组合形式提高转座子对各种靶细胞的基因转移的效率。
BZ转座酶
本公开内容的一个方面提供了一种BZ转座酶。与野生型ZB转座酶(SEQ ID NO：1)相比，BZ转座酶可包含一个或多个氨基酸置换。BZ转座酶可包含与野生型ZB转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BZ转座酶可包含与野生型ZB转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，BZ转座酶的一个或多个氨基酸置换突变为带电荷的酸性或碱性氨基酸(例如K、R和H)。
BZ转座酶可包含具有至少一个与野生型ZB转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，BZ转座酶可包含具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个与野生型ZB转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸的氨基酸序列。BZ转座酶可以在ZB转座酶的三个结构域(双联DNA结合和寡聚化域、DDE催化结构域)以及结构域之间的域间区域中的任何一个中包含一个或多个氨基酸置换，或其任意组合。在一些情况下，BZ转座酶可在双联DNA结合和寡聚化域、DDE催化结构域、结构域之间的域间区域或其组合中包含一个或多个氨基酸置换。
一方面，在一些实施方案中，本发明提供一种BZ转座酶，其包含与全长SEQ ID NO：1相比，在以下位置中的一个或多个位置上具有突变的氨基酸序列：5、21、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215、216、217、218、215-218、235和251。所述BZ转座酶还可在以下一个或多个位置上具有突变：79、120和208。在一些实施方案中，所述各位置上的突变独立选自表A和表B所示的突变。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变包括天冬氨酸或谷氨酸突变为中性氨基酸或碱性氨基酸。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸置换基于Tc1/Mariner转座子家族的保守性原则。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶至少在71位和110位上具有取代突变。此外，除第71位和第110位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还可在选自第5、21、22、35、38、56、61、73、79、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215、216、217、218、215-218、235、251、120和208的一个或多个位置上具有取代突变。
在一些实施方案中，除第71位和第110位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、208、216和251的一个或多个位置上具有取代突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶至少在71位、79位和110位上具有取代突变。优选地，所述71位上的取代突变为Q突变为R、K或H；所述79位上的取代突变为Q突变为R、K或H；所述110位上的取代突变为H突变为R或K。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位和第110位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189、208、216和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、208、216和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第208位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189、216和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、216和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144和189；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138和144；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第110位、第138位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137和144；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位和第110位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、208、216和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、208、216和251。在一些实施方案中，与SEQ IDNO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位和第208位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、216和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、216和251。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189和251。在一些实施方案中，与SEQID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144和189；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138和144；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第138位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137和144；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144。
另一方面，在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶至少在208位和216位上具有取代突变。在一些实施方案中，除第208位和第216位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、217、218、235、251、79和120的一个或多个位置上具有取代突变。在一些实施方案中，除第208位和第216位的取代突变外，本发明的BZ转座酶还在选自第5、21、22、79、120、125、134、137、138、144、189和251的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第189位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和251。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第189位、216位、第208位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的BZ转座酶在第138位、第189位、216位、第208位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144。
