CN116920046A - 中草药发酵物的制备方法及改善皮肤状态的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中草药发酵物的制备方法，包含下述步骤。提供发酵基质，发酵基质包含中草药原料与水，且中草药原料由黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁、防风所组成。提供发酵菌液，发酵菌液包含酵母菌。进行发酵步骤，其混合发酵基质与发酵菌液，以得混合物，并将混合物进行培养而得发酵后产物。去除发酵后产物的固体成分，以得中草药发酵物。借此，可有效地萃取中草药原料的有效成分并保留其活性。另外，本发明同时提供一种包含中草药发酵物的改善皮肤状态的组合物。

Description

中草药发酵物的制备方法及改善皮肤状态的组合物

技术领域

本发明是关于一种发酵物的制备方法，特别是关于一种中草药发酵物的制备方法以及包含中草药发酵物的改善皮肤状态的组合物。

背景技术

根据古代药典记载，将多种不同的中药材混合后涂抹于脸上可具有去除粉刺、黑斑、面疱及细毛的效果，然而，传统中药在取用上较为困难，费用较为可观，且药材内的活性成分取得也较为不易。再者，常规的中药以煎煮方式萃取其有效成分，药材煎煮物的颜色较深且触感不佳，且萃取药材中的活性成分时所需耗用的资源甚多，萃取效率也不甚理想，致使运用中药材的美容品、化妆品并不普及，目前也鲜少有针对中药古方应用于化妆品的功效研究。

因此，如何提供一种能将中药材有效地应用于美容护肤的相关领域的策略，实为相关学界及业界所致力发展的目标。

发明内容

本发明的一态样在于提供一种中草药发酵物的制备方法，包含下述步骤。提供发酵基质，其中所述的发酵基质包含中草药原料与水，所述的中草药原料由黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁、防风所组成。提供发酵菌液，其中所述的发酵菌液包含酵母菌。进行发酵步骤，其混合发酵基质与发酵菌液，以得混合物，并将所述的混合物于20℃至50℃培养10小时至50小时，以得发酵后产物。去除发酵后产物的固体成分，以得中草药发酵物。

依据前述实施方式的中草药发酵物的制备方法，其中所述的中草药原料可呈干粉型式，且基于中草药原料为10wt％，黄耆的含量可为10～20wt％、白术的含量可为10～2wt％、白蔹的含量可为10～20wt％、黄精的含量可为15～30wt％、川芎的含量可为15～30wt％、杏仁的含量可为8～15wt％，防风的含量可为8～15wt％。

依据前述实施方式的中草药发酵物的制备方法，其中酵母菌可为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。

依据前述实施方式的中草药发酵物的制备方法，其中于所述的发酵基质中，每100mL的水中可含有1.15～20g的中草药原料。

依据前述实施方式的中草药发酵物的制备方法，其中所述的发酵菌液的浓度可为10⁵CFU/mL至10⁸CFU/mL，且于所述的混合物中，每10g的中草药原料可含有5～32mL的发酵菌液。

依据前述实施方式的中草药发酵物的制备方法，其中所述的中草药发酵物的pH值可为4.5至6.8。

依据前述实施方式的中草药发酵物的制备方法，可还包含灭菌步骤，其对发酵后产物进行灭菌处理，且所述的固体成分可利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除。

本发明的另一态样是在于提供一种改善皮肤状态的组合物，包含有效剂量的中草药发酵物，其中所述的中草药发酵物利用如前段所述的中草药发酵物的制备方法所制得。

依据前述实施方式的改善皮肤状态的组合物，其中所述的改善皮肤状态的组合物可具有抗氧化活性。

依据前述实施方式的改善皮肤状态的组合物，其中所述的改善皮肤状态的组合物可用以提高皮肤的保湿能力及/或调理皮肤的皮脂分泌能力。

借此，本发明的中草药发酵物的制备方法采用酵母菌对由黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁、防风所组成的中草药原料进行发酵，可有效地萃取黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁、防风的有效成分并保留其活性，避免传统的萃取方法所造成的活性成分流失及有机溶剂的危害，进而使本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物可应用于改善皮肤状态的组合物或其他化妆品中，并具有抗氧化、保湿及调理皮肤的皮脂分泌能力等功效，使本发明的中草药发酵物的制备方法及改善皮肤状态的组合物具有优异的市场应用潜力。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1为绘示本发明的中草药发酵物的制备方法的步骤流程图；

图2为本发明的中草药发酵物的羟自由基清除能力的分析图；

图3为本发明的中草药发酵物的改善肌肤含水量的分析结果图；

图4为本发明的中草药发酵物的皮脂调理效果的分析结果图；

图5A为本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果的一试验影像；

图5B为本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果的另一试验影像；以及

图6为本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果的分析结果图。

具体实施方式

下述将更详细讨论本发明各实施方式。然而，此实施方式可为各种发明概念的应用，可被具体实行在各种不同的特定范围内。特定的实施方式是仅以说明为目的，且不受限于揭露的范围。

