CN116867900A - 新型抗pad4抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号2的氨基酸序列、HCDR3包含序列号3的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号6的氨基酸序列。

Description

新型抗PAD4抗体
技术领域
本发明涉及一种新型抗PAD4抗体。
背景技术
PAD4(Peptidylarginine deiminase 4，肽酰基精氨酸脱亚氨酶4)已知是参与蛋白中的精氨酸的瓜氨酸化的酶。该瓜氨酸化是构成蛋白的氨基酸中碱性最强的精氨酸被转化为中性的瓜氨酸的反应，因此对于蛋白的结构和反应来说是重要的。
已报告了瓜氨酸化与关节风湿病(RA)的关联性。例如，在RA中，由于波形蛋白、胶原及纤维蛋白等作为抗原存在于滑膜中，因此针对它们的抗体即抗环状瓜氨酸化肽抗体(抗CCP抗体)检测试剂盒作为RA的诊断药而被销售。
存在一些与PAD4和RA有关的报告。例如，非专利文献1中报告了RA的发病与PAD4基因的单核苷酸多态性之间存在相关性。另外，非专利文献2中报告了为了诊断RA而使用了抗PAD4抗体。另外，专利文献1中记载了通过将4种抗PAD4抗体的混合物给予小鼠来抑制RA的尝试(参照专利文献1的实施例2)。此外，专利文献2中还记载了在与PAD4的亲和性和瓜氨酸化活性抑制能力方面更为优异的抗PAD4抗体。
作为与PAD4和全身性红斑狼疮(SLE)相关的报告，存在如下报告：在使用了PAD4敲除小鼠的SLE模型(咪喹莫特(Imiquimod)诱发模型)中，与野生株相比肾炎得到抑制的报告；通过给予低分子PAD抑制剂(Cl-Amidine(氯酰胺)和BB-Cl-Amidine(BB氯酰胺))，SLE模型(MRL/lpr模型)小鼠的肾炎得到抑制的报告(非专利文献3、4、5)。另外，还存在如下报告：在敲除了PAD4的MRL/lpr小鼠中SLE样症状与野生株同样地发病的报告，即使将低分子抑制药(Cl-Amidine)给予肾炎模型(抗GBM抗体诱发模型和SLE患者血清植入小鼠)，也无法抑制肾炎的发病(非专利文献6)。
根据这样的疾病与PAD4的关联，期望有在结合亲和性、稳定性等方面更为优异的抗PAD4抗体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO/2012/026309
专利文献2：WO/2016/143753
非专利文献
非专利文献1："Functional haplotypes of PADI4，encoding citrullinatingenzyme peptidylarginine deiminase 4，are associated with rheumatoidarthritis."，Suzuki et al.，Nat Genet.2003Aug；34(4)：395-402.
非专利文献2："Two novel sandwich ELISAs identify PAD4 levels and PAD4autoantibodies in patients with rheumatoid arthritis."，Ishigami et al.，ModRheumatol.2013 Jul；23(4)：794-803.
非专利文献3："Peptidylarginine deiminases 2 and 4 modulate innate andadaptive immune responses in TLR-7-dependent lupus"，Yudong et al.，JCIInsight.2018 Dec 6；3(23)：e124729.
非专利文献4："Peptidylarginine Deiminase 4Promotes the RenalInfiltration of Neutrophils and Exacerbates the TLR7 Agonist-Induced LupusMice"，Hanata et al.，Front Immunol.2020Jun 23；11：1095.
非专利文献5："Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NETformation and protects against kidney，skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice"，Knight et al.，Ann Rheum Dis.2015Dec；74(12)：2199-2206.
非专利文献6："Lupus and proliferative nephritis are PAD4 independentin murine models"，Gordon et al.，JCI Insight.2017May 18；2(10)：e92926.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种具有优异特性的抗PAD4抗体、或提供优异的RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病等的预防或治疗方法等。
用于解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题进行了深入研究。其结果发现，具有特定的互补性决定区(CDR)序列的抗PAD4抗体具有优异的结合特性、保存稳定性。进而发现，具有特定的骨架区域(FR)序列的抗PAD4抗体具有优异的化学稳定性，从而完成了本发明。
即，本发明的主旨如下。
[1]一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号2的氨基酸序列、HCDR3包含序列号3的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号6的氨基酸序列。
[2]根据[1]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号7～10中的任一个氨基酸序列、HCDR3包含序列号11或12的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号13～15中的任一个氨基酸序列。
[3]根据[1]或[2]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号7的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号13的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号8的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号13的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号9的氨基酸序列、HCDR3包含序列号12的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号14的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号10的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号15的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号7的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号13的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号8的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号13的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号9的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号12的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号14的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号10的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号15的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[5]一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-3)重链可变区包含序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-3)重链可变区包含序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-3)重链可变区包含序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-3)重链可变区包含序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[6]根据[5]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-4)重链可变区由序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-4)重链可变区由序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-4)重链可变区由序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-4)重链可变区由序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[7]根据[5]或[6]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-5)重链由序列号16的氨基酸序列构成、轻链由序列号17的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-5)重链由序列号18的氨基酸序列构成、轻链由序列号19的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-5)重链由序列号20的氨基酸序列构成、轻链由序列号21的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-5)重链由序列号22的氨基酸序列构成、轻链由序列号23的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸是丝氨酸。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其与PAD4的KD值为100pM以下。
[10]一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其为[1]～[9]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，且将所述抗PAD4抗体或其抗体片段在40℃下保存1个月时，与该保存前的抗PAD4抗体或其抗体片段所具有的PAD4结合量相比，具有90％以上的结合量。
[11]一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-1)的抗PAD4抗体或其抗体片段，且相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸为丝氨酸：