在一些实施方案中，所述各位置上的突变是突变为带正电荷氨基酸。优选地，在包含S38、Q71或H110的突变时，S38、Q71、H110位置上的氨基酸突变为带正电荷氨基酸，例如H、K或R。
在一些实施方案中，所述各位置上的取代突变分别选自表A和表B所示的取代突变。优选地，第22位上的突变为D突变为A、L、I、G或V。在一些实施方案中，上述各位置上的取代突变独立选自：5S、21K、22A、120S、125L、35I、56L、61R、71H、71R、73L、79R、94E、110K、110R、120G、120S、125L、125M、134R、137R、137T、138G、138K、138R、144A、144E、186N、188H、188Y、189A、204V、208V、216A、217A、217V、218K、235R和251T，其中，数值指代SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号，数值后的字母表示取代突变后的氨基酸残基。
示例性BZ转座酶可包含来自表C的一个或多个氨基酸置换。有时，BZ转座酶可包含来自表C的至少一个氨基酸置换。BZ转座酶可包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少30个或更多个来自表C的氨基酸置换。优选地，BZ转座酶包含选自以下的一个或多个氨基酸置换：N5S、F21K、S38R、Q71H、Q71R、Q79R、H110R、H110K、K134R、K137T、Q138K、V144E、G189A、G216A和K251T。更优选地，BZ转座酶包含选自以下的一个或多个突变：S38R、Q71H、Q71R、H110K和H110R。
示例性BZ转座酶包含来自表D和表E的一个或多个氨基酸置换或置换组合。有时，BZ转座酶可包含来自表D和表E的至少一个氨基酸置换或置换组合。BZ转座酶可包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少30个或更多个来自表D和表E的氨基酸置换或置换组合。优选地，BZ转座酶包含选自以下的一个或多个氨基酸置换或置换组合：Q71R\H110R、Q71R\Q79R\H110R、G216A\Q71R\Q79R\H110R、H208V\Q71R\Q79R\H110R、H208V\G216A\Q71R\Q79R\H110R。
高活性BZ转座酶
本公开内容的另一方面提供了一种高活性BZ转座酶。如本文所用的，“高活性”BZ转座酶可指与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型ZB转座酶相比具有增加的转座效率的任何BZ转座酶。
转座效率可以根据宿主细胞群体中发生的成功转座事件的百分比来衡量，该百分比用引入该宿主细胞群体中的转座子和转座酶的量进行归一化。在许多情况下，当比较两种或更多种转座酶的转座效率时，针对宿主细胞在相同或相似转染条件下的转染，将相同的转座子构建体与两种或更多种转座酶中的每一种进行配对。可以通过各种方法检查宿主细胞中的转座事件的量。例如，转座子构建体可以被设计成含有位于末端反向重复序列之间的报道基因，并且该报道基因呈阳性的转染细胞可以被计数为发生成功转座事件的细胞，这可以得出转座事件的量的估计值。在一些实施方案中，当比较两种或更多种不同转座子的转座效率时，可以针对宿主细胞在相同或相似转染条件下的转染，将相同的转座酶与每种不同的转座子进行配对。可以使用类似的方法来测量转座效率。也可以实施本领域技术人员已知的其它方法来比较转座效率。
本文还提供了获得高活性BZ转座酶的方法。一种示例性方法可包括系统性地BZ转座酶的氨基酸，以增加氨基酸序列的净电荷。方法可包括系统性将DNA结合和寡聚化结构域突变为带正电荷的组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基。不希望受特定理论的束缚，DNA结合和寡聚化结构域在中性pH下的净电荷的增加可以增加转座酶/转座子、转座酶/转座酶互作复合体的稳定性，增强靶DNA与转座酶蛋白以及转座酶之间的结合能力，从而提高转座酶的整合效率。
高活性BZ转座酶可包含一个或多个氨基酸置换。在许多情况下，所述一个或多个氨基酸置换可以是野生型ZB序列(SEQ ID NO：1)中的非保守氨基酸被保守氨基酸的置换。BZ转座酶的非限制性实例包括包含来自表E的至少一个氨基酸置换的BZ转座酶。BZ转座酶可包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少30个或更多个来自表E的氨基酸置换。
在一些情况下，BZ转座酶可包含氨基酸置换S38R、Q71R、Q79R、H110R、G216A。BZ转座酶还可包含氨基酸置换H208V、K251T、G189A、Q138K、Q138R、K134R、K137T、V144E、N005S、F21K、K120S、N125L中的一个或多个。
发明人还发现，ZB或者BZ转座酶可以融合其它功能性多肽或蛋白结构域，且不影响转座酶或转座子基因整合功能。因此，本发明的转座酶还可以是包含所述BZ转座酶的融合转座酶，该融合转座酶还包含功能多肽。
本文所述“功能多肽”指具有其本身功能的多肽，例如DNA序列特异性结合域和/或细胞核定位信号结构域(NLS)。所述DNA序列特异性结合域指基于DNA序列特异性发挥功能的结构域，例如CRISPR/Cas结构域、TALE域、锌指域、AAV Rep DNA结合域或其任意组合。所述细胞核定位信号结构域包括SV40 NLS、C-myc NLS、TAF1 NLS、TP53 NLS、STAT3 NLS或其任意组合。
在融合转座酶中，所述BZ转座酶和所述DNA序列特异性结合域可以直接连接或被连接体隔开。通常所述连接体包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或至少50个氨基酸。示例性地，所述连接体的序列为(GGGS)n或A(EAAAK)nA，n为大于0的正整数，例如1、2、3、4或5；优选地，所述连接体的序列为GGGS。
本发明也包括任一实施方案所述的BZ转座酶或融合转座酶的突变体。本文中，“突变体”或“变体”包括转座酶的突变体，只要该突变体保留了所述抗体、跨膜区和胞内结构域各自相应的生物学功能即可。如，适用于本发明的抗体的突变体包括与作为对比的抗体具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。或者，与作为对比的序列相比，本发明所述的突变体具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有beta-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在一个或多个实施方案中，所述突变体保留本文所述的BZ转座酶中第5、21、22、35、38、56、61、71、73、79、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、215、216、217、218、235、251、120或208位置的氨基酸置换。
本文所述转座酶的序列可以是经过修饰的多肽序列。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的转座酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本文所述的转座酶可以通过直接与细胞接触从而自发地穿透细胞并能够与转座子DNA一起被递送以基因修饰各种细胞系、胚胎、造血和诱导多能干细胞。
多核苷酸分子