[本发明的中草药发酵物的制备方法]

请参照图1，其为绘示本发明的中草药发酵物的制备方法100的步骤流程图。中草药发酵物的制备方法100包含步骤110、步骤120、步骤130以及步骤140。

步骤110为提供发酵基质，其中发酵基质包含中草药原料与水，所述的中草药原料由黄耆(Astragalus membranaceus)、白术(Atractylodes macrocephala)、白蔹(Ampelopsis japonica)、黄精(Polygonatum sibiricum)、川芎(Ligusticum striatum)、杏仁(Prunus Amygdalus)、防风(Saposhnikovia divaricata)所组成。详细而言，本发明的中草药原料的成分灵感来自于四库全书的《普济方》的药方“泽润芳”，其中黄耆又称黄芪，其具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌等功效；白术具有补气健脾、燥湿利水、止汗、安胎等功效；白蔹具有清热解毒、消痈散结、生肌止痛等功效；黄精具有滋肾润肺、补脾益气等功效；川芎具有活血行气、祛风止痛等功效；杏仁又称苦扁桃籽，其具有止咳平喘、润肠通便等功效；而防风则具有发表散风、胜湿止痛、止痉、止泻等功效。

再者，本发明的中草药原料可呈干粉型式，且基于中草药原料为100wt％，黄耆的含量可为10～20wt％、白术的含量为10～20wt％、白蔹的含量可为10～20wt％、黄精的含量可为15～30wt％、川芎的含量可为15～30wt％、杏仁的含量可为8～15wt％，而防风的含量可为8～15wt％。详细而言，本发明的中草药原料在进行后续步骤前可先进行干燥及研磨步骤，使其呈现干粉的型式而增加反应面积，其中干燥的方法可为晒干法、阴干法、烘干法、真空冻干法、远红外光干燥法或微波干燥法，而研磨的方法则可利用研钵、研杵或粉碎机等研磨器具进行，但本发明并不以此为限。具体而言，本发明的干燥方法可以70℃至80℃进行烘干，以获得粒径为30目至80目的干粉。较佳地，干粉的粒径可为70目，以利于后续操作。

再者，在所述的发酵基质中，每100mL的水中可含有1.15～20g的中草药原料。或者，在所述的发酵基质中，每100mL的水中可含有5g的中草药原料。或者，在所述的发酵基质中，每300mL的水中可含有3～20g的中草药原料。

步骤120为提供发酵菌液，其中所述的发酵菌液包含酵母菌。详细而言，酵母菌可代谢发酵基质中的蛋白质、脂质及淀粉，从而获得富含多糖、氨基酸或其他特定成分及特定比例的发酵物。再者，本发明所使用的酵母菌可为但不限于任何品系的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或其他品种的酵母菌。较佳地，本发明所使用的酵母菌可为2021年03月16日寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，寄存编号为CGMCCNo.22020的酿酒酵母菌C-LYE-6。酿酒酵母菌C-LYE-6的菌落为点状，菌落表面边缘光滑，菌落颜色呈不透明的乳白色，且酵母菌以单细胞形式存在。较佳地，发酵菌液的浓度可为10⁵CFU/mL至10⁸CFU/mL，但本发明并不以此为限。

步骤130为进行发酵步骤，其混合所述的发酵基质与所述的发酵菌液，以得混合物，并将混合物于20℃至50℃培养10小时至50小时，以得发酵后产物。详细而言，在上述温度范围下，酵母菌具有最佳的发酵效率。若发酵时间过短，将使中草药原料的有效成分无法充分释出；反之，若发酵时间过长，则可能使其他杂菌滋生而影响发酵的品质。较佳地，混合物可于25℃培养40小时，但本发明并不以此为限。

再者，于所述的混合物中，每10g的中草药原料可含有5～32mL的发酵菌液，但本发明并不以此为限。或者，于所述的混合物中，每10g的中草药原料可含有28mL的发酵菌液。或者，于所述的混合物中，发酵菌液与中草药原料的混合比例可为5～10mL:2～20g。

步骤140为去除发酵后产物的固体成分，以得中草药发酵物。详细而言，在经过步骤110至步骤130的处理后，黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁与防风的有效成分已全数进入发酵后产物中，而在将发酵后产物中的固体成分去除后，余下的液体成分即为本发明的中草药发酵物，其中中草药发酵物的pH值可为4.5至6.8，粘度可为100cP至800cP，并可含有1.0wt％至5.0wt％的可溶性固形物，且每毫升的中草药发酵物可包含1.0～5.0mg的蛋白质、5.0～10.0mg的总多糖、1.0～1.8mg总黄酮及0.1～0.6mg的总酚。