e-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号24的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号25的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[12]根据[11]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-2)的抗PAD4抗体或其抗体片段，且相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸为丝氨酸：
e-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号24的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3为由序列号25的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[13]一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，e-3)重链可变区包含序列号28的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列。
[14]根据[13]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，e-4)重链可变区由序列号28的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成。
[15]根据[13]或[14]所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，e-5)重链由序列号28构成，轻链由序列号27构成。
[16]一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其是[11]～[15]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，且生成时发生的剪切小于总生成量的3％。
[17]根据[1]～[16]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，抗体为中和抗体。
[18]根据[1]～[17]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，抗体是序列号29所示的PAD4的结合抗体。
[19]一种核酸分子，其包含编码[1]～[15]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段的碱基序列。
[20]一种重组载体，其包含[19]所述的核酸分子。
[21]一种转化体，其包含[20]所述的重组载体。
[22]一种药物组合物，其包含[1]～[18]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段。
[23]根据[22]所述的药物组合物，其为关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂。
[24]根据[22]或[23]所述的药物组合物，其为蛋白中的瓜氨酸化的抑制剂。
[25]根据[22]～[24]中任一项所述的药物组合物，其为细胞中的NETosis的抑制剂。
[26][1]～[18]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段、或者[22]～[25]中任一项所述的药物组合物的、用于预防或治疗关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的用途。
[27][1]～[18]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段、或者[22]～[25]中任一项所述的药物组合物的、用于制造关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂的用途。
[28]一种关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的预防或治疗方法，其通过给予有效量的[1]～[18]中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段、或者[22]～[25]中任一项所述的药物组合物进行。
发明效果
根据本发明，可提供具有优异特性的抗PAD4抗体、以及优异的RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的预防或治疗方法等。
附图说明
图1是表示CAIA小鼠模型的制作方法以及本发明的抗PAD4抗体对CAIA模型的关节炎的效果的图。
图2是表示本发明的抗PAD4抗体对CIA模型的关节炎的效果的图。
图3是表示本发明的抗PAD4抗体对cGvHD模型的尿蛋白的效果的图。
图4是表示本发明的抗PAD4抗体对cGvHD模型的发病率的效果的图。
具体实施方式
为了容易理解本发明，以下对本发明中使用的用语进行说明。
[中和]
在本发明中，“中和”是指与目标靶结合且能够抑制该靶的任一个功能的作用。即，“中和PAD4的活性”是指抗PAD4抗体通过与PAD4结合而抑制PAD4的活性。PAD4的活性可以通过本领域已知的几种体外(in vitro)或体内(in vivo)分析中的1个或1个以上来评价。PAD4的活性例如为蛋白中的精氨酸的瓜氨酸化活性，抗PAD4抗体的中和活性可以通过本说明书中记载的瓜氨酸化抑制试验来评价。
[分离的]
分离的抗PAD4抗体等的“分离的”是指鉴定的且分离的和/或从自然状态下的成分中回收的。自然状态下的杂质是能够妨碍该抗体的诊断性或治疗性用途的物质，可举出酶、激素及其它蛋白性或非蛋白性的溶质。一般而言，为了将抗PAD4抗体分离，只要通过至少1个纯化工序进行纯化即可，可以将通过至少1个纯化工序纯化的抗PAD4抗体称为“分离的抗PAD4抗体”。
[人抗体]
人抗体是指轻链、重链均为人免疫球蛋白来源的抗体。人抗体根据重链的恒定区的不同，包括具有γ链的重链的IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、具有μ链的重链的IgM、具有α链的重链的IgA(包括IgA1、IgA2)、具有δ链的重链的IgD、或具有ε链的重链的IgE。另外，原则上轻链包含κ链和λ链中的任一个。
[人源化抗体]
人源化抗体是指由可变区和人抗体来源的恒定区构成的抗体，所述可变区由非人动物来源的抗体的互补性决定区和人抗体来源的框架区构成。
[嵌合抗体]
嵌合抗体是指轻链、重链或其双方由非人来源的可变区和人来源的恒定区构成的抗体。
[抗PAD4抗体]
本发明中，抗PAD4抗体是指与PAD4结合的免疫球蛋白分子或其修饰分子。修饰分子中包括多特异性抗体(mutispecific antibody)、嵌合抗体、人源化抗体、功能修饰抗体、以及偶联抗体(conjugated antibody)。
[多特异性抗体]
多特异性抗体是指具有2个以上不同的抗原特异性的2个以上的独立的抗原识别部位的非对称的抗体，可举出具有2个抗原特异性的双特异性抗体、具有3个抗原特异性的三特异性抗体等。
[功能修饰抗体]
本发明中，功能修饰抗体是指通过修饰抗体序列、糖链等而改变了抗体所具有的除抗原结合功能以外的功能、例如细胞杀伤功能、补体活化功能、血中半衰期延长功能的抗体。
[偶联抗体]
在本发明中，偶联抗体是指在抗体上化学地或基因工程地结合聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子、白蛋白、酶等除抗体以外的功能分子而成的抗体。
[抗体片段]
本发明中，只要没有特别说明，抗体片段是指抗原结合片段。也可以将抗体片段称为抗原结合分子。抗原结合片段是包含抗体的一部分的蛋白，是能够与抗原结合的片段。作为抗原结合片段的例子，可举出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(variable fragment of antibody，抗体可变片段)、二硫键Fv、单链抗体(scFv)以及它们的聚合物等。此外，抗原结合片段包括化学地或基因工程地结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养素(Neurotrophin)等)、白蛋白、酶、其他抗体等除本发明的抗PAD4抗体以外的功能分子的偶联抗原结合片段。
[互补性决定区]
互补性决定区(CDR)是指免疫球蛋白分子的可变区中的形成抗原结合部位的区域，也称为超可变区，是指每个免疫球蛋白分子中氨基酸序列的变化特别大的部分。CDR中在轻链和重链上分别有3个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、及HCDR1、HCDR2、HDRC3)。在本发明中，免疫球蛋白分子的CDR根据Kabat的编号附加系统(Kabat等、1987、Sequences of Proteinsof Immunological Interest、USDepartment of Health and Human Services、NIH、USA)来确定。
[氨基酸序列的百分比(％)同源性]
可变区等的与所鉴定的参照多肽序列相关的“百分比(％)同源性”被定义为：在使序列排列、为了得到最大的％同源性在需要时可导入间隙、且任意的保守性的替换也不认为是序列同源性的一部分后的、与特定的参照多肽序列的氨基酸残基相同的候补序列中的氨基酸残基的百分比。出于测定％同源性的目的的对齐可以通过使用本领域技术人员的能力范围内的各种方法、例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件这样的公众可获得的计算机软件来实现。本领域技术人员可以决定包括相对于所比较的序列的全长达到最大对齐所需的任意的算法在内的用于对序列进行对齐的适当的参数。但是，出于这里的目的，％同源性值通过在双序列比对(pairwise alignment)中使用序列比较计算机程序BLAST来得到。
在氨基酸序列比较中使用BLAST的状况下，所给出的氨基酸序列A与所给出的氨基酸序列B的％同源性如下进行计算：
分率X/Y的100倍
在此，X是A及B通过序列比对程序BLAST的程序比对一致性得分判定为相同时的氨基酸残基的数量，Y是B的全部氨基酸残基数。在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不同的情况下，应理解A相对于B的％同源性与B相对于A的％同源性不同。只要没有特别说明，这里的所有的％同源性值是使用上一段落所示的BLAST计算机程序得到的。
[竞合]
在本发明中，与本发明的抗PAD4抗体“竞合”是指在通过本说明书中记载的表面等离子体共振(SPR)法进行测定的情况下，由于该抗PAD4抗体或其抗原结合片段的存在，本发明的抗PAD4抗体与PAD4的结合有显著性差异地降低。
以下，对本发明进行详细说明。
<PAD4>
一般来说，PAD4已知是参与蛋白中的精氨酸的瓜氨酸化的酶。另外，PAD4也已知是参与细胞的NETosis的酶。PAD4的氨基酸序列等的详细情况可以从NCBI(National Centerfor Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)或HGNC(HUGO GeneNomenclature Committee，HUGO基因命名委员会)等网站看到。NCBI中记载的PAD4的登录号例如为NP_036519.2。PAD4的氨基酸序列例如为序列号29。PAD4只要具有PAD4活性，则其生物来源没有限定。
＜抗PAD4抗体＞
本发明的一个实施方式涉及一种新型的抗PAD4抗体。该抗体是相对于以往的抗PAD4抗体具有更优异的结合特性、保存稳定性、化学稳定性的抗PAD4抗体。关于保存稳定性和化学稳定性分别在后文叙述，有时将它们统称为稳定性。
使用该抗体，例如可以进行RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防或治疗。该预防或治疗方法由于使用抗体而副作用小，从安全性的观点出发是优异的。