本发明提供多核苷酸分子，其编码本发明所述的转座酶(BZ转座酶或融合转座酶)的多核苷酸，和/或含突变或未突变的ITR序列的转座子DNA。本发明也提供转座酶的编码序列的互补序列。该多核苷酸可以是重组核酸分子，也可以是合成的；其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸分子包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的DNA。所述多核苷酸还可包含编码可被所述BZ转座酶或所述融合转座酶识别的转座子的核酸序列。所述多核苷酸存在于DNA载体中。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。表达载体包含转座酶的表达框，其为一种核酸构建体即含有启动子、转座酶编码序列和PolyA加尾信号序列。表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。核酸构建体中还可含有其它表达所需的原件，包括但不限于增强子等。所述DNA载体包括微环质粒、纳米质粒、doggybone等不含抗生素或/和复制子DNA序列的DNA形式。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA是化学修饰的，例如假尿苷化学修饰。
本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
可采用本领域常规的方法制备得到多核苷酸分子，并构建相应的载体，通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。或者，可以如上得到融合转座酶的各部分的序列后再连接得到CAR的全长。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等、Ausubel(1989)或其他标准教科书中描述的技术。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等。
此外，可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸分子的核酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的核酸构建物可以多种方式被操作以保证所述转座酶的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。本领域知晓通过DNA或mRNA来表达蛋白所需的调控序列和操作方式。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体和整合载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的宿主细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
为了评估转座酶的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。
转座子
转座子包含位于两个末端反向重复序列之间的DNA元件组合，DNA元件组合包括但不局限于启动子、增强子、表达基因、5-UTR、3-UTR等本领域内技术人员所熟知的序列元件。在一些实施方案中，所述两个末端反向重复序列各自独立地包含与SEQ ID NO：2、11或12具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述DNA元件组合包含表达基因。相应地，所述DNA元件组合还可包含选自CMV、EFS、MND、EF1α、CAGC、PGK、UBC、U6、H1和Cumate的启动子。在一些实施方案中，所述表达基因编码选自细胞受体、免疫检查点蛋白质、细胞因子及其任意组合的蛋白质。在一些实施方案中，所述表达基因编码选自T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任意组合的细胞受体。
CAR可依次包含结合肿瘤细胞膜抗原的多肽(如scFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域周知的用于构建CAR的铰链区、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的CAR。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原，该多肽通常插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个：所述多肽的N端、所述多肽和所述铰链区之间和所述多肽内部。所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。本发明的嵌合抗原受体可针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13RL1、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11R/、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA和PROGRP。在一些实施方案中，适用于本发明的CAR可参考CN202111681582.0，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。
在一些实施方案中，所述表达基因编码抗原识别结构域。所述抗原识别结构域可包含抗体、抗体模拟物、蛋白质支架或其片段。在某些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方式中，所述抗体经亲和性调节(affinity-tune)。本发明抗体的非限制性示例包括单链可变片段(scFv)、VHH、单域抗体(sdAB)、小模块免疫药物(SMIP)分子，或纳米抗体。在某些实施方式中，VHH是骆驼科的。或者或此外，在某些实施方式中，VHH是人源化的。本发明抗体片段的非限制性示例包括互补决定区、可变区、重链、轻链，或其任何组合。本发明抗体模拟物的非限制性示例包括：亲和体(affibody)、Afflilin分子、粘合素(affimer)、Affitin分子，阿尔法体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)，和Avimer分子、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽，或单体(monobody)。本发明蛋白质支架的非限制性示例包括Centyrin。
转座子通常以核酸构建物，特别是DNA载体的形式提供，在此方面，可使用本领域任何便于将转座子引入细胞的DNA载体，例如微环质粒、纳米质粒、Doggybone等DNA质粒。所述DNA质粒可含有或不含抗生素和/或复制子序列。
宿主细胞
本文中，在表达异源核酸序列时，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可用作载体或mRNA的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体或mRNA的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。
本文中，宿主细胞包括携带本文所述多核苷酸分子和/或产生所述转座酶的细胞。具体而言，本发明提供携带本发明所述转座酶和/或其编码序列的细胞。所述细胞还可包含编码可被所述转座酶识别的转座子的核酸序列。所述多核苷酸分子还可包含编码可被所述BZ转座酶或所述融合转座酶识别的转座子的核酸序列。
细胞的种类不受限制，只要能表达本文所述转座酶或能利用本文所述转座酶实现对转座子的转座即可。在一些实施方案中，所述细胞是从受试者分离的原代细胞。所述受试者是健康对象或已被诊断为患有疾病(例如癌症或肿瘤)。