另外，本发明的中草药发酵物的制备方法100可还包含灭菌步骤，其对发酵后产物进行灭菌处理。详细而言，固体成分可利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除，灭菌步骤可为高压蒸汽处理、干热处理或紫外线处理，但本发明并不以此为限。具体而言，发酵后产物可利用离心转速为4000rpm至12000rpm的条件离心15分钟至30分钟后收集上清液，所述的上清液即为本发明的中草药发酵物。或者，发酵后产物可利用离心转速为4500rpm的条件离心20分钟。

借此，本发明的中草药发酵物的制备方法100采用酵母菌对本发明的中草药原料进行发酵，不仅可有效地萃取黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁与防风的有效成分并保留其活性，还可缩短发酵的时间而避免长时间发酵造成的杂菌污染问题。再者，本发明的中草药发酵物的制备方法100在萃取过程中不添加任何有机试剂，可避免传统的萃取方法所造成的活性成分流失及有机溶剂残留的危害，且萃取而得的中草药发酵物没有现有的中草药萃取物的色泽过深的问题，进而使本发明的中草药发酵物的制备方法100所制得的中草药发酵物具有良好的生物安全性与市场美感，而具有优异的市场应用潜力。

[本发明的改善皮肤状态的组合物]

本发明的改善皮肤状态的组合物包含有效剂量的本发明的中草药发酵物。中草药发酵物以本发明的中草药发酵物的制备方法所制得并具有抗氧化活性与提高皮肤的保湿能力、调理皮肤的皮脂分泌能力的效果，是以本发明的改善皮肤状态的组合物具有优异的抗氧化、保湿、控油等功效而具有绝佳的市场应用潜力。

另外，本发明的改善皮肤状态的组合物的剂型可为液剂、乳剂、霜剂、安瓿、胶囊、丸剂、锭剂、粉末、颗粒或凝胶，并可应用于乳液、化妆水、精华液、隔离霜、洗面奶、面膜或防晒乳上，但本发明并不以此为限。

[实施例与比较例]

一、本发明的中草药发酵物

以下将以实施例1至实施例4的中草药发酵物说明本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物的性质，并进一步分析其抗氧化活性以及应用于皮肤保湿、调理皮肤的皮脂分泌能力等效果，而实施例1至实施例4的中草药发酵物的制备原料请参表一。

实施例1至实施例4的中草药发酵物是以下述步骤制得。首先，将自中药房购得的黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁与防风于75±5℃的烘箱中分别进行烘干处理，再利用粉碎机进行研磨而得大小为50目的中草药干粉，并将15g的中草药干粉及300mL的水混合成悬浮液后作为本发明的发酵基质，以和包含酵母菌的发酵菌液混合进行发酵。

在将酵母菌用于进行发酵之前将先进行预处理步骤。在预处理步骤方面，首先将酿酒酵母菌C-LYE-6接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)中并于30℃的培养箱中活化，而后挑选单一菌落进行后续的扩增，并以马铃薯葡萄糖琼脂培养水溶液(potato dextrose water,PDW)于20℃至35℃的条件进行液态培养至OD值＝0.5～1.0，此时的酵母菌将处于对数期而具有较佳的活性，即可用于后续的发酵。

接着，将5mL扩增培养后的发酵菌液接种至发酵基质中并均匀混合后，于25℃的培养箱中培养40小时，而后将所得的发酵后产物以121℃、1.1kg/cm²的高压蒸气进行灭菌，再将灭菌后的发酵后产物以4500rpm、离心半径为9公分的条件离心20分钟后收集上清液，此上清液即为本发明的中草药发酵物。

实施例1至实施例4的中草药发酵物在外观上呈现无色至棕色的液体且触感佳，而利用现有的酸碱度或粘度测定法(如酸碱度计定法及旋转粘度测定计)测得其pH值为4.5至6.8，粘度为100cP至800cP并含有0.9～2.0wt％的可溶性固形物，且无致病菌检出，具有高度的生物安全性而符合化妆品的品质要求。

二、本发明的中草药发酵物的成分分析

本试验是利用高效液相层析(HPLC)并参照试验方法GB/T 30483-2013来分析实施例1至实施例4的中草药发酵物的成分。而由高效液相层析的结果显示，每毫升的实施例1至实施例4的中草药发酵物皆含有1.0～5.0mg的蛋白质、5.0～10.0mg的总多糖、1.0～1.8mg总黄酮及0.1～0.6mg的总酚。再者，由于实施例1至实施例4的中草药发酵物是以相同的制造方法所制得，其差异仅在于中草药原料中的各组份比例与发酵菌液的浓度不同，且实施例1至实施例4的中草药发酵物的蛋白质、总多糖、总黄酮及总酚含量相仿，故以下仅以实施例1的中草药发酵物进行后续的不同有效成分的含量及其效果的分析，以说明本发明的中草药发酵物应用于改善皮肤状态的组合物的效果，特此叙明。

