CN1168729C

CN1168729C - 用海藻制备脱镁叶绿素甲酯一酸a和脱镁叶绿素c的方法

Info

Publication number: CN1168729C
Application number: CNB011428120A
Authority: CN
Inventors: 孟继武; 郑荣儿; 孟广昱
Original assignee: Ocean University of Oingdao
Current assignee: Ocean University of Oingdao
Priority date: 2001-12-22
Filing date: 2001-12-22
Publication date: 2004-09-29
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: CN1428342A

Abstract

一种用海藻制备脱镁叶绿素甲酯一酸A和脱镁叶绿素C的方法，包括将原料磨浆，用有机溶剂水溶液提取，然后将叶绿素A、C分离，用酸处理，得到脱镁绿素A溶液和脱镁叶绿素C溶液，再用液相酸度梯度法处理脱镁叶绿A溶液，得到脱镁叶绿素甲酯一酸A，其特征是所述的原料为海藻，提取后用油水分离的方法将叶绿素C分出。本发明能够得到高纯度的Pha、Phc，方法简便、节省试剂，经济效益是常规法的十倍以上。

Description

用海藻制备脱镁叶绿素甲酯一酸A和脱镁叶绿素C的方法

技术领域

本发明涉及一种用海藻制备脱镁叶绿素甲酯一酸A和脱镁叶绿素C的方法。

背景技术

叶绿素A(Chlorophyll A，Chla)是天然无毒的绿色食用色素，脱镁叶绿素甲酯一酸A(Pheophorbide A，Pha)是一种新的激光化学方法治疗恶性肿瘤的高效光敏化药剂，将Pha静脉注射入患者体内，24小时后主要潴留在肿瘤组织，用激光照射肿瘤部位时，由于Pha的敏化，肿瘤组织中的氧被激发成为单态¹O₂，单态¹O₂具有很强的氧化能力，可以定向杀死肿瘤细胞达到不损伤正常细胞而治愈肿瘤的目的。叶绿素C(Chlorophyll C，Chlc)是天然无毒的黄色食用色素，脱镁叶绿素C(Pheophytine C，Phc)不仅是黄色食用色素，而且亦是一种新的激光化学方法治疗恶性肿瘤的高效光敏化药剂，其药理同Pha。目前国际上采用层析技术从高等绿色植物和蕨类植物中提取Chla，然后用酸或酶脱去Chla的叶绿醇尾制得Pha。但这些植物中均含有叶绿素B(Chlb)，用CHO取代Chla噗啉环上第17位的CH₃就是Chlb。由于Chla与Chlb的化学结构很相似，因此将其分离开比较困难，要得到高纯度的Chla，需要大量的试剂进行层析，费时、费力、费资金、效益低。

发明内容

本发明的目的是提供一种用海藻制备叶绿素a、叶绿素C、脱镁叶绿素甲酯一酸A和脱镁叶绿素C的方法，它能弥补现有技术的上述不足。

一种用海藻制备脱镁叶绿素甲酯一酸A和脱镁叶绿素C的方法，包括将原料磨浆，用有机溶剂水溶液提取，然后将叶绿素A、C分离，用酸处理，得到脱镁绿素A溶液和脱镁叶绿素C溶液，再用液相酸度梯度法处理脱镁叶绿A溶液，得到脱镁叶绿素甲酯一酸A，其特征是所述的原料为海藻，提取后用油水分离的方法将叶绿素C分出；所述的海藻为褐藻、硅藻、双鞭甲藻。

本发明由于选取的原料不含叶绿素B而含有chlc，而且Chla是酯溶性的，Chlc是水溶性的，因此很容易将Chla、Chlc分离，能够得到高纯度的Pha、Phc。本方法简便、节省试剂，经济效益是常规法的十倍以上。