在一些实施方案中，所述细胞从所述受试者的血液中分离，例如PBMC或其衍生细胞。所述细胞可包含原代免疫细胞，例如原代白细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代T细胞。所述原代T细胞包含γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任意组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含CD3+细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包含干细胞。所述干细胞选自：胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、支气管肺泡干细胞、乳腺干细胞、间充质干细胞、肠干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞及其任意组合。所述干细胞包含诱导多能干细胞。
可将本发明的核酸构建物、载体、mRNA引入感兴趣的细胞中。本文中，引入的方法包括借助于电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、阳离子聚合物、树状聚体、脂质体、微粒轰击、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、impalefection、磁转染、核转染或其任意组合转染所述细胞。在某些实施方案中，采用电穿孔将所述核酸构建物或重组表达载体。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的BZ转座酶或融合转座酶。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在使用诱导型启动子表达转座酶的实施方案中，当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
转座系统
本文还涉及一种用于基因组编辑系统(转座子系统)，其包含：(1)如本文所述的BZ转座酶或融合转座酶，或编码其的多核苷酸，和/或(2)含突变或未突变的末端反向重复序列的转座子DNA。所述转座子如本文他处所述。示例性的野生型末端反向重复序列如SEQ IDNO:2、11或12所示。
所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的DNA或信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述转座子存在于DNA载体中。在一些实施方案中，所述多核苷酸和所述转座子存在于同一质粒中。
发明人发现，转座子的末端反向重复序列可以进行突变以改善转座效率。在一些实施方案中，转座子的末端反向重复序列与野生型末端反向重复序列(例如SEQ ID NO:2、11或12)相比不含CpG基序。CpG基序可以缺失或突变，例如突变为ApG、GpG、TpG、CpA或CpT。本发明还提供转座子的末端反向重复序列以及含所述末端反向重复序列的转座子，所述末端反向重复序列为SEQ ID NO:11或12中的CpG突变为ApG、GpG、TpG、CpA或CpT的序列。
方法和用途
本文还涉及制备细胞的方法，包括：将如本文所述的BZ转座酶或融合转座酶和可被该BZ转座酶或融合转座酶识别的转座子引入细胞中的步骤。
在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的多核苷酸接触。所述多核苷酸包含编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的DNA或信使RNA(mRNA)。
在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与所述BZ转座酶或所述融合转座酶接触，优选通过将所述BZ转座酶或所述融合转座酶直接添加至含有所述细胞的培养基(优选地添加至靶生物细胞的细胞培养基)中来提供转座酶蛋白质。在根据本发明的BZ转座酶或融合转座酶与靶细胞直接接触中，可以不使用任何改变蛋白质跨过细胞膜的穿透的试剂、载体或方法。
在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子的DNA载体接触。在一些实施方案中，所述DNA载体包括微环质粒。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子和编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的多核苷酸的质粒载体接触。
本发明还提供一种利用转座酶对细胞进行基因工程化的方法，其中该方法涉及使转座酶穿透细胞膜但不包含蛋白质转染步骤，特别地，该方法不包含为了将转座酶蛋白质引入细胞中蛋白质转染试剂或程序的使用。该方法包括将转座酶与待接受转座酶的细胞直接接触的过程，例如使用含有转座酶的细胞培养基孵育细胞。本发明的方法包含不使用改变蛋白质跨过细胞膜的穿透(penetration)的任何载体、试剂或方法引入转座酶蛋白质的步骤。
本发明上下文中的术语“蛋白质转染”应被理解为广泛地涉及足以将不能有效地进入靶细胞的蛋白质引入所述靶细胞的任何方法或试剂。普遍的蛋白质转染系统和试剂包括商业蛋白质转染试剂，例如PULSinTM、ProteoJuiceTM、XfectTM和 PierceTM蛋白质转染试剂(ThermoFisher)、TransPassTM，以及蛋白质电穿孔等方法。
本文还提供一种治疗方法，其包括：(a)将转座子和识别该转座子的如本文所述的BZ转座酶或融合转座酶引入细胞中，从而生成遗传修饰的细胞，其包含由所述转座子引入的转基因包含由所述转座子引入的转基因；(b)将所述遗传修饰的细胞施用于需要所述治疗的患者。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述施用包括将所述遗传修饰的细胞输注到所述患者的血管中。
本发明还涉及本文所述的BZ转座酶或融合转座酶、其编码序列(DNA或RNA)或核酸构建物、细胞、或基因组编辑系统在制备产品中的用途，所述产品例如基因编辑试剂盒、工程化的免疫细胞或药物组合物。所述免疫细胞包含γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞等。
本发明的范围还涵盖包含本文所述的BZ转座酶或融合转座酶、其编码序列(DNA或RNA)或核酸构建物、细胞、或基因组编辑系统的试剂盒。所述试剂盒还包含可被所述BZ转座酶或所述融合转座酶识别的转座子的编码核酸或其核酸构建物(例如包含所述转座子的DNA载体)、宿主细胞、适合宿主细胞的细胞培养基、细胞因子、使用说明书中的一种或多种。
药物组合物和施用
本发明的转座酶、核酸分子和细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。因此，本发明还提供包含本文所述方法制得的转座酶、核酸构建物、基因编辑系统或细胞和药学上可接受辅料的药物组合物。