另外，以下的试验可同时包含比较例1与比较例2。比较例1是以本发明的中草药发酵物的制备方法进行发酵物的制备(以下称为“比较例1的中草药发酵物”)，其差异仅在于比较例1的中草药原料中各成分的比例与实施例1并不相同，而比较例1的中草药原料中各成分的比例请参表二。比较例2以传统的煎煮方式处理本发明的中草药原料而未经过任何发酵步骤(以下称为“比较例2的中草药水萃物”)，且比较例2的中草药原料成分比例与实施例1相同，以进一步分析以本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物的有效成分含量。

1.本发明的中草药发酵物的蛋白质含量分析

在经过高效液相层析分析实施例1至实施例4的中草药发酵物的成分后，本试验进一步分析实施例1与比较例1在蛋白质含量方面的差异。

在实验方面，首先精密量取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的牛血清蛋白标准溶液分别置于10mL的试管中并分别加水补至1.0mL，并于试管中加入1.0mL的碱性铜试液摇匀后于室温放置10分钟。接着，加入4.0mL的福林酚试液(2mol/L酸浓度)混匀并于室温放置30分钟后，使用分光光度计测量于波长650nm的吸光值，并依据所得数值绘制标准曲线。接着，量取1mL的实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物分别置于10mL的试管中，依照制备标准曲线时的实验方式进行实验并测定波长650nm的吸光值，并根据标准曲线换算为样品中蛋白质的浓度。

请参照表三，其为实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物的蛋白质含量分析结果。由表三的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有1.706mg的蛋白质，相较于比较例1的中草药发酵物的蛋白质含量为1.404mg为佳。

2.本发明的中草药发酵物的多糖含量分析

在经过高效液相层析分析实施例1至实施例4的中草药发酵物的成分后，本试验进一步分析实施例1与比较例1在多糖含量方面的差异。

在实验方面，首先精密量取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的葡萄糖标准溶液(90μg/mL)分别置10mL的试管中并分别加水补至1.0mL，并于试管中加入1mL的5％苯酚溶液摇匀后，再加入5mL的浓硫酸摇匀后于沸水中水浴20分钟。接着，将样品冰浴冷却5分钟后使用分光光度计测量于波长488nm的吸光值，并依据所得数值绘制标准曲线。接着，量取1mL的实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物分别置于10mL的试管中，进一步依照制备标准曲线时的实验方式进行实验而测定波长488nm的吸光值，并根据前述的标准曲线以及式(I)换算为样品中多糖的含量，式(I)如下。

其中m₁为标准曲线对应的样品测定液中的含糖量(μg)，V₁为样品的定容体积(mL)，V₂为比色测定时所移取的样品测定液的体积(mL)，而m₂则为样品的取样量(g)。

请参照表四，其为实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物的多糖含量分析结果。由表四的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有7.069mg的多糖，相较于比较例1的中草药发酵物的多糖含量为4.629mg为佳。

3.本发明的中草药发酵物的总酚含量分析

在经过高效液相层析分析实施例1至实施例4的中草药发酵物的成分后，本试验进一步分析实施例1与比较例1在总酚含量方面的差异。

在实验方面，首先以去离子水进行稀释而配制浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的没食子酸溶液，以作为标准曲线之用，并另配置7.5％的Na₂CO₃溶液作为实验试剂。接着，取1mL的实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物分别与5mL的10mol/L％的福林酚试剂混合均匀后，再加入4mL的7.5％Na₂CO₃混合均匀，于室温下避光静置1小时后，使用分光光度计测定其于波长765nm的吸光值，并将所得数据依标准曲线换算成没食子酸的当量，而后依照式(II)计算总酚含量，式(II)如下：

X＝C×10×n 式(II)；

其中X为样品中总酚的含量(mg/L)，C为由标准曲线计算而得的待测液中总酚的含量(mg/L)，而n则为样品的稀释倍数。

请参照表五，其为实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物的总酚含量分析结果。由表五的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有0.422mg的总酚，相较于比较例1的中草药发酵物的总酚含量为0.235mg为佳。