附图说明及具体实施方式

图1是本方法得到的Pha的电子光谱图。

图2是本方法得到的Phc的电子光谱图。

实施例1：

称取摘洗干净的海带1kg剪短磨碎后加入2L浓度为80％的丙酮水溶液，浸泡12小时过滤，收取滤液。滤渣可以反复提取2次。取500ml滤液注人分液漏斗中，再加入500ml正辛烷摇匀。30分钟后分层，下层黄色的是Chlc，Chla、类胡萝卜素、叶黄素均被萃取进上层正辛烷溶液中。如此反复萃取2次，分别回收Chlc溶液和萃取液。蒸馏干燥Chlc溶液得固体粉末。Chlc溶液和Chlc固体粉均可作为食用色素使用。往Chlc溶液中滴入数滴1摩尔浓度的盐酸，溶液变深黄色，说明Chlc反应成脱镁叶绿素C，进行浓度和电解质调节后可做为注射针剂进行临床使用。采用聚乙烯粉作为吸附剂并将其填充进层析柱中。然后慢慢滴入萃取液，待到达柱高的一半时就，停止滴入，改用60％的丙酮水溶液继续慢慢滴入，注意观察柱内已明显分为蓝、黄、浅黄色带，继续慢慢滴入洗脱液，分别接取蓝色、黄色、浅黄色溶液。蓝色是Chla、黄色是类胡萝卜素、浅黄色是叶黄素。类胡萝卜素不仅可以作为实用色素而且是很好的营养品。

往Chla溶液中滴入数滴1摩尔浓度的盐酸，溶液变深棕色，说明Chla反应成脱镁叶绿素A。然后采用液相酸度梯度法制备pha，即将脱镁叶绿素A溶液置于分液漏斗中并加入10ml去离子水后慢慢滴入浓硫酸，Chla脱掉醇尾成为棕黑色的Pha，进入下层的水溶液中。往分离出的Pha溶液中加入去离子水，使PH值达到4为止，再加入硅藻土，充分搅拌均后过滤，再用去离子水淋洗，洗脱过剩的酸至PH中性为止。将吸附了Pha的硅藻土浸入90％的丙酮水溶液洗脱出Pha。馏出Pha溶液中的提取剂，得到Pha水溶液，进行浓度和电解质调节后可做为注射针剂进行临床使用。将Pha水溶液蒸干后，可得黑色固体Pha便于保存。以上各个蒸馏过程中均可回收提取剂，不仅能减少成本而且可避免环境污染。Pha及其溶液均需避光保存。

实施例2：

称取摘洗干净的裙带菜1kg剪短磨碎后加入2L浓度为80％的乙醚水溶液，浸泡12小时过滤，收取滤液，滤渣反复提取2次。取500ml滤液注入分液漏斗中，再加入500ml苯摇匀。30分钟后分层，下层黄色的是Chlc，Chla、类胡萝卜素、叶黄素均被萃取进，上层苯溶液中。如此反复萃取2次，分别回收Chlc溶液和萃取液。

脱镁叶绿素C的制备和Chla、类胡萝卜素、叶黄素的分离及Pha的制备同实施例1。

往分离出的Pha溶液中加入去离子水使PH值达到4为止，再加入化石粉充分搅拌均后过滤，再用去离子水淋洗，洗脱过剩的酸至PH中性为止。将吸附了Pha的化石粉浸入90％的乙醚水溶液洗脱出Pha。蒸馏出Pha溶液中的提取剂，得到Pha水溶液，进行浓度和电解质调节后，可做为注射针剂进行临床使用。将Pha水溶液蒸干后可得黑色固体。

实施例3：

称取摘洗干净的鹿角菜1kg，磨碎后加入2L浓度为98％的乙醇，浸泡24小时后过滤，收取滤液，滤渣反复提取2次。取500ml滤液注入分液漏斗中，再加入500ml石油醚摇匀。30分钟后分层，下层黄色的是Chlc，Chla、类胡萝卜素、叶黄素均被萃取进入上层石油醚溶液中。如此反复萃取2次，分别回收Chlc溶液和萃取液。

往分离出的Pha溶液中加入去离子水，使PH值达到5。把脱脂棉填充层析柱中，将Pha溶液滴入柱中待溶液到达柱高的一半停止滴入，改用去离子水淋洗，洗脱过剩的酸至PH中性为止。将吸附了Pha的脱脂棉浸入90％的乙醚溶液洗脱出Pha。蒸馏出Pha溶液中的提取剂，得到Pha水溶液，进行浓度和电解质调节后可做为注射针剂进行临床使用。将Pha水溶液蒸干后可得黑色固体Pha。

实施例4：

用一定网目的网捞取硅藻，用清水漂洗干净，称取1kg，磨碎后加入2L浓度为90％的正辛烷，浸泡12小时后过滤，收取滤液，滤渣反复提取2次。取500ml滤液注入分液漏斗中，加入500ml去离子水摇匀。30分钟后分层，下层黄色的是Chlc，Chla、类胡萝卜素、叶黄素均被萃取进，上层溶液中。分离出Chlc溶液，再如此反复淋洗多次至洗脱液无黄色为止，分别回收Chlc溶液和萃取液。