另外，本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体也可以是抑制由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化活性的抗体。
另外，本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体也可以是抑制细胞中的NETosis的抗体。
本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体在与PAD4的结合性方面优异。本发明的抗PAD4抗体与PAD4结合是指PAD4特异性的结合，进一步优选与PAD4(优选为人PAD4)的解离常数(KD)低的物质，作为上限值，例如为100pM以下，更优选为90pM以下，更进一步优选为80pM以下，作为下限值，没有特别限定，例如可以为20pM以上，更优选为30p以上，更优选为40pM以上。解离常数(KD)例如是通过本说明书中记载的表面等离子体共振(SPR)法测定的值。
本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体可中和PAD4的抗PAD4抗体活性。抗PAD4抗体的中和活性例如可以通过后述的实施例中所示的瓜氨酸化抑制试验来评价。通过添加抗PAD4抗体，由PAD4引起的瓜氨酸化受到抑制。本发明的抗PAD4抗体可将由PAD4引起的瓜氨酸化活性中和50％以上，更优选80％以上，最优选90％以上。
本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体的保存(保管)稳定性优异。保存稳定性可以通过保存一定期间后与PAD4结合的降低来评价，抗PAD4抗体的PAD4结合量具体而言可以通过实施例5中记载的使用了表面等离子体共振装置的抗原结合活性测定来进行测定。本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体例如在40℃下保存1个月时，与该保存前的抗PAD4抗体或其抗体片段所具有的PAD4结合量相比，可以具有90％、93％、94％、95％、96％、97％以上的PAD4结合量。
本发明的抗PAD4抗体与PAD4结合时的结合部位没有特别限定，例如优选与PAD4(例如序列号29)的包括345、347和348位在内的表位结合。
本发明的抗PAD4抗体包括以PAD4或其部分片段为抗原，用该抗原免疫小鼠等哺乳动物或鸡等，制作杂交瘤而得到的单克隆抗体；使用基因重组技术制造的嵌合抗体和人源化抗体；以及使用产生人抗体的转基因动物等制造的人抗体等。另外，还包括对上述得到的抗体进行亲和性成熟而得到的抗体。例如，亲本抗体可以使用后述的G8。在将本发明的抗PAD4抗体或其抗体片段作为药物给予人的情况下，从副作用的观点出发，优选为人源化抗体或人抗体或它们的抗体片段。
抗原可以直接用于免疫，也可以以与载体蛋白的复合物形式使用。抗原与载体蛋白的复合物的制备中可以使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯等缩合剂。载体蛋白可例示出牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)、血蓝蛋白(Hemocyanin)、KLH等。
作为被免疫的动物，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猪、山羊、马或牛等哺乳动物或鸡，接种方法可举出皮下、肌肉或腹腔内的给药。在给药时，可以与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂混合后给药，给药通常每隔2～5周进行1次。将从被免疫的动物的脾脏或淋巴结得到的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，作为杂交瘤分离。作为骨髓瘤细胞，使用动物来源、例如小鼠、大鼠、人、鸡等来源的细胞。
<单克隆抗体>
单克隆抗体具体而言可以如下获得。即，将上述那样的抗原作为免疫原，根据需要将该免疫原与弗氏佐剂(Freund′s Adjuvant)一起注射或移植到如上所述的动物的皮下、肌肉内、静脉内、脚垫内或腹腔内1～数次，由此实施免疫致敏。通常，从初次免疫起约每1～14天进行1～4次免疫，从最终免疫起约1～5天后从经免疫致敏的上述动物获得抗体产生细胞。
单克隆抗体可以使用本领域技术人员公知的方法得到(例如《Current Protocolsin Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987))、Antibodies：A Laboratory Manual,Ed.Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
分泌单克隆抗体的“杂交瘤”的制备可以按照和MILSTEIN等的方法(Nature，256，495，1975)以及基于其的改进方法来进行。即，通过使从经免疫致敏的动物获得的脾脏等中含有的抗体产生细胞与动物、优选小鼠、大鼠、鸡或人来源的没有自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合来制备。
作为用于细胞融合的骨髓瘤细胞，例如可以使用小鼠来源的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/O、Sp2)、PAI、F0或BW5147、大鼠来源的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.、人来源的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15等。
作为融合促进剂可举出聚乙二醇等，通常使用浓度为20～50％左右的聚乙二醇(平均分子量为1000～4000)，在20～40℃、优选30～37℃的温度下、抗体产生细胞数与骨髓瘤细胞数之比通常在1：1～10：1左右、约1～10分钟左右使其反应来实施细胞融合。
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可以通过下述方法进行：将杂交瘤在例如微量滴定板中培养，通过ELISA等免疫化学方法测定孔的培养上清液对免疫抗原的反应性。
从含有产生目标抗体的杂交瘤的孔中进一步通过极限稀释法进行克隆，可以得到克隆。杂交瘤的分选、育种通常是在添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)且含有10～20％胎牛血清的动物细胞用培养基中进行的。
来自杂交瘤的单克隆抗体的制造可以通过在体外培养杂交瘤、或使其在小鼠、大鼠、鸡等动物的腹水中等的体内增殖，从得到的培养上清液或动物的腹水中分离来进行。
在体外培养的情况下，可以根据所培养的细胞种类的特性及培养方法等各种条件，使杂交瘤增殖、维持及保存，使用适于在培养上清液中产生单克隆抗体的营养培养基。
作为基础培养基，例如可举出Ham’F12培养基、MCDB153培养基或低钙MEM培养基等低钙培养基及MCDB104培养基、MEM培养基、D-MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基础培养基可以根据目的而含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。
单克隆抗体的分离、纯化可以通过将上述培养上清液或腹水供于饱和硫酸铵、优球蛋白(Euglobulin)沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱法(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白或蛋白A柱等亲和柱色谱法等来进行。具体而言，单克隆抗体的纯化可以使用作为免疫球蛋白的纯化法已知的方法，例如可以通过硫安分级法、PEG分级法、乙醇分级法、利用阴离子交换体、甚至使用PAD4的亲和色谱法等方法容易地实现。
单克隆抗体也可以通过噬菌体展示法获得。在噬菌体展示法中，使用目标免疫原从任意的噬菌体抗体库中进行筛选，选择具有针对免疫原的期望的结合性的噬菌体。接着，将噬菌体内所含的抗体对应序列分离或测序，基于所分离的序列或所确定的序列信息，构建包含编码抗体或抗原结合结构区的核酸分子的表达载体。然后，通过培养转染了该表达载体的细胞株，能够产生单克隆抗体。作为噬菌体抗体库，通过使用人抗体库，能够生成具有所期望的结合性的人抗体。
作为本发明的抗PAD4抗体的优选方式，可举出嵌合抗体。作为“嵌合抗体”，可例示出可变区为非人动物(小鼠、大鼠、仓鼠、鸡等)的免疫球蛋白来源的可变区，恒定区为人免疫蛋白球蛋白来源的恒定区的嵌合抗体。例如，可以通过对小鼠免疫抗原，从该小鼠单克隆抗体的基因中切出与抗原结合的可变区，与人骨髓来源的抗体恒定区结合来制作。人免疫球蛋白来源的恒定区根据IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD及IgE等亚型(isotype)而分别具有固有的氨基酸序列，但本发明中的重组嵌合抗体的恒定区也可以是属于任意isotype的人免疫球蛋白的恒定区。优选为人IgG的恒定区。可以使用这样制作的嵌合抗体的基因来制作表达载体。通过用该表达载体转化宿主细胞而得到嵌合抗体产生转化细胞，培养该转化细胞，从而从培养上清液中得到目标嵌合抗体。
作为本发明的抗PAD4抗体的另一优选方式，可举出人源化抗体。本发明中的“人源化抗体”是仅将小鼠等非人动物抗体的抗原结合部位(CDR；互补性决定区)的DNA序列移植(CDR grafting)到人抗体基因而得到的抗体。例如，可以参照日本特表平4-506458号公报和日本专利2912618号说明书等中记载的方法来制作。具体而言是指具有下述特征的人源化抗体：其CDR的一部分或全部为非人动物(小鼠、大鼠、仓鼠、鸡等)的单克隆抗体来源的CDR，其可变区的框架区为人免疫球蛋白来源的可变区的框架区，且其恒定区为人免疫球蛋白来源的恒定区。
本发明中的人源化抗体例如可以如下制造。但是，当然并不限定于这样的制造方法。
作为对抗体进行人源化的方法，可以使用该技术领域已知的各种方法(例如Almagro et al.,FRont Biosci.2008 Jan 1；13：1619-1633.)，具体而言，例如可举出CDRgrafting(Ozaki et al.,Blood.1999 Jun 1；93(11)：3922-3930.)、Re-surfacing(roguska et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Feb 1；91(3)：969-973.)、或FRshuffle(Damschroder et al.,Mol Immunol.2007 Apr；44(11)：3049-3060.Epub 2007Jan 22.)等。为了修饰或改善抗原结合，也可以将人FR区域的氨基酸残基替换为来自CDR供体抗体的对应的残基。该FR替换可以通过该技术领域中公知的方法来实施(Riechmann etal.,Nature.1988 Mar 24；332(6162)：323-327.)。例如，可以通过CDR与FR残基的相互作用的建模来鉴定对抗原结合重要的FR残基。或者，也可以通过序列比较，在特定的位置鉴定异常的FR残基。此外，也可以通过Nishibori et al.,Mol Immunol.2006Feb；43(6)：634-42中记载的方法进行人源化。
以能够表达的方式将移植有分离的小鼠重链CDR部分的DNA的人重链基因导入适当的表达载体，同样地以能够表达的方式将移植有小鼠轻链CDR部分的DNA的人轻链基因导入适当的另1个表达载体。或者，也可以以能够表达的方式将移植有小鼠的CDR的人的重链和轻链基因导入同一表达载体。通过用这样制作的表达载体对宿主细胞进行转化，得到人源化抗体产生转化细胞，培养该转化细胞，从而从培养上清液中得到目标人源化抗体。
作为本发明的抗PAD4抗体的另一优选方式，可举出人抗体。人抗体是指包括构成免疫球蛋白的重链的可变区和重链的恒定区以及轻链的可变区和轻链的恒定区在内的所有区域均来源于编码人免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白的抗体，其能够通过将人抗体基因导入小鼠来制作。具体而言，例如，通过用抗原对通过在小鼠或鸡等除人以外的动物的基因组中组入至少人免疫球蛋白基因而制作的转基因动物进行免疫致敏，能够与上述单克隆抗体的制作方法同样地进行制造。