4.本发明的中草药发酵物的氨基酸含量分析

在经过高效液相层析分析实施例1至实施例4的中草药发酵物的成分后，本试验进一步分析实施例1与比较例1在氨基酸含量方面的差异。

在实验方面，首先精密量取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的氨基酸标准溶液(相当于0μg、40μg、80μg、120μg、160μg、200μg的氨基酸)分别置于25mL的试管中并加水补至4mL，再分别加入1mL的2％茚三酮溶液和磷酸盐缓冲液(pH＝8.04)摇匀后于沸水中水浴15分钟。接着，将样品冰浴冷却至室温并静置15分钟后，使用分光光度计测量于波长570nm的吸光值，并依据所得数值绘制标准曲线。接着，量取1mL的实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物分别置于25mL的试管中，依照制备标准曲线时的实验方式进行实验而测定波长570nm的吸光值，并根据标准曲线以及式(III)换算为样品中氨基酸的含量，式(III)如下。

其中C₁为从标准曲线上查得样品的氨基酸的量(μg)，C₀为从标准曲线上查得空白样本的数值(μg)，V为移取样品溶液的量，而m则为样品量(g)。

请参照表六，其为实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物的氨基酸含量分析结果。由表六的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有0.671mg的氨基酸，相较于比较例1的中草药发酵物的氨基酸含量为0.293mg为佳。

5.本发明的中草药发酵物的总黄酮含量分析

在经过高效液相层析分析实施例1至实施例4的中草药发酵物的成分后，本试验进一步分析实施例1与比较例1在总黄酮含量方面的差异。

在实验方面，首先精密吸取0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL的芦丁标准储备液(纯度≥90.0％)分别置于25mL容量瓶中并加水至6mL，接着依序加入1mL的5％亚硝酸钠溶液(静置反应6分钟)、1mL的10％硝酸铝溶液(静置反应6分钟)与10mL的4.3％氢氧化钠试液(静置反应15分钟)后，以配制浓度为0.0μg/mL、8.0μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL、40μg/mL、48μg/mL的芦丁溶液，以作为标准曲线之用，并另配制10％的硝酸铝溶液作为实验试剂。接着，分别取2mL的实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物并加水至6mL，接着依序加入1mL的5％亚硝酸钠溶液(静置反应6分钟)、1mL的10％硝酸铝溶液(静置反应6分钟)与10mL的4.3％氢氧化钠试液(静置反应15分钟)后，使用分光光度计测定其于波长510nm的吸光值，并将所得数据依标准曲线换算成芦丁的当量，而后依照式(IV)计算总黄酮含量，式(IV)如下：

其中X为样品中总黄酮的含量(g/100mL或g/100mL)，C为由标准曲线计算而得的待测样品溶液的总黄酮浓度(mg/mL)，V₁为试样定容体积(mL)，V₂为吸取试样溶液体积(mL)，V₃为显色定容体积(mL)，而M则为试样取样量(g或mL)。

请参照表七，其为实施例1的中草药发酵物与比较例1的中草药发酵物的总黄酮含量分析结果。由表七的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有0.197mg的总黄酮，相较于比较例1的中草药发酵物的总黄酮含量为0.104mg为佳。

6.本发明的中草药发酵物的麸胱甘肽含量分析

麸胱甘肽(glutathione)又称谷胱甘肽或麸氨基硫，其是由麸氨酸、半胱氨酸及甘氨酸等3种氨基酸所组成的小分子蛋白质，为人体的抗氧化酵素谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione Peroxidase,GPx)的重要成分，可帮助人体细胞对抗自由基，降低疾病的产生。因此，本试验进一步以高效液相层析分析实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的麸胱甘肽含量，而分析麸胱甘肽含量的高效液相层析的检测条件列示于表八。

请参照表九，其为实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的麸胱甘肽含量分析结果。由表九的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有10.94μg的麸胱甘肽，相较于比较例2的中草药水萃物的麸胱甘肽含量具有30％的提升。

7.本发明的中草药发酵物的鞣花酸含量分析

鞣花酸(Ellagic acid)是存在于众多水果和蔬菜中的天然酚类抗氧化剂，尤以黑莓、草莓、石榴、枸杞、覆盆子、白橡实、蔓越莓、山核桃等植物的果实中含量最为丰富，而鞣花酸的抗癌细胞增生与抗氧化活性使其广泛的被应用于各领域中。因此，本试验进一步以高效液相层析分析实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的鞣花酸含量，而分析鞣花酸含量的高效液相层析的检测条件列示于表十。

请参照表十一，其为实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的鞣花酸含量分析结果。由表十一的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有245.281μg的鞣花酸，相较于比较例2的中草药水萃物的鞣花酸含量具有86.19％的提升。