本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的转座酶、核酸构建物、基因编辑系统或细胞传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送蛋白、核酸或细胞的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。参见例如REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，A.R.Genrmo编，1990，Mack PublishingCompany。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送、用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送，例如用于静脉输注递送。所述组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含免疫细胞特别是免疫细胞(例如T细胞)的配制物。本发明的药物组合物还可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中(例如冻存制剂)储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体、冻存物或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述药物配制物(例如，冻存制剂)可储存成即用形式或在施用前进一步配制的形式。例如，适合递送本文所述药物组合物可以是冻存制剂，这样可以耐受远距离运输而不损伤细胞。除了细胞本身外，冻存制剂通常还包括细胞冻存液、人血清白蛋白(HSA)等组分。在施用前(例如静脉输注)，冻存的药物组合物需低温保存(例如置于液氮中)。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。本领域技术人员知晓常规冻存液的组分和浓度。例如，冻存液或输注组合物还可包含二甲亚砜、氯化钠、葡萄糖、醋酸钠、氯化钾或氯化镁等，其浓度可由本领域技术人员(例如有经验的医师)根据细胞、疾病、患者等状况确定。
在本发明的一些实施方案中，本发明遗传修饰的细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
在具体实施方案中，本发明通过PCR获得突变的BZ酶核酸序列，连接到质粒中后转化大肠杆菌，获得工程化BZ转座酶。用构建的工程化BZ转座酶的表达载体或mRNA和含eGFP或表达基因的转座子转染CHO细胞和/或PBMC细胞，均观察到转座子表达。将BZ转座酶替换为融合有其它多肽的融合转座酶，不影响转座酶或转座子基因整合功能。此外，用转座子转染细胞并用含野生型ZB转座酶或工程化BZ转座酶的培养基孵育细胞，同样观察到转座子表达。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
本文采用到以下方法。
(1)用于BZ突变体制备的定点诱变
High-Fidelity DNA Polymerase(New England BioLabs)用于所有定点诱变。对于单点突变，进行滚环PCR诱变后，使用DpnI限制性内切酶消化，取5μL消化反应产物在TOP10大肠杆菌感受态细胞中进行转化。对于组合突变，使用多个PCR反应诱变后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天漠生物)纯化PCR产物，使用Hieff/>Plus Multi OneStep Cloning Kit(YEASEN)对纯化的PCR产物进行10μL连接反应，取5μL连接反应产物在TOP10大肠杆菌感受态细胞中进行转化。对于每个突变体挑取3个单克隆进行培养，分别各取一半进行测序鉴定和保菌，对于鉴定序列正确的突变体使用NucleoBond Xtra MiDi EF质粒制备试剂盒(MACHEREY-NAGEL)制备用于转染的质粒。对质粒样品超螺旋比例和内毒素含量进行抽检鉴定。
(2)测量CHO-K1细胞中的转染效率
在电转当天，将CHO-K1细胞用含0.25％EDTA的胰酶将细胞进行消化，收集离心后，用1×DPBS重悬计数，取1.5-2.5×106的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza 2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4ug转座酶质粒与4ug转座子质粒与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为H-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基的六孔板中培养。在电转后D5,D9,D13天进行荧光拍照，流式检测转座酶在CHO-K1细胞中的转座效率。
(3)测量PBMC(外周血单个核细胞)细胞中的转染效率
在电转当天，将冻存的PBMC复苏后计数，取1×107的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza 2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4ug转座酶质粒与4ug转座子质粒与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为U-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基(AIM-V+2％FBS)的六孔板中培养，补加500U/ml的IL-2。在电转后第5天进行转板，并于D5,D9,D13天进行荧光拍照，计数，流式检测转座酶在PBMC细胞中的转座效率。
对于荧光拍照分析，通过在D5、D9、D13天时用奥林巴斯倒置荧光显微镜拍摄GFP荧光，曝光时间为500ms，拍摄倍率为100×，通过GFP荧光细胞数及荧光强弱评估转座酶在细胞中的转座效率。
对于流式细胞分析，通过检测在没有药物选择的情况下生长的细胞中的GFP荧光来评估该基因的稳定整合。在指定的时间点收获转染的细胞，用1×DPBS洗涤1次后，用500ul DPBS重悬加入流式管或96孔板中进行上机检测。使用Cytex的SpectroFlo分析细胞，使用FITC通道评估GFP表达。
(4)CHO-K1细胞中转座酶突变体的筛选
在电转当天，将CHO-K1细胞用含0.25％EDTA的胰酶将细胞进行消化，收集离心后，用1×DPBS重悬计数，取1.5-2.5×106的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza 2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4ug不同转座酶突变体质粒与4ug转座子质粒(pZB-dCG-eGFP)与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为H-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基的六孔板中培养。在电转后D5、D9、D13天进行荧光拍照，收获转染的细胞，用1×DPBS洗涤1次后，用500ul DPBS重悬加入流式管或96孔板中进行上机检测。使用Cytex的SpectroFlo分析细胞，使用FITC通道评估GFP表达。根据最终的转座效率来筛选评估不同转座酶突变体。
(5)PBMC细胞中转座酶突变体的筛选
在电转当天，将冻存的PBMC复苏后计数，取1×107的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza 2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4ug转座酶质粒与4ug转座子质粒(pZB-dCG-eGFP)与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为U-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基(AIM-V+2％FBS)的六孔板中培养，补加500U/ml的IL-2。在电转后第5天进行转板，并于D5、D9、D13天进行荧光拍照，计数，收获转染的细胞，用1×DPBS洗涤1次后，用500ulDPBS重悬加入流式管或96孔板中进行上机检测。使用Cytex的SpectroFlo分析细胞，使用FITC通道评估GFP表达。根据最终的转座效率来筛选评估不同转座酶突变体。
实施例1：在CHO和PBMC细胞中筛选高效基因整合的BZ转座酶突变体
实施目的：
本实施例测试不同转座酶质粒在CHO细胞和/或PBMC细胞中的转座效率，鉴定高效基因整合的转座酶突变体。
实施方法