例如，产生人抗体的转基因小鼠可以按照Nature Genetics,Vol.7,p.13-21,1994；Nature Genetics,Vol.15,p.146-156,1997；日本特表平4-504365号公报；日本特表平7-509137号公报；国际公开第94/25585号小册子；Nature,Vol.368,p.856-859,1994；以及日本特表平6-500233号公报等中记载的方法来制作。更具体而言，可举出HuMab(注册商标)小鼠(Medarex,Princeton NJ)、KMTM小鼠(Kirin Pharma Company,Japan)、KM(FCγRIIb-KO)小鼠等。
作为本发明的单克隆抗体，具体而言，可举出：
a)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号7的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号13的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体，
b)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号8的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号13的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体，
c)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号9的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号12的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号14的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体，
d)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号10的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号15的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体，及
e)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号24的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号25的氨基酸序列构成、并且相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸为丝氨酸的抗PAD4抗体。
上述a)～d)中记载的抗体与PAD4的结合亲和性显著提高，另外，上述a)～d)中记载的抗体与PAD4的结合活性的保存稳定性提高，上述e)中记载的抗体的剪切得到抑制，化学稳定性显著提高，上述a)～d)中记载的抗体具有与上述e)中记载的抗体同等的高化学稳定性。
需要说明的是，上述a)～e)中记载的氨基酸序列与后述的实施例中记载的2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25、及G8ss的抗体所具有的各CDR的氨基酸序列对应。
即，2-1-47的重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列分别是序列号1、序列号7、序列号11、序列号4、序列号5及序列号13所示的氨基酸序列。
3-1-39的重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列分别为序列号1、序列号8、序列号11、序列号4、序列号5及序列号13所示的氨基酸序列。
3-2-37的重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列分别为序列号1、序列号9、序列号12、序列号4、序列号5及序列号14所示的氨基酸序列。
4-2-25的重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列分别为序列号1、序列号10、序列号11、序列号4、序列号5及序列号15所示的氨基酸序列。
G8ss的重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列分别是序列号1、序列号24、序列号11、序列号4、序列号5及序列号25所示的氨基酸序列。
上述a)的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是分别包含序列号1、序列号7、序列号11、序列号4、序列号5及序列号13所示的氨基酸序列作为重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
上述b)的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是分别包含序列号1、序列号8、序列号11、序列号4、序列号5及序列号13所示的氨基酸序列作为重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
上述c)的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是分别包含序列号1、序列号9、序列号12、序列号4、序列号5及序列号14所示的氨基酸序列作为重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
上述d)的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是分别包含序列号1、序列号10、序列号11、序列号4、序列号5及序列号15所示的氨基酸序列作为重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
上述e)的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是分别包含序列号1、序列号24、序列号11、序列号4、序列号5及序列号25所示的氨基酸序列作为重链CDR1、2、3、轻链CDR1、2及3的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是重链CDR1包含序列号1所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是重链CDR2包含序列号2所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是重链CDR3包含序列号3所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是轻链CDR1包含序列号4所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是轻链CDR2包含序列号5所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是轻链CDR3包含序列号6所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
需要说明的是，在序列号2所示的氨基酸序列中，11位的氨基酸为Tyr、Thr或IIe，12位的氨基酸为Gly、Ser或Pro，13位的氨基酸为Thr、Val、Tyr或Pro，14位的氨基酸为Pro或Asn，15位的氨基酸为Tyr、Ala、Gln或Leu，17位的氨基酸为Gly、Thr或Ser，各位置上的氨基酸包括选自上述氨基酸中的任意组合的氨基酸序列。
需要说明的是，在序列号3所示的氨基酸序列中，1位的氨基酸为Ala或Gly，具体而言，包含序列号11和12的氨基酸序列。
需要说明的是，在序列号6所示的氨基酸序列中，4位的氨基酸为Thr、Leu或Tyr，具体而言，包含序列号13、14及15的氨基酸序列。
本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体只要具体与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以是重链CDR1包含序列号1所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是重链CDR2包含序列号7～10中的任一个所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是重链CDR3包含序列号11或12所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是轻链CDR1包含序列号4所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是轻链CDR2包含序列号5所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体，也可以是轻链CDR3包含序列号13～15中的任一个所示的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
需要说明的是，只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性这样的本发明的抗PAD4抗体的特性，则也可以在这些CDR的1个以上中替换1个～数个氨基酸。在此，1个～数个例如为1个、2个或3个。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸替换优选为保守性替换。在此，“保守性替换”是指以实质上不改变肽的活性的方式，用其他的化学上类似的氨基酸残基替换氨基酸残基。例如，在用另外的疏水性残基替换某个疏水性残基的情况下，可举出用具有相同电荷的其他极性残基替换某一极性残基的情况等。作为能够进行这样的替换的功能上类似的氨基酸的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的(碱性)氨基酸，可举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可举出天冬氨酸、谷氨酸等。维持抗体的特性是指这些特性与CDR的氨基酸序列修饰前相比维持在同等程度、例如80％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上。其中，维持也包括提高。
除CDR以外的区域只要是能够维持作为抗体的结构并发挥功能的序列就没有特别限制，可以是小鼠来源的序列、人来源的序列、其他哺乳动物来源的序列、鸡来源的序列、它们的嵌合序列、人工序列中的任一种。在包含恒定区的情况下，可例示出重链及轻链的恒定区的氨基酸序列记载于Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986、The Journal ofBiological Chemistry vol.257,p1516,1982和Cell vol.22,p197,1980中的氨基酸序列。
作为修饰除CDR以外的区域的方法，作为本发明的优选的一个实施方式，可举出相当于抗体的重链(例如序列号26)的第84位的氨基酸的氨基酸(通常为天冬酰胺)为丝氨酸的抗体。在此，“相当的氨基酸”是指在将目标氨基酸序列与序列号26进行比对时，存在于序列号26的第84位的氨基酸即天冬酰胺的位置的氨基酸(通常为天冬酰胺)。这样的本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体在抗体的化学稳定性、具体而言生成时发生的剪切的抑制方面优异。剪切的抑制可以通过利用肽谱分析(peptide mapping)得到的在重链的第84位的天冬酰胺残基和第85位的丝氨酸残基之间被剪切的抗体量的降低来评价，具体而言，例如可以通过利用实施例1中记载的方法测定剪切肽的量来评价。本发明的一个实施方式的生成时发生的剪切的抑制优异的抗PAD4抗体例如在4℃下保存2周时，被剪切的抗体与该保存前的抗体相比，可以为3％、2％、1％以下。