8.本发明的中草药发酵物的阿魏酸含量分析

阿魏酸(Ferulic acid)是桂皮酸的衍生物之一，是存在于植物细胞壁中的一种丰富的酚类，其具有清除自由基、抑制酪氨酸酶活性等功效。因此，本试验进一步以高效液相层析分析实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的阿魏酸含量，而分析阿魏酸含量的高效液相层析的检测条件列示于表十二。

请参照表十三，其为实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的阿魏酸含量分析结果。由表十三的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有2.667μg的阿魏酸，相较于比较例2的中草药水萃物的阿魏酸含量具有71.62％的提升。

9.本发明的中草药发酵物的升麻素苷含量分析

研究显示，防风等药材中的升麻素苷(prim-O-glucosylcimifugin)具有解热、镇痛、抗炎、消肿、抗血小板凝结等作用，是以本试验进一步以高效液相层析分析实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的升麻素苷含量，而分析升麻素苷含量的高效液相层析的检测条件列示于表十四。

请参照表十五，其为实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的升麻素苷含量分析结果。由表十五的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有6.289μg的升麻素苷，相较于比较例2的中草药水萃物的升麻素苷含量具有73.44％的提升。

10.本发明的中草药发酵物的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分析

黄耆包含有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷(calycosin-7-glucoside)，使其具有补气、脱毒、生肌、利水的功效，是以本试验进一步以高效液相层析分析实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，而分析毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的高效液相层析的检测条件列示于表十六。

请参照表十七，其为实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分析结果。由表十七的内容可知，每毫升的实施例1的中草药发酵物含有131.254μg的毛蕊异黄酮葡萄糖苷，相较于比较例2的中草药水萃物的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量具有56.92％的提升。

由上述结果可见，本发明的中草药发酵物的制备方法相较于传统的萃取方法可更有效地萃取本发明的中草药原料中所含有的麸胱甘肽、鞣花酸、阿魏酸、升麻素苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷，并可有效保留其活性，进而使本发明的中草药发酵物的制备方法所制备的中草药发酵物具有优异的市场应用潜力。

三、本发明的中草药发酵物的抗氧化活性分析

本试验是利用芬顿(Fenton)反应中过氧化氢及亚铁离子反应所产生的羟自由基，并通过水杨酸捕获前述反应所产生的羟自由基而产生紫色产物的特性来测量本发明的中草药发酵物清除羟自由基的能力。详细而言，由于前述的紫色产物对波长为510nm的光线具有较大吸光值，若本发明的中草药发酵物具有抗氧化功效，在将其加入含有过氧化氢、亚铁离子及水杨酸的反应溶液后，可降低反应溶液对波长为510nm的光线的吸光值，并可借此评估本发明的中草药发酵物的抗氧化活性。

在实验方面分别取体积百分浓度为10％、15％、20％、25％与30％的实施例1的中草药发酵物和与比较例2的中草药水萃物与9mmol/L的FeSO₄、8.8mmol/L的H₂O₂和9mmol/L的水杨酸乙醇溶液混合后，于37℃下水浴15分钟并以分光光度计测量各样本于波长为510nm的吸光值，并依照以下述式(V)计算羟自由基的清除率：

X％＝[1-(AU/AU₀)]×100％ 式(V)；

其中X％表示羟自由基清除率，AU表示实施例1的相对吸光值，AU₀则表示比较例2的相对吸光值。

再者，本试验也包含对照例1与对照例2，其中对照例1与对照例2的吸光值是分别用以做为实施例1及比较例2的空白(blank)背景值，以排除呈色反应以外的因素所造成的吸光值变化，从而获得标准化后的相对吸光值。而实施例1、比较例2、对照例1与对照例2用以进行试验的试剂配比请参表十八。

请参照图2，其为本发明的中草药发酵物的羟自由基清除能力的分析图。如图2所示，随着体积百分浓度的增加，实施例1的中草药发酵物的羟自由基清除率逐渐提升，而当实施例1的中草药发酵物的体积百分浓度为30％时，其羟自由基清除率为18.60％，相较于相同浓度的比较例2的中草药水萃物具有较佳的表现，可见本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物相较于传统的萃取方法所制得的萃取物具有较佳的抗氧化功效，并有潜力应用于改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中而具有相关市场的应用潜力。

四、本发明的中草药发酵物的保湿能力评估

本试验是利用经皮水分散失量(trans-epidermal water loss，TEWL)做为皮肤表层含水量的指标，以评估实施例1的中草药发酵物的保湿能力。另外，本试验同样包含前述的比较例2的中草药水萃物，以进一步评估以本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物的保湿效果。