本实施例所构建的转座子的载体序列为SEQ ID NO:3，包含eGFP荧光蛋白表达框。将在不同位置具有氨基酸置换的工程化BZ转座酶在CHO-K1和/或PBMC细胞上进行筛选并鉴定高酶活性突变体。含有野生型ZB转座酶的载体序列如SEQ ID NO:4所示。根据SEQ ID NO:4的序列对相应位置氨基酸的密码子进行更换，可获得不同的工程化BZ转座酶的载体序列。野生型ZB转座酶的氨基酸序列如下所示：
MMGKNKELSQDLRSLIVEKHFDGNGYRRISRMLNVPVSTVGAIIRKWKKHKFTINRPRSGAPRKIPVRGVQRIIRRVLQEPRTTRAELQEDLASAGTIVSKKTISNALNHHGIHARSPRKTPLLNKKHVEARLKFAKQHLEKPVDYWETIVWSDESKIELFGSHSTHHVWRRNGTAHHPKNTIPTVKFGGGSIMVWGCFSARGTGRLHIIEGRMNGEMYRDILDKNLLPSTRKLKMKRGWTFQQDNDPKHKAKETMKWFQRKKIKLLEWPSQSPDLNPIENLWRELKIKVHKRGPRNLQDLKTVCVEEWARITPEQCRRLVSPYKRRLEAVITNKGFSTKY*(SEQ ID NO:1)
为测试不同工程化BZ转座酶的转座效率，使用电穿孔的方式将构建的工程化转座酶或转座子按一定质量比转染CHO细胞和/或PBMC细胞。用WT ZB转座酶和PiggyBac(PB)转座酶作为对照转座酶一并转染CHO和/或PBMC细胞。细胞在完全培养基中生长(没有药物选择)，并且在转染后第13-17天通过荧光拍照和流式细胞术评估eGFP表达。
实施结果
鉴定出转座效率高于野生型转座酶的系列BZ转座酶突变体(图2)。这些突变体中，N5S、F21K、S38R、Q71H、Q71R、Q79R、H110R、H110K、K134R、K137T、Q138K、V144E、G189A、G216A和K251T等具有明显提高的转座活性。尤其是，BZ转座酶HTH结构域第二个螺旋结构外侧氨基酸突变为带正电荷氨基酸如组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)时(如S38R、Q71H、Q71R、H110K和H110R等)转座效率增加更为显著。
表C：
实施例2：在CHO和PBMC上筛选高效基因整合的BZ转座酶组合突变体
实验目的
本实施例测试不同的工程化BZ转座酶的组合突变体的转座效率，鉴定高效基因整合的BZ转座酶突变体组合。
实验步骤：
在不同细胞中比较了两批多组不同的工程化BZ转座酶组合突变体，细胞转染方法和转座效率检测方法同实施例1：一批为实施例1中筛选出的中等强度的单点突变体与Q71R/H110R的2个、3个或更多个组合突变体(表D)，另一批为实施例1中筛选出的中等强度的单点突变体的2个、3个或更多个以上的组合突变体(表E)。
实验结果：
结果显示，与野生型ZB转座酶相比，中等强度的单点突变体的2个、3个或更多个以上的组合突变体显示出了较优的转座效率(图7和8)；中等强度的单点突变体与Q71R/H110R的2个、3个或更多个组合突变体同样显示出了较优的转座效率，其中Q71R\H110R、Q71R\Q79R\H110R、G216A\Q71R\Q79R\H110R、H208V\Q71R\Q79R\H110R、H208V\G216A\Q71R\Q79R\H110R提升显著(图5和6)。在这些检查的工程化转座酶BZ组合突变体中，选取编号206(Q71R/H110R)的组合突变体与PiggyBac(PB)比较，结果如图3和4所示，206(Q71R/H110R)在CHO-K1及PBMC细胞中均具有与PiggyBac(PB)相当或更优的效果
表D
/>
表E
/>
实施例3：融合蛋白形式的ZB或BZ转座酶对其基因整合能力无影响
实验目的：本实施例用以证明ZB或者BZ转座酶可以融合其它功能性多肽或蛋白结构域，且不影响转座酶或转座子基因整合功能。
实验方法：
本实施例测试包含NLS的示例性融合转座酶的转座效率。在转座酶N端连接不同NLS标签，生成不同类型的转座酶。在野生型ZB转座酶中加入不同NLS标签，其氨基酸序列如表F所示。借助于电穿孔，将上述包含NLS的示例性融合转座酶转染至PBMC细胞中，细胞在完全培养基中生长(无药物选择)，转染后第13天通过流式细胞术检测荧光蛋白的表达量来评估包含NLS的示例性融合转座酶的转座效率。
表F
| NLS名称 | 氨基酸序列 | |
| pLoxp-hTZB | 无NLS | / |
| pLoxp-hTZB-C | c-myc NLS | PAAKRVKLD |
| pLoxp-hTZB-T | TAF1 NLS | PPKKKRRV |
| pLoxp-hTZB-P | TP53 NLS | KRALPNNTSSSPQPKKK |
| pLoxp-hTZB-S | STAT3 NLS | DVRKRVQDLEQKM |
实验结果：
结果所示(图9)，上述测试的包含NLS的示例性融合转座酶的转座效率不受融合蛋白NLS多肽的影响。上述测试证明ZB或BZ转座酶蛋白N端可以偶联不同的多肽或蛋白结构域生成所需不同类型的转座酶，且不影响其转座整合的功能。
实施例4：BZ转座酶可以蛋白形式介导转座子的基因整合
实验目的：
本实施例用以证明蛋白形式BZ转座酶可以介导转座子的基因整合。
实验方法：
复苏培养CHO-K1细胞，待细胞生长状态良好，消化洗涤细胞，使用Lonza 2B系统(Lonza)用电穿孔的方法将转座子(携带eGFP报告基因)转染进细胞，电转4.5小时后向培养基中添加蛋白形式的BZ转座酶。使用空转细胞作为活力对照。电穿孔的细胞在转染后增殖培养14天后，收获细胞，用DPBS洗涤1次，并重悬于200μL的DPBS缓冲液中。使用CytekNorthern Lights(Cytek Biosciences)流式细胞仪分析细胞，并使用FITC通道评估EGFP表达。
实验结果：
结果所示(图10)，在电转体系中添加工程化BZ转座酶蛋白(野生型ZB转座酶(ZBprotein)或编号为206的组合突变体(BZ protein))可介导转座子表达。在转染后20天，野生型ZB转座酶蛋白的转座效率约为6-7％。与野生型ZB转座酶蛋白相比，在转染后14天，突变体206的转座效率是野生型ZB转座酶蛋白的转座效率的2倍左右。
实施例5：mRNA形式的BZ转座酶可以介导CAR质粒或抗体质粒DNA的基因组整合，并用于细胞基因治疗
实验目的：本实施例用以证明mRNA形式的BZ高效转座酶可以用于细胞基因治疗，且效果与目前本技术领域最高效的PiggyBac(PB)转座酶的效果相当。
实验方法：
制备包含编码所述BZ转座酶(具有Q71R，H110R突变的ZB蛋白)或所述PB转座酶的信使RNA(mRNA)及其转座子系统的供体DNA质粒257，该mRNA为假尿苷化学修饰的mRNA，以对CD4+/CD8+T细胞进行工程化。
将实施例中所使用的CD4+/CD8+T细胞为从健康人外周血中提出，用CD4+/CD8+磁珠分离得到，按1E7的细胞数铺于包被anti-CD3/anti-CD28或anti-CD3/4-1BBL的六孔板中，在含100U/ml的IL-2完全培养基中进行培养(无药物选择)，孵育两天进行活化。发明人使用携带CAR基因(CAR的信息披露于CN 202111681582.0，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文，本实施例使用的是CN 202111681582.0中SEQ ID NO:99所示的CAR)的转座子质粒(257)和示例性转座酶BZ mRNA对活化的CD4+/CD8+T细胞进行电穿孔，在电穿孔后通过流式细胞术监测转基因表达9天。其不同活化方式下，携带不同共刺激域4-1BB，CD28的CAR基因的转座子质粒(257)分别与PB mRNA转座酶及示例性转座酶BZ mRNA共转(表G)。
表G：
实验结果：