此外，还可例示出使除CDR以外为人来源的人源化抗体。作为这样的人源化抗体，可举出选自下述中的1种以上的抗体：
a)重链可变区和轻链可变区分别由序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体，
b)重链可变区和轻链可变区分别由序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体，
c)重链可变区和轻链可变区分别由序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体，
d)重链可变区和轻链可变区分别由序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体、及
e)重链可变区和轻链可变区分别由序列号26的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体。
或者，本发明的一个实施方式的抗PAD4抗体可以为选自下述中的1种以上的抗体：
a)重链和轻链分别由序列号16及17所示的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体，
b)重链和轻链分别由序列号18及19所示的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体，
c)重链和轻链分别由序列号20及21所示的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体，
d)重链和轻链分别由序列号22及23所示的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体、及
e)重链和轻链分别由序列号26及27所示的氨基酸序列构成的、或包含该氨基酸序列的抗PAD4抗体。
需要说明的是，在人源化抗体的氨基酸序列的重链可变区和/或轻链可变区中，只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下，更优选为90pM以下，更进一步优选为80pM以下)，且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则也可以具有1个或多个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个)的替换、缺失、附加或插入。这样的替换、缺失、附加可以导入到CDR，但优选导入到除CDR以外的区域。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸替换优选为保守性替换。
所述的重链可变区和/或轻链可变区中包含替换、缺失等的本发明的抗PAD4抗体的氨基酸序列可以是重链可变区与序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列或序列号26的氨基酸编号1～120的氨基酸序列具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的同源性的氨基酸序列，轻链可变区与序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列、序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列、序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列、序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列或序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的同源性的氨基酸序列。
另外，本发明的抗PAD4抗体只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下、更优选为90pM以下、更进一步优选为80pM以下)，且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则还可以是重链与序列表的序列号16、18、20、22、26具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的同源性的氨基酸序列，轻链与序列表的序列号17、19、21、23、27具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的同源性的氨基酸序列的抗PAD4抗体。
本发明的抗PAD4抗体中包括具有由上述特定的氨基酸序列构成的CDR、或由上述特定的氨基酸序列构成的可变区的多特异性抗体、功能修饰抗体、偶联抗体。
本发明的抗PAD4抗体通过采用基因工程方法在其自身结合除PAD4以外的其他的具有抗原结合特异性的抗体，能够制作双特异性抗体等多特异性抗体。该基因工程方法在本领域已经建立。例如，利用将可变区串联连接而成的DVD-Ig(Wu等、NatureBiotechnology 25(11),1290(2007))，或通过对抗体的Fc区域进行修饰、将与不同抗原结合的2种抗体的重链组合的ART-Ig的技术(Kitazawa等、Nature Medicine 18(10),1570(2012))，能够获得所希望的双特异性抗体。
作为本发明的抗PAD4抗体的修饰分子，可举出功能修饰抗体。功能修饰抗体是指通过对抗体序列、糖链等进行修饰而改变了细胞杀伤功能、补体活化功能、血中半衰期延长功能等功能的抗体(設楽研也、藥學雜誌、2009、Vol.129(1),p3；石井明子ら、日本薬理學雜誌、2010、Vol.136(5),p280；橋口周平ら、生化学、2010、Vol.82(8),p710)。
抗PAD4抗体的功能修饰抗体通过如下的方法进行制备。例如，当使用破坏了α1,6-海藻糖转移酶(FUT8)基因的CHO细胞作为宿主细胞制造本发明抗PAD4抗体时，可得到糖链的海藻糖含量降低而细胞杀伤功能提高的抗体，将导入有FUT8基因的CHO细胞作为宿主细胞制造本发明抗PAD4抗体时，可得到细胞杀伤功能低的抗体(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)。另外，通过对Fc区域的氨基酸残基进行修饰，可以调节补体活化功能(美国专利第6737056号、美国专利第7297775号、美国专利第7317091号)。此外，通过使用与Fc受体之一FcRn的结合提高了的Fc区域的突变体，能够实现血中半衰期的延长(橋口周平ら、生化学、2010、Vol.82(8),p710)。这些功能修饰抗体可以通过基因工程制造。
作为本发明的抗PAD4抗体的修饰分子，可举出偶联抗体。作为偶联抗体，可举出在抗PAD4抗体上化学地或基因工程地结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子、白蛋白、酶、其他抗体等除本发明的抗PAD4抗体以外的功能分子的偶联抗体。
在结合PEG作为功能分子的情况下，只要是通常使用的PEG均可，可以是直链型，也可以是分支型。PEG可以通过例如使用NHS活性基团与抗体的氨基等键合。
在使用放射性物质作为功能分子的情况下，可使用131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性物质可以通过氯胺T法等直接与抗体键合。
在使用酶作为功能分子的情况下，可以使用荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
作为在将毒素、低分子化合物或酶化学键合时使用的连接基团，可举出二价自由基(例如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基)、-(CR2)nO(CR2)n-(R为任意的取代基，n为正整数)所示的连接基团或烷氧基的重复单元(例如聚环氧乙烷、PEG、聚环氧甲烷等)及烷基氨基(例如聚亚乙基氨基、JeffamineTM)、以及二元酸酯及酰胺(琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己内酰胺等)。使功能分子键合的化学修饰方法在本领域已经建立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998T.J.InternationalLtd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998Marcel Dekker Inc；Chariet al.,Cancer Res.,1992Vol152：127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996Vol93：8681)。
本发明中的抗体的“抗原结合片段”是指如上述那样的抗体的具有抗原结合性的一部分的区域，具体而言，可举出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(variable fragment ofantibody，抗体可变片段)、二硫键Fv、单链抗体(scFv)及它们的聚合物等，此外，抗原结合片段包括化学地或基因工程地结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养素(Neurotrophin)等)、白蛋白、酶、其他抗体等除本发明的抗PAD4抗体以外的功能分子的偶联抗原结合片段。
在此，“F(ab’)2”和“Fab”是指通过用作为蛋白水解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等处理免疫球蛋白而制造的，在存在于铰链区中的2条重链之间的二硫键的前后被消化而生成的抗体片段。例如，用木瓜蛋白酶对IgG进行处理时，可以制造在存在于铰链区中的2条重链之间的二硫键的上游被剪切而由VL(轻链可变区)和CL(轻链恒定区)构成的轻链、以及由VH(重链可变区)和CHγ1(重链恒定区中的γ1区域)构成的重链片段在C末端区域通过二硫键键合而成的同源的2个抗体片段。将这2个同源的抗体片段分别称为Fab。另外，用胃蛋白酶对IgG进行处理时，可以制造比在存在于铰链区中的2条重链之间的二硫键的下游被剪切而上述2个Fab在铰链区相连而成的抗体稍大的抗体片段。将该抗体片段称为F(ab’)2。
作为本发明的抗PAD4抗体的抗原结合片段的修饰分子，可举出偶联抗原结合片段。作为偶联抗原结合片段，可举出在抗PAD4抗体的具有抗原结合性的一部分区域中化学地或基因工程地结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子、白蛋白、酶、其他抗体等除本发明的抗PAD4抗体以外的功能分子的偶联抗原结合片段。
在结合PEG作为功能分子的情况下，只要是通常使用的PEG均可，可以是直链型，也可以是分支型。PEG可以通过例如使用NHS活性基团与抗体的氨基等键合。
在使用放射性物质作为功能分子的情况下，可使用131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性物质可以通过氯胺T法等直接键合在抗PAD4抗体的具有抗原结合性的一部分区域。
在使用酶作为功能分子的情况下，可以使用荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