在实验方面，首先在3位受试者的手臂皮肤设定对照区域及实验区域(各为3cm×3cm)，并利用市售的经皮水分散失测定仪TM300(Courage+Khazaka Electronic)检测对照区域与实验区域的皮肤的经皮水分散失量。接着，将使用量为2.0±1.0mg/cm²的实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物单次涂抹于实验区域的皮肤上，但不对对照区域的皮肤进行任何处理，并于测试前、使用后第1天、使用后第5天、使用后第7天及使用后第14天测量经皮水分散失量，并将所测得的数据以对照区域的经皮水分散失量数据进行校正而得皮肤含水量的评估结果。

请参照图3，其为本发明的中草药发酵物的改善肌肤含水量的分析结果图。如图3所示，在使用后第1天、使用后第5天、使用后第7天及使用后第14天，受试者使用实施例1的中草药发酵物后的皮肤水分含量皆明显高于比较例2的皮肤水分含量，显示使用实施例1的中草药发酵物后的经皮水分散失量较少。由此可见，本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物具有优异保湿功效并可提高皮肤的保湿能力，并有潜力应用于改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中而具有相关市场的应用潜力。

五、本发明的中草药发酵物的皮脂调理效果分析

本试验是测试施用实施例1的中草药发酵物后的皮肤油脂含量而评估其调理皮肤的皮脂分泌能力的效果。另外，本试验同样包含前述的比较例2的中草药水萃物，以进一步评估以本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物的皮脂调理效果。

在实验方面，首先在3位受试者的额头皮肤设定对照区域及实验区域(各为3cm×3cm)，并利用市售的皮肤油脂测试仪Sebumeter SM300(Courage+Khazaka Electronic)检测对照区域与实验区域的皮肤的油脂含量。接着，将使用量为2.0±1.0mg/cm²的实施例1的中草药发酵物与比较例2的中草药水萃物单次涂抹于实验区域的皮肤上，但不对对照区域的皮肤进行任何处理，并于测试前、使用后第1天、使用后第5天、使用后第7天及使用后第14天测量皮肤的油脂含量，并将所测得的数据以对照区域的皮肤的油脂含量数据进行校正而得皮肤的油脂含量差值的结果。

请参照图4，其为本发明的中草药发酵物的皮脂调理效果的分析结果图。如图4所示，在使用后第5天、使用后第7天及使用后第14天，受试者使用实施例1的中草药发酵物后的皮肤油脂含量差值明显低于比较例2的皮肤油脂含量差值，显示实施例1的中草药发酵物在施用于皮肤后具有较佳的皮脂调理效果，并可有效地调理皮肤的皮脂分泌能力，并有潜力应用于改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中而具有相关市场的应用潜力。

六、本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果评估

本试验是将实施例1的中草药发酵物涂抹于3位受试者的皮肤上，以观察其上的红血丝的消退情形而评估本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果。

在实验方面，首先在3位受试者的手臂皮肤设定实验区域(各为3cm×3cm)，并将使用量为2.0±1.0mg/cm²的实施例1的中草药发酵物涂抹于实验区域的皮肤上，每日涂抹2次并持续14天，并拍摄测试前与使用后第14天的皮肤影像及根据所得影像计算其红血丝平均值。

请参照图5A、图5B、图6与表十九，其中图5A为本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果的一试验影像，图5B为本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果的另一试验影像，图6为本发明的中草药发酵物的抗敏舒缓效果的分析结果图，表十九则记录受试者1与受试者2在未使用实施例1的中草药发酵物与使用14天后的红血丝平均值，以及受试者3在未使用实施例1的中草药发酵物与使用7天、14天后的红血丝平均值。

由图5A、图5B、图6与表十九的内容可见，在使用实施例1的中草药发酵物14天后，受试者2与受试者3的皮肤红肿现象明显消退，其红血丝平均值也明显降低，且3位受试者的皮肤红血丝平均降低8.2％，显示本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物具有相当的抗敏舒缓效果，并有潜力应用于改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中而具有相关市场的应用潜力。

七、本发明的中草药发酵物的安全性评估

本试验是利用封闭式贴布试验(Closed Patch Test)评估实施例1的中草药发酵物对皮肤的潜在刺激性，以确认本发明的中草药发酵物应用于人体的安全性。在实验方面，首先将0.2mL至0.25mL的实施例1的中草药发酵物滴加于滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器中备用。在受试者方面，随机选择年龄为18岁至60岁共30位受试者，并以无刺激性的胶带于每位受试者的背部固定2个斑试器，使斑试器中的滤纸片贴附于受试者的背部皮肤上24小时，在试验期间内不移除斑试器，也尽量避免斑试器沾染汗液或水。另外，每个试验组别皆对应设定控制组，控制组以0.20mL至0.25mL的蒸馏水进行测试。在测试24小时后取下斑试器，并分别于取下斑试器30分钟后、24小时后及48小时后观察斑试器下的皮肤(以下称为“受试区域”)及受试区域周围的皮肤是否出现红斑、浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等过敏或发炎的症状。