往分离出的Pha溶液中加入去离子水是使PH值达到5。采用超滤膜进行过虑，因硫酸的分子半径小而Pha的分子半径大，可以将其开来。其它同实施例1。

实施例5：

以硅藻为原料，有机提取剂用石油醚，其它同实施例4。

实施例6：

以双鞭甲藻为原料，有机提取剂用80％的丙酮，其它同实施例4。

附图中实线为激发光谱，虚线为荧光光谱。由激发光谱可以看到用本发明的方法得到的Pha，在418nm、669nm有两个特征峰，这与生化标准品是一致的，说明采用本方法得到的Pha纯度很高。

下面对本发明的一些细节作出说明。

1、本发明选取海带、裙带菜、鹿角菜、硅藻等褐藻、硅藻或双鞭甲藻等为原料，新采集的材料要摘除藻根，洗去泥沙等污物，然后用

清水冲洗干净，空净水分。中、大型藻体要剪短磨碎；单细胞藻类选用适当网目的筛子过筛后用清水冲洗；干品要水发后用清水冲洗。

2、色素的提取。将磨碎的原料浸泡到提取剂浓度在10-80％的水溶液中，12-24小时后过滤，分别收取滤液和滤渣。提取剂使用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、正辛烷、苯等醇、酮、醚、芳烃、烷烃等溶剂中的一种或多种，滤渣再反复提取数次后丢弃。

3、Chlc的提取分离。将滤液装入分液漏斗，并加入去离子水使提取剂的浓度降低到2-10％，再加入萃取剂进行萃取，酯溶性色素进入上层，下面的水层溶有Chlc。对下层水溶液进行反复萃取后，可得纯的Chlc溶液。通过减压蒸馏Chlc溶液，可得黄色的Chlc固体粉末。Chlc溶液和Chlc固体粉末均可作为食用色素使用。

4、脱镁叶绿素C的制备。往Chlc溶液中滴入数滴1摩尔浓度的盐酸，溶液变深黄色，说明Chlc反应生成脱镁叶绿素C，进行浓度和电解质调节后可做为注射针剂进行临床使用。

5、分离出叶绿素C后还要将Chla与类胡萝卜素、叶黄素的分离。将上述含有酯溶性色素的萃取液采用层析进行分离，首先将吸附剂装入层析柱，然后慢慢滴入萃取液，待到达柱高的一半时，就停止滴入萃取液，改用洗脱剂的重量占40-80％(其余为水)的洗脱液继续慢慢滴入，注意观察柱内已明显分为蓝、黄、浅黄色带，继续慢慢滴入洗脱液，分别收取蓝色、黄色、浅黄色溶液。蓝色是Chla、黄色是类胡萝卜素、浅黄色是叶黄素。类胡萝卜素不仅可以作为实用色素而且是很好的营养品。吸附剂采用蔗糖、有机树脂、化石粉、硅藻土、脱脂棉、纤维素等。洗脱剂采用醇、酮、醚及其混合溶剂。

6、Pha的制备。往Chla溶液中滴入数滴1摩尔浓度的盐酸，溶液变深棕色，说明Chla反应生成脱镁叶绿素A。将脱镁叶绿素A溶液置于分液漏斗中并加入10ml去离子水后慢慢滴入浓硫酸，Chla脱掉醇尾成为棕黑色的Pha，进入下层的水溶液中。往分离出的Pha溶液中加入去离子水使PH值达到4为止，再加入吸附剂充分搅拌均后过滤，再用去离子水淋洗，洗脱过剩的酸至PH中性为止。将吸附了Pha的吸附剂浸入70-99％的提取液洗脱出Pha。蒸馏出Pha溶液中的提取剂，得到Pha水溶液，进行浓度和电解质调节后可做为注射针剂进行临床使用。将Pha水溶液蒸干后可得黑色固体Pha便于保存。Pha及其溶液均需避光保存。以上各个蒸馏过程中均可回收提取剂，不仅能减少成本而且可避免环境污染。

Claims

1、一种用海藻制备叶绿素A、叶绿素C、脱镁叶绿素甲酯一酸A和脱镁叶绿素C的方法，包括将原料磨浆，用有机溶剂水溶液提取，然后将叶绿素A、C分离，用酸处理，得到脱镁绿素A溶液和脱镁叶绿素C溶液，再用液相酸度梯度法处理脱镁叶绿A溶液，得到脱镁叶绿素甲酯一酸A，其特征是所述的原料为海藻，提取后用油水分离的方法将叶绿素C分出；所述的海藻为褐藻、硅藻、双鞭甲藻。

2、如权利要求1所述的的方法，其特征是分离出叶绿素C后还要将叶绿素A与类胡萝卜素、叶黄素分离。