作为在将毒素、低分子化合物或酶化学键合时使用的连接基团，可举出二价自由基(例如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基)、-(CR2)nO(CR2)n-(R为任意的取代基，n为正整数)所示的连接基团或烷氧基的重复单元(例如聚环氧乙烷、PEG、聚环氧甲烷等)及烷基氨基(例如聚亚乙基氨基、JeffamineTM)、以及二元酸酯及酰胺(琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己内酰胺等)。使功能分子键合的化学修饰方法在本领域已经建立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998T.J.InternationalLtd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998Marcel Dekker Inc；Chariet al.,Cancer Res.,1992Vol152：127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996Vol93：8681)。
对于本发明的包含具有特定的氨基酸序列的CDR或可变区的抗PAD4抗体，从期望长时间维持血中半衰期的观点出发，该恒定区优选为人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的恒定区。
只要具有与PAD4的结合能力(优选与PAD4的KD值为100pM以下，更优选为90pM以下，更进一步优选为80pM以下)、且维持中和PAD4的瓜氨酸化活性的特性，则本发明的抗PAD4抗体及其抗原结合片段中也包括在具有上述特定的CDR的氨基酸序列的抗体与PAD4的结合时发生竞合的抗PAD4抗体及其抗原结合片段。作为在具有上述特定的CDR的氨基酸序列的抗体与PAD4的结合时发生竞合的抗体，可例示出在PAD4的包含345、347和348位的区域具有表位的抗体。但是，不包括G8抗体。
该抗体可以通过在具有上述那样的CDR序列的抗体与PAD4的结合体系中共存来获得(筛选)或进行评价。例如，可以通过利用国际公开第2016/175236号记载的表面等离子体共振(SPR)法进行筛选来获得。
针对包含上述特定的CDR的氨基酸序列的抗PAD4抗体，与PAD4的结合发生竞合的抗PAD4抗体可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊抗体、骆驼抗体等任意的动物来源的抗体，也可以是作为这些抗体的组合的嵌合抗体或人源化抗体，优选为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本发明中的抗PAD4抗体或其抗体片段例如可以通过使用包含重组载体的转化体(宿主)细胞来制造，所述重组载体包含编码本发明的抗PAD4抗体或其抗体片段的下述核酸分子。
＜核酸分子＞
本发明的一个实施方式涉及编码本发明的抗PAD4抗体或其抗体片段的多核苷酸即核酸分子。只要是编码包含上文所述的CDR、可变区或全长氨基酸序列的多肽的核酸分子，就没有特别限制，作为例子，例如可举出包含分别编码下述氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸：
a)作为重链可变区和轻链可变区的、序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列，
b)作为重链可变区和轻链可变区的、序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列，
c)作为重链可变区和轻链可变区的、序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列，
d)作为重链可变区和轻链可变区的、序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列，及
e)作为重链可变区和轻链可变区的、序列号28的氨基酸编号1～120的氨基酸序列和序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列。
作为本发明的核酸分子的另一例，可举出包含分别编码下述氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸：
a)作为重链和轻链的、序列号16和17所示的氨基酸序列，
b)作为重链和轻链的、序列号18和19所示的氨基酸序列，
c)作为重链和轻链的、序列号20和21所示的氨基酸序列，
d)作为重链和轻链的、序列号22和23所示的氨基酸序列，及
e)作为重链和轻链的、序列号28和27所示的氨基酸序列。
作为本发明的核酸分子的其它例，可举出下述多核苷酸：
包含作为抗PAD4抗体的重链全长的序列号32所示的碱基序列、以及作为抗PAD4抗体的轻链全长的序列号33所示的碱基序列的多核苷酸，
包含作为抗PAD4抗体的重链全长的序列号34所示的碱基序列、以及作为抗PAD4抗体的轻链全长的序列号35所示的碱基序列的多核苷酸，
包含作为抗PAD4抗体的重链全长的序列号36所示的碱基序列、以及作为抗PAD4抗体的轻链全长的序列号37所示的碱基序列的多核苷酸，
包含作为抗PAD4抗体的重链全长的序列号38所示的碱基序列、以及作为抗PAD4抗体的轻链全长的序列号39所示的碱基序列的多核苷酸，
包含作为抗PAD4抗体的重链全长的序列号40所示的碱基序列、以及作为抗PAD4抗体的轻链全长的序列号31所示的碱基序列的多核苷酸。
需要说明的是，本发明的核酸分子只要编码具有与PAD4的结合能力、且中和PAD4的瓜氨酸化活性的单克隆抗体，则也可以是包含在严格条件下与重链可变区或轻链可变区的碱基序列的互补链DNA杂交的多核苷酸的核酸分子。在此，作为严格的条件，例如可举出在Southern杂交后，以相当于68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度进行清洗的条件。
本发明的核酸分子可以编码重链和轻链的恒定区和可变区的全部，也可以仅编码重链和轻链的可变区。编码恒定区和可变区全部时的重链和轻链的恒定区的碱基序列优选Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986、The Journal of Biological Chemistryvol.257,p1516,1982及びCell vol.22,p197,1980中记载的碱基序列。
将国际公开第2016/143753号中记载的编码人源化抗PAD4抗体G8的重链及轻链的全长的碱基序列示于序列号30及31。例如，通过对该碱基序列进行修饰，能够得到编码本发明的抗PAD4抗体或其抗体片段的核酸分子。
另外，本发明的核酸分子例如可以通过以下的方法得到。首先，使用市售的RNA提取试剂盒从杂交瘤等细胞制备总RNA，使用随机引物等，利用逆转录酶合成cDNA。接着，在已知的人抗体重链基因、轻链基因的可变区中，通过引物分别使用了保守的序列的寡核苷酸的PCR法，对编码抗体的cDNA进行扩增。关于编码恒定区的序列，可以通过利用PCR法对已知的序列进行扩增来得到。DNA的碱基序列可以通过组入测序用质粒中等、通过常规方法来确定。
或者，通过化学合成可变区或其一部分的序列并与包含恒定区的序列结合，也能够得到编码本发明的单克隆抗体的DNA。
本发明还提供包含本发明的核酸分子的重组载体及包含该重组载体的转化体(宿主细胞)。
作为重组载体，可以是在大肠杆菌(Echerichia coli)这样的原核细胞中能够表达的载体(例如pBR322、pUC119或它们的衍生品)，但优选在真核细胞中能够表达的载体，更优选在哺乳动物来源的细胞中能够表达的载体。作为能够在哺乳动物来源的细胞中表达的载体，例如可举出pcDNA3.1(Invitrogen公司制)、pConPlus、pcDM8、pcDNA I/Amp、pcDNA3.1、pREP4这样的质粒载体、pDON-AIDNA(宝Bio公司制)等病毒载体。可以是包含重链编码序列和轻链编码序列的1个载体，也可以是包含重链编码序列的载体和包含轻链编码序列的载体的2个载体。
导入本发明的重组载体的转化体可以是大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞，但优选真核细胞，更优选哺乳动物来源的细胞。作为哺乳动物来源的细胞，例如可举出中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、COS、骨髓瘤、BHK、HeLa、Vero、293、NS0、Namalwa、YB2/0等。
通过说明书中记载的方法或公知的方法得到的抗PAD4抗体或其抗原结合片段可以纯化至均匀。抗体等的分离、纯化可以使用通常的蛋白中使用的分离、纯化方法。例如，通过适当选择、组合亲和层析法等色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等，可以对抗体进行分离、纯化(Antibodies：A Laboratory Manual.EdHarlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)，但并不限定于这些。作为亲和层析法中使用的柱，可举出蛋白A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗体结合柱、抗原结合柱等。例如，作为蛋白A柱，可举出Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(AmershamBiosciences)等。
＜组合物＞
本发明的一个实施方式涉及一种组合物，其包含上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段。当使用该组合物时，能够高效地检测PAD4。另外，还能够高效地抑制由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化。另外，还能够高效地抑制细胞中的NETosis。另外，还能够预防或治疗RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病。该组合物所含有的成分只要包含本发明的实施方式的抗PAD4抗体或抗体片段，则除此以外没有特别限定，例如可以含有缓冲液。对于该组合物，可以应用后述的抑制剂和药物组合物的各种实施方式(例如，可以含有载体等)中的1种以上。
本发明的一个实施方式涉及一种由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化抑制剂，其包含上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段。当使用该抑制剂时，能够高效地抑制由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化。上述抑制剂带来的瓜氨酸化活性的降低率可以为20、30、40、60、80％以上，也可以在这些任意2个值的范围内。该降低率例如也可以用将使用PBS时的降低率记为0％时的相对比例来表示。在本发明的一个实施方式中，“剂”例如包含用于研究或治疗的组合物。上述抑制剂例如包含RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的预防或治疗剂。上述抑制剂例如可以在体外或体内使用。上述抑制剂可以包含上述本发明的实施方式的组合物。本发明的一个实施方式涉及一种由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化抑制方法，其包含使上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段与PAD4接触的工序。本发明的一个实施方式涉及一种由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化抑制方法，其包含对患者给予上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段的工序。上述抑制方法包括为了研究或治疗而进行的抑制方法。本发明的一个实施方式涉及上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段的用于生产由PAD4引起的蛋白的瓜氨酸化抑制剂的用途。