请参照表二十，其为实施例1的中草药发酵物的安全性测试结果。安全性测试结果共分五个等级，其中图号“-”代表受试区域为阴性反应而未有任何过敏或发炎的症状，图号“±”代表受试区域出现可疑反应(如：具有轻微的红斑)，图号“+”代表受试区域出现弱阳性反应(也称为红斑反应，即出现红斑、浸润、水肿及/或丘疹)，图号“++”代表受试区域出现强阳性反应(也称为疱疹反应，即出现红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，且疱疹反应超出受试区域以外的皮肤)，图号“+++”代表受试区域出现极强阳性反应(也称为融合性疱疹反应，即出现明显红斑、严重浸润、水肿、融合性丘疹，且融合性疱疹反应超出受试区域以外的皮肤)。另外，于表二十中同时计算反应程度为阳性反应(即图号为+、++与+++)的人数，以更清楚确认本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物的人体安全性。

如表二十所示，在取下斑试器30分钟后、24小时后或48小时后，受试者在受试区域及其周围的皮肤皆无红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹及融合性疱疹等反应，显示本发明的中草药发酵物的制备方法所制得的中草药发酵物具有优异的生物安全性，并具有相关市场的应用潜力。

需补充的是，本发明虽以特定的菌株、特定的材料、特定的比例、特定的工艺、特定的分析方法或特定仪器做为例示，以说明本发明的中草药发酵物具有抗氧化、保湿、调理皮肤的皮脂分泌能力等功效，惟本发明所属技术领域中技术人员可知，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的中草药发酵物的成分与功效也可使用其他的菌株、其他的材料、其他的比例、其他的工艺、其他分析方法或其他仪器进行分析，且本发明并不以此为限。

综上所述，本发明的中草药原料由黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁、防风所组成，而上述药材在经本发明的中草药发酵物的制备方法以酵母菌进行发酵后可得含有高浓度的活性成分的中草药发酵物，且前述的有效成分在彼此协同作用下具有优异的抗氧化、保湿、调理皮肤的皮脂分泌能力等功效，并具有绝佳的生物安全性而可应用于改善皮肤状态的组合物中，具有优异的市场应用潜力。

虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

【符号说明】

100:中草药发酵物的制备方法

110,120,130,140:步骤。

Claims (10)

1.一种中草药发酵物的制备方法，其特征在于，包含：

提供发酵基质，其中该发酵基质包含中草药原料与水，该中草药原料由黄耆、白术、白蔹、黄精、川芎、杏仁、防风所组成；

提供发酵菌液，其中该发酵菌液包含酵母菌；

进行发酵步骤，其混合该发酵基质与该发酵菌液，以得混合物，并将该混合物于20℃至50℃培养10小时至50小时，以得发酵后产物；以及

去除该发酵后产物的固体成分，以得中草药发酵物。

2.根据权利要求1所述的中草药发酵物的制备方法，其特征在于，该中草药原料呈干粉型式，且基于该中草药原料为100wt％，该黄耆的含量为10～20wt％、该白术的含量为10～20wt％、该白蔹的含量为10～20wt％、该黄精的含量为15～30wt％、该川芎的含量为15～30wt％、该杏仁的含量为8～15wt％，该防风的含量为8～15wt％。

3.根据权利要求1所述的中草药发酵物的制备方法，其特征在于，该酵母菌为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。

4.根据权利要求1所述的中草药发酵物的制备方法，其特征在于，于该发酵基质中，每100mL的该水中含有1.15～20g的该中草药原料。

5.根据权利要求1所述的中草药发酵物的制备方法，其特征在于，该发酵菌液的浓度为10⁵CFU/mL至10⁸CFU/mL，且于该混合物中，每10g的该中草药原料含有5～32mL的该发酵菌液。

6.根据权利要求1所述的中草药发酵物的制备方法，其特征在于，该中草药发酵物的pH值为4.5至6.8。

7.根据权利要求1所述的中草药发酵物的制备方法，其特征在于，还包含：

灭菌步骤，其对该发酵后产物进行灭菌处理，且该固体成分利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除。

8.一种改善皮肤状态的组合物，其特征在于，包含：

有效剂量的中草药发酵物，其中该中草药发酵物利用根据权利要求1至7任一项的制备方法所制得。

9.根据权利要求8所述的改善皮肤状态的组合物，其特征在于，该改善皮肤状态的组合物具有抗氧化活性。

10.根据权利要求8所述的改善皮肤状态的组合物，其特征在于，该改善皮肤状态的组合物用以提高皮肤的保湿能力及/或调理皮肤的皮脂分泌能力。