结果所示(图11、12)，与PB mRNA转座酶相比，在转染后9天，使用示例性BZ转座酶mRNA的转座效率与PB mRNA转座酶的转座效率相当，无显著性差异，且T细胞增殖效率和倍数也无限制性差异。说明mRNA形式的BZ转座酶可以介导应用于基因治疗的CAR和/或抗体质粒DNA的基因整合，且效果与本技术领域最高效的PiggyBac(PB)转座酶相当。如图13所示、选取anti-CD3/4-1BBL活化方式制备CAR-T进行肿瘤细胞L363的杀伤实验，结果也表明新型BZ转座酶制备的CAR-T细胞与PB转座酶制备的CAR-T细胞杀伤效果无显著性差异。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
实施例6：BZ转座子ITR中CpG突变维持转座系统基因整合功能
实验目的：BZ转座子ITR突变清除CpG基序，减少免疫原性的同时维持转座系统基因整合功能。野生型BZ转座子5'ITR序列和3'ITR序列(反向互补)如SEQ ID NO:11和12所示。
实验方法：
将ITR中唯一的CpG基序突变为ApG、GpG、TpG、CpA、CpT。将携带有ITR突变和eGFP报告基因的转座子质粒和BZ mRNA共同电转CHO-K1细胞中，细胞在完全培养基中生长(无药物选择)，转染后第14天通过流式细胞术检测荧光蛋白的表达量来评估ITR突变的转座子的转座效率。
实验结果：
结果如图14所示，与野生型BZ ITR序列相比，BZ转座子质粒上的ITR CpG突变为CpA或TpG时，不影响转座系统的基因整合功能；突变为ApG、GpG、CpT时，虽基因整合效率下降，但仍可以有效转座。含CpG的对照质粒在没有BZ mRNA的条件下，则没有任何基因整合效率。
本文序列
/>
/>
Claims (15)
1.一种转座子系统，包括突变性的转座酶，和/或含突变性的末端反向重复序列的转座子DNA。
2.如权利要求1所述的转座子系统，所述突变性的转座酶为BZ转座酶，其包含与SEQ IDNO：1相比具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列，并且与SEQ ID NO：1相比具有一个或多个氨基酸置换突变，与氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型ZB转座酶相比，所述BZ转座酶具有提高的转座效率。
3.如权利要求2所示的转座子系统，所述BZ转座酶在其DNA结合和寡聚化域、DDE催化结构域或其组合中具有一个或多个氨基酸置换，
优选地，所述BZ转座酶包含与SEQ ID NO：1相比，在以下位置中的一个或多个位置上具有突变的氨基酸序列：5、21、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、216、217、218、235和251；任选地，所述BZ转座酶还在以下一个或多个位置上具有突变：79、120和208，
更优选地，所述各位置上的突变独立选自表A或表B所示的突变，
进一步优选地，所述各位置上的突变分别为5S、21C、21K、35I、38R、56L、61R、71H、71R、73L、79R、110K、110R、125L、134R、137T、138G、138K、144A、144E、186N、188Y、189A、204V、215-218DAVQ、216A、217V、218K、235R或251T。
4.如权利要求3所述的转座子系统，与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶至少在71位和110位上具有取代突变，
优选地，
除第71位和第110位的取代突变外，所述BZ转座酶还在选自第5、21、22、35、38、56、61、73、79、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、216、217、218、235、251、120和208的一个或多个位置上具有取代突变，或
除第71位和第110位的取代突变外，所述BZ转座酶还在选自第5、21、22、79、120、125、134、137、138、144、189、208、216和251的一个或多个位置上具有取代突变；优选地，与SEQID NO：1相比，所述BZ转座酶至少在71位、79位和110位上具有取代突变，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位和第110位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189、208、216和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、208、216和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第110位、第208位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189、216和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、216和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第110位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144、189和251；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第110位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138、144和189；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第110位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137、138和144；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第110位、第138位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、134、137和144；优选地，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第79位和第110位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、208、216和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、208、216和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第79位、第110位和第208位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189、216和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189、216和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144、189和251；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144、189和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138、144和189；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137、138和144；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在71位、第79位、第110位、第138位、第189位、第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：5、21、22、120、125、134、137和144；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144，