本发明的一个实施方式涉及一种细胞中的NETosis的抑制剂，其包含上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段。当使用该抑制剂时，能够高效地抑制由PAD4引起的细胞中的NETosis。上述抑制剂对细胞中的NETosis活性的降低率可以为20、30、40、60、80％以上，也可以在这些任意2个值的范围内。该降低率例如可以用将使用PBS时的降低率记为0％时的相对比例来表示。在本发明的一个实施方式中，“剂”例如包含用于研究或治疗的组合物。上述抑制剂例如包含RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的预防或治疗剂。上述抑制剂例如可以在体外或体内使用。上述抑制剂可以包含上述本发明的实施方式的组合物。本发明的一个实施方式涉及一种细胞中的NETosis的抑制方法，其包含使上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段与PAD4接触的工序。本发明的一个实施方式涉及一种细胞中的NETosis的抑制方法，其包含对患者给予上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段的工序。上述抑制方法包括为了研究或治疗而进行的抑制方法。本发明的一个实施方式涉及是上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段的用于生产细胞中的NETosis抑制剂的用途。
本发明的一个实施方式涉及一种药物组合物，其包含上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段。当使用该药物组合物时，能够预防、治疗和防止RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病复发。上述药物组合物可以包含药理学上容许的1个以上的载体。上述药物组合物例如包括RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的治疗用药物组合物、RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的预防用药物组合物。上述药物组合物可以包含上述本发明的实施方式的组合物。
本发明的一个实施方式涉及一种疾病的预防、治疗或复发预防方法，其包含将有效量的上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段(或含有抗PAD4抗体或其抗体片段的药物组合物)给予患者的工序。上述疾病例如包括RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病。本发明的一个实施方式涉及上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段(或含有抗PAD4抗体或其抗体片段的药物组合物)的用于预防、治疗或防止RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病复发的用途。
本发明的一个实施方式涉及上述本发明的实施方式的抗PAD4抗体或其抗体片段(或含有抗PAD4抗体或其抗体片段的药物组合物)的用于生产RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防剂、治疗剂或复发预防剂的用途。
在本发明的一个实施方式中，“剂”可以是包含有效成分和药理学上容许的1个以上的载体的药物组合物。在本发明的一个实施方式中，“药物组合物”可以通过例如将有效成分与上述载体混合并采用制剂学的技术领域中已知的任意方法来制造。另外，药物组合物只要是用于预防或治疗的组合物，其使用方式就没有限定，可以是有效成分单独，也可以是有效成分与任意成分的混合物。
药物组合物在RA中的治疗或/和预防效果例如可以通过表示关节炎评分、RA评分、肿胀宽度、图像诊断、修正后的总Sharp(modified Total Sharp)评分、疾病活动评分(Disease Activity Score，DAS)、美国风湿协会(ACR)制作的风湿的活动性评价基准的达成率的ACR 20、ACR 50、ACR 70或疾病标记物来进行评价。在用关节炎评分进行评价时，例如在药物组合物给予时的患者的关节炎评分与未给予时的关节炎评分相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。或者，在药物组合物给予时的患者的关节炎评分与阴性对照物质给予时的患者的关节炎评分相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。上述减少例如可以为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1点以下，也可以在这些任意2个值的范围内。或者，在药物组合物给予时的患者的关节炎评分的图表面积与未给予时的关节炎评分图表面积相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。或者，在药物组合物给予时的患者的关节炎评分图表面积与阴性对照物质给予时的患者的关节炎评分图表面积相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。上述减少例如可以是100、90、80、70、60、50、40、30、20、10％以下，也可以在这些任意2个值的范围内。
药物组合物在全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎中的治疗或/和预防效果例如可以通过各脏器中的障碍、尿蛋白量、尿蛋白评分、存活率、病理评价评分、血中自身抗体产生量、血中补体第三及第四补体成分(C3及C4)量或疾病标记物来进行评价。另外，也可以通过对这些进行分值化而得到的SLE疾病活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)、将疾病活动性与1个月前进行比较的英岛狼疮评定组指数(British Isles Lupus AssessmentGroup(BILAG)index)、对医生对患者的总体疾病活动性进行评价的医生整体评估(physician’s global assessment，PGA)、对它们进行综合评价的SLE反应者指数(SLEresponder index，SRI)4等来进行评价。在用尿蛋白量进行评价的情况下，例如，在药物组合物给予时的患者的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比与未给予时相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。或者，药物组合物给予时的患者的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比与阴性对照物质给予时的患者的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。或者，在药物组合物给予时的患者的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比的图表面积与未给予时的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比图表面积相比显著性地减少的情况下，可以判断为有治疗或/和预防效果。或者，药物组合物给予时的患者的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比与阴性对照物质给予时的患者的尿中白蛋白量或白蛋白/肌酐比相比显著性地减少时，可以判断为有治疗或/和预防效果。上述减少例如可以是100、90、80、70、60、50、40、30、20、10％以下，也可以在这些任意2个值的范围内。
药物组合物在移植物抗宿主病中的治疗或/和预防效果例如可以通过特征性的脏器可见的改善效果、类固醇减量效果等来进行评价。在皮肤病变中，对于多态性皮肤萎缩、硬皮病用硬化性病变的改善、肝病变，例如可以通过总胆红素、ALP、AST、ALT的改善来进行评价。另外，对于肾病，例如也可以用尿蛋白量、尿中白蛋白/肌酐比来进行评价。该情况下的治疗或/和预防效果的判定可以与上述SLE的情况相同。
在此，“患者”包括人、或除人以外的哺乳动物(例如小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、老鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛、马、猫、狗、狨猴、猿、或黑猩猩等中的1种以上)。另外，患者也可以是诊断为RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病发病的患者。另外，患者也可以是诊断为由于细胞中的瓜氨酸化抑制而发病了能够治疗的疾病的患者。另外，患者也可以是诊断为由于细胞中的NETosis抑制而发病了能够治疗的疾病的患者。
在此，“治疗”包括哺乳动物、特别是人的疾病的任意治疗，包括抑制疾病症状、即阻止其进展或使疾病或症状消失、以及减轻疾病症状、即引起疾病或症状的消退、或症状进展的延缓。
另外，“预防”包括在哺乳动物、特别是人中防止上述疾病的发病。
另外，“预防复发”包括在哺乳动物、特别是人中防止反复缓解、复发的上述疾病的复发。
本发明的抗PAD4抗体或其抗原结合片段、或者含有抗PAD4抗体或其抗体片段的药物组合物的给药方式没有特别限制，可以通过经口给药、非经口给药(例如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药、脑内给药、脊髓内给药、其他局部给药)中的任一给药途径对包括人在内的哺乳类给药。
用于经口给药和非经口给药的剂型及其制备方法是本领域技术人员公知的，通过将本发明的抗体与药学上容许的载体等配合，可以制造药物组合物。
用于非经口给药的剂型可举出注射用制剂(例如点滴注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、脑内给药制剂、脊髓内给药制剂)、外用剂(例如软膏剂、糊剂、洗剂)、栓剂吸入剂、眼剂、眼软膏剂、点鼻剂、点耳剂、脂质体剂等。特别是在期望直接作用于中枢神经组织的情况下，也可以利用渗透压泵医疗用微型泵持续地注入，也可以在与纤维蛋白糊等混合而制成缓释制剂的基础上留置在患部组织中。
例如，注射用制剂通常通过将抗体溶解于注射用蒸馏水中来制备，但根据需要可以添加溶解辅助剂、缓冲剂、pH调节剂、等渗剂、无痛化剂、防腐剂、稳定剂等。另外，也可以制成用时制备用的冷冻干燥制剂。
用于经口给药的剂型可举出固体或液体的剂型，具体而言可举出片剂、包覆片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、注射剂、锭剂等。
本发明的药物组合物可以进一步含有治疗上有效的其他药剂，另外，根据需要还可以配合杀菌剂、消炎剂、维生素类、氨基酸等成分。
作为药理学上容许的载体，例如可举出固体制剂中的赋形剂、润滑剂、粘合剂及崩解剂、或液态制剂中的溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂及无痛化剂等。此外，根据需要，也可以适当、适量使用通常的防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、湿润剂等添加物。
本发明的抗体的给药量例如基于给药途径、疾病的种类、症状的程度、患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度、药物动态和毒物学特征等药理学上的见解、有无利用药物递送系统、以及作为其他药物的组合的一部分来给药等各种因素由医生决定，但通常每位成人(体重60kg)，经口给药时可以为1～5000μg/天、优选10～2000μg/天、进一步优选50～2000μg/天、注射给药时为1～5000μg/天、优选5～2000μg/天、进一步优选50～2000μg/天，分1次或数次给药。向全身非经口给药时，可以以1天、1周、1月每体重10～100000μg/kg、更优选100～50000μg/kg、进一步优选500～20000μg/kg给药1次、或以1年1～7次的间隔给药。在利用渗透压泵等局部给药时，通常可以以每位成人(体重60kg)10～100000μg/天、更优选100～10000μg/天、进一步优选500～5000μg/天的速度持续注入。