更优选地，BZ转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下突变的BZ转座酶：
Q71R\H110R、
Q71R\Q79R\H110R、
G216A\Q71R\Q79R\H110R、
H208V\Q71R\Q79R\H110R、
H208V\G216A\Q71R\Q79R\H110R、
F21K\D22A\Q71R\H110R、
N005S\F21K/D22A\Q71R\Q79R\H110R、
K120S\N125L\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\G189A\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K137T\Q71R\Q79R\H110R、
G216A\Q71R\H110R、
H208V\Q71R\H110R、
H208V\G216A\Q71R\H110R、
G216A\H208V\G189A\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E\Q71R\H110R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K137T\Q71R\H110R、或
N005S\F21K/D22A\Q71R\H110R。
5.如权利要求3所述的转座子系统，与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶至少在208位和216位上具有取代突变，
除第208位和第216位的取代突变外，BZ转座酶还在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、217、218、235、251、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，或
除第208位和第216位的取代突变外，BZ转座酶还在选自第5、21、22、79、120、125、134、137、138、144、189和251的一个或多个位置上具有取代突变，或
与SEQ ID NO：1相比，BZ转座酶在第208位、第216位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、189、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和189，或
与SEQ ID NO：1相比，BZ转座酶在第189位、第208位和第216位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138、144和251，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在第189位、216位、第208位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、138、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137、138和144，或
与SEQ ID NO：1相比，所述BZ转座酶在第138位、第189位、216位、第208位和第251位上具有取代突变，同时在选自第5、21、22、35、38、56、61、71、73、110、125、134、137、144、186、188、204、215-218、217、218、235、79和120的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号；优选同时在以下位置中的一个或多个位置上具有取代突变：134、137和144，或
更优选地，所述BZ转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下突变的BZ转座酶：
G216A\H208V、
G216A\H208V\G189A、
G216A\H208V\K251T、
G216A\H208V\K251T\G189A、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R、
G216A\H208V\K251T\G189A\K134R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K134R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138R\K134R、
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\V144E、或
G216A\H208V\K251T\G189A\Q138K\K137T。
6.如权利要求2-5任一项所述的转座子系统，所述BZ酶与功能多肽形成融合转座酶，
优选地，
所述功能多肽为DNA序列特异性结合域和/或细胞核定位信号结构域，和/或
所述DNA序列特异性结合域包含CRISPR/Cas结构域、TALE域、锌指域、AAV Rep DNA结合域或其任意组合，和/或
所述细胞核定位信号结构域包括SV40 NLS、C-myc NLS、TAF1 NLS、TP53 NLS、STAT3NLS或其任意组合，和/或
所述BZ转座酶和所述DNA序列特异性结合域被连接体隔开。
7.如权利要求1所述的转座子系统，所述突变性的末端反向重复序列不含CpG基序，
优选地，所述末端反向重复序列与野生型末端反向重复序列SEQ ID NO:11或12相比，其中的CpG基序缺失或突变。
8.如权利要求7所述的转座子系统，所述的突变为将CpG基序突变为ApG、GpG、TpG、CpA或CpT，优选突变为TpG或CpA。
9.编码权利要求1-8任一项所述的转座子系统的多核苷酸分子，包括编码所述转座酶的多核苷酸，和/或含突变性的末端反向重复序列的转座子DNA；所述编码转座酶的多核苷酸包含编码权利要求2-5中任一项所述的BZ转座酶或权利要求6所述的融合转座酶的核酸序列或其互补序列，优选地，所述核酸序列是DNA或信使RNA。
10.如权利要求9所述多核苷酸分子的核酸构建物，所述核酸构建物是表达载体。
11.一种宿主细胞，包含权利要求1-8任一项所述的转座子系统，或权利要求9所述的多核苷酸分子或权利要求10所述的核酸构建物。
12.一种制备细胞的方法，包括：将权利要求1-8任一项所述的转座子系统，或权利要求9所述的多核苷酸分子或权利要求10所述的核酸构建物引入细胞中的步骤，
优选地，
所述引入包括使所述细胞与编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的多核苷酸分子接触，和/或
所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子DNA的核酸构建物接触，和/或
所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子和编码所述BZ转座酶或所述融合转座酶的多核苷酸的核酸构建物接触，和/或
所述引入包括使所述细胞与所述BZ转座酶或所述融合转座酶接触，和/或
所述细胞是免疫细胞。
13.一种试剂盒，其包含：权利要求1-8任一项所述的转座子系统、权利要求9所述的多核苷酸分子、权利要求10所述的核酸构建物、或权利要求11所述的细胞。
14.权利要求1-8任一项所述的转座子系统、权利要求9所述的多核苷酸分子、权利要求10所述的核酸构建物在制备产品中的用途，所述产品例如试剂盒、工程化的免疫细胞或药物组合物。
15.一种药物组合物，其包含药学上可接受的辅料和权利要求12所述的方法制备的细胞。
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