实施例
以下，举出实施例对本发明更具体地进行说明，但这些说明并不是为了限制本发明的范围。
＜实施例1＞抗PAD4抗体的化学稳定性确认
对国际公开第2016/143753号中记载的包含人源化抗PAD4抗体G8的CDR的可变区的化学稳定性进行评价。通过将编码受试抗体G8的轻链和重链的氨基酸序列的DNA插入到CMV启动子的下游，构建表达lgG的哺乳动物细胞用表达载体。轻链和重链的DNA序列分别使用序列表的序列号27和26。使用基因导入试剂ExpiFectamine CHO Transfection Kit(LifeTechnologies)，将上述表达载体导入到ExpiCHO(LifeTechnologies)中。在基因导入后培养14天后，获得培养上清液。使用开放柱，通过使用了蛋白A树脂(GE Healthcare、MabSelect SuRe)的亲和层析法，从培养上清液中纯化IgG。将结合在蛋白A树脂上的IgG用6Column Volume的PBS(pH为7.2)清洗。然后，用pH为4.0的Arg-Antibody Elution Buffer(Nacalai)洗脱，迅速中和，使pH为中性附近。为了提高纯化纯度，使用AKTA prime plus(GEHealthcare)，将蛋白A柱纯化后的IgG用CHT(ceramic hydroxyapatite Type II树脂)(Bio-rad)纯化。将结合在CHT上的IgG用NaCI浓度的梯度洗脱，回收目标级分后，用使用了PD-10(GE Healthcare)的凝胶过滤色谱法将溶液替换为PBS(pH7.4)。将受试抗体浓缩至约10mg/mL的浓度，在4℃或37℃下保存2周。
包含受试抗体G8的CDR的可变区的化学稳定性通过使用了液相色谱法/质谱分析(LC-MS)的肽谱分析来进行评价。对于受试抗体，在盐酸胍(和光纯药)存在下，在37℃下使其与还原剂二硫苏糖醇(和光纯药)反应2小时，实施还原处理。通过加入烷基化剂碘乙酰胺(iodoacetamide，和光纯药)使其反应30分钟，将在还原反应中产生的硫醇基烷基化。接着，使用脱盐柱Zeba Spin column(Thermo Fisher Scientific)对反应液进行缓冲液更换，在2mol/L尿素(SIGMA)、0.1mol/L NH4HCO3(和光纯药)、1mmol/L CaCl2(和光纯药)、0.8μg胰蛋白酶(和光纯药)的条件下在37℃下使其反应一晚。将得到的酶消化物作为LC-MS测定样品。
对通过胰蛋白酶消化得到的肽进行反相色谱法分离，用质谱分析装置获得MS和MS/MS谱，由此实施肽谱分析。
LC按以下参数实施。
设备：ACQUITY UPLC(Waters)
流动相：含有A＝0.1％甲酸的超纯水、含有B＝0.1％甲酸的乙腈
分离方法：线性梯度分离(60分钟，从％B＝1到40)
流速：0.2mL/min
柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 column，300埃，1.7μm，2.1x150mm(Waters)
柱温箱的温度：40℃
样品量：30μL
检测波长：215nm
MS和MS/MS按以下参数实施。
装置：Synapt(Waters)
TOF模式：V模式
离子化法：ESI阳极
MS测量范围：50-2000Da
MS锥电压：24V
扫描时间：0.4s
MS/MS方式：MSE
Trap CE电压：Low energy 6V，High energy ramp 20-40V
使用Biopharma Lynx Ver.1.3.3(Waters)分析得到的质量数据。
翻译后修饰的比例通过以下的方法计算。首先，使用Biopharma Lynx提取与受试抗体的序列一致的肽，对MS/MS可获得的肽(MS/MS b/y ion found≥2)进行分析。由检测出的全部肽的MS强度和包含翻译后修饰的肽的MS强度的比例算出翻译后修饰的比例。
通过对受试抗体G8纯化后在4℃保存的样品和在37℃下保存2周的样品的肽谱分析，鉴定在重链的框架区的第84位的天冬酰胺残基和第85位的丝氨酸残基之间被剪切的肽。就纯化后在4℃保存的样品而言，可知被剪切的肽的比例在含有该氨基酸的肽中也有4.6％，相应部位有可能被潜在剪切。另外，在受试抗体内的其他天冬酰胺残基-丝氨酸残基之间未鉴定到剪切，在第84位的天冬酰胺残基与第85位的丝氨酸残基之间是特异性的。
由于在天冬酰胺残基与丝氨酸残基之间被剪切，因此制成了将第84位的天冬酰胺残基替换为丝氨酸残基的人源化抗PAD4抗体G8ss。对受试抗体G8ss纯化后在4℃下保存的样品和在40℃下保存2周的样品进行了肽谱分析。其结果，在任一保存条件下都未检测到在第84位丝氨酸残基和第85个丝氨酸残基之间被剪切的肽。由以上可知，在人源化抗PAD4抗体中，第84位为丝氨酸残基的化学稳定性更高。
受试抗体G8和G8ss与人PAD4蛋白的结合亲和性通过使用表面等离子体共振装置Biacore T200(GE Healthcare)测定HBS-EP+中的解离常数(KD)来确定。使用BiotinCapture Kit(GE Healthcare)将生物素标记的人PAD4蛋白固定化于传感器芯片。使用HBS-EP+将所述PAD4蛋白调整为0.25μg/mL，作为配体溶液。将配体溶液以10μL/min的流速添加到流动池中30秒，然后添加60秒的HBS-EP+。将未添加配体溶液的流动池作为参比池。使用HBS-EP+将受试抗体从数百pM调整成数nM，作为分析液。另外，将电泳缓冲液作为空白液。使用single-cycle法在30μL/min的流速下将空白液或分析液添加180秒，使解离时间为1200秒。从添加了空白液或分析液时的添加了配体的流动池的传感图(sensorgram)中减去参比池的传感图，进而从添加了分析液的传感图中减去添加了空白液的传感图，将差值用于分析。使用Biacore T200 Evaluation software(GE Healthcare)，使用1：1结合模型来算出结合参数。受试抗体G8以结合速度常数kon＝7.70×106(1/Ms)、解离速度常数koff＝1.65×10-3(1/s)、解离常数KD＝214pM的结合亲和性与人PAD4蛋白结合。受试抗体G8ss以结合速度常数kon＝6.37×106(1/Ms)、解离速度常数koff＝1.76×10-3(1/s)、解离常数KD＝276pM的结合亲和性与人PAD4蛋白结合。由以上可知，在人源化抗PAD4抗体中，即使将第84位替换为丝氨酸残基，与人PAD4的结合亲和性也不变。
＜实施例2＞用于改良互补性决定区的氨基酸替换部位的确定
为了提高人源化抗人PAD4抗体G8与人PAD4的亲和性及功能性，进行了基于Fab(是指分子形式为Fab，以下同样地表述)噬菌体展示的互补性决定区的改良。互补性决定区的改良分2个阶段实施，在第一阶段确定提高与人PAD4的亲和性的单氨基酸替换，在第二阶段确定这些单氨基酸替换的多个组合(Fujino et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2012Vol.428(3),p395)。使用亲本克隆G8的轻链和重链可变区构建Fab噬菌体展示载体。将其作为模板，通过基于定点诱变(site-directed mutagenesis)PCR及重叠延伸(overlapextension)PCR的多阶段的PCR反应，构建将构成抗体的6个互补性决定区(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、HDRC3)的全部氨基酸残基1个个依次全部替换为20种天然氨基酸的、总括性单氨基酸替换突变体库。通过Fab噬菌体展示法(Fujino et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2012Vol.428(3),p395)，以重组人PAD4蛋白(生物素标记PAD4)为bait，重复数轮总括性单氨基酸替换突变体库的浓缩。使用下一代测序仪(IonGeneStudio S5 System)对浓缩前(刚构建后)的库和浓缩后的库中所含的各克隆的轻链和重链可变区的碱基序列进行分析。首先，从浓缩前后的各库获得数百万读出的序列数据，算出互补性决定区中的全部单氨基酸替换突变体的存在频率。接着，算出浓缩前的库和浓缩后的库中的全部单氨基酸替换突变体的存在频率的变化倍率(浓缩比)，将基于库浓缩的浓缩比的大小作为指标，确定认为对提高与人PAD4蛋白的亲和性有用的单氨基酸替换。此时，将有可能影响抗体的物性的单氨基酸替换体(赖氨酸和精氨酸)的数据除外。最后，考虑这些单氨基酸替换的总数和氨基酸序列上的分布状态，在第二阶段确定所构建的自定义库中导入氨基酸替换的位置。
在亲本克隆G8中，确定将氨基酸替换导入到LCDR2(序列表的序列号5)的第2位的天冬酰胺、LCDR3(序列表的序列号25)的第4位的天冬氨酸、HCDR2(序列表的序列号24)的第11位的酪氨酸、第12位的甘氨酸、第13位的丙氨酸、第14位的丙氨酸、第15位的缬氨酸、第17位的甘氨酸、HCDR3(序列表的序列号11)的第1位的丙氨酸。
＜实施例3＞改良了互补性决定区的人源化抗人PAD4抗体的创制
首先，通过组合多个以提高亲和性为目的的上述的有用氨基酸替换，设计了正式的互补性决定区改良用自定义库。接着，构建在LCDR3和HCDR2中插入了stop密码子的亲本克隆G8 Fab噬菌体展示的载体，通过实施以Fab噬菌体展示载体为模板的基于Kunkel法的部位特异性突变导入法(Fellouseet al.,J.Mol.Biol.2007 Vol.373,p924)，构建将互补性决定区根据上述设计进行随机化而得到的互补性决定区改良用自定义库。将人PAD4蛋白(His tag PAD4、GST-biotin-PAD4)作为bait，重复数轮基于Fab噬菌体展示的库浓缩。PAD4由于存在结构根据有无钙离子而变化的可能性，因此在氯化钙存在下和未存在下进行选择，实施了浓缩研究。
作为bait使用的重组蛋白如下制备。通过将在人PAD4(残基1至残基663)的N末端侧附加GST标签-Avi标签而得到的物质插入pGEX-6P-1构建表达载体，制备重组蛋白。将保有表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株在LB培养基5mL中进行预培养后，将1mL的预培养液接种于50mL LB培养基中，在37℃下培养至对数生长期(OD600＝1.0)后，利用100μM的IPTG，以18℃/200rpm表达培养约18小时。将回收的菌体清洗后，进行超声波破碎并溶菌，回收上清液。使市售的生物素连接酶(Avidity，BirA)与上清液在4℃下反应约18小时，通过离心分离回收上清液。上清液中含有的GST标签-Avi标签-人PAD4使用GS4B树脂(GEHealthcare)纯化，使用PreScission Protease(GE Healthcare)剪切GST标签，回收Avi标签-人PAD4。
在氯化钙存在下和未存在下的条件下，克隆浓缩4～6轮得到的Fab库中包含的各克隆，使用测序仪鉴定从各条件随机选择的384克隆的序列。将使384克隆的Fab全部转化为全长抗体(人IgG1/人λ)而成的表达用DNA片段化，使用基因导入试剂ExpiFectamine293Transfection Kits(LifeTechnologies)，将上述DNA导入Expi 293(LifeTechnologies)。基因导入后培养5天后获得培养上清液。通过使用了Protein A树脂(GE Healthcare、PreDictor MabSelect SuRe LX)的亲和层析法从培养上清液中纯化受试抗体(IgG)(是指分子形式为IgG，以下同样地进行表述)。对纯化后的受试抗体溶液使用透析装置(Merck、D-Tube96 Dialyzer)溶液置换成PBS pH7.4。
对受试抗体进行基于表面等离子体共振(SPR)的抗原结合确认。在SPR实验中使用表面等离子体共振装置Biacore T200(GE Healthcare)确认了电泳缓冲液HBS-EP+(10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％(v/v)Surfactant P20、pH为7.4)中的受试抗体的抗原结合。使用Biotin Capture Kit(GE Healthcare)将生物素标记的人PAD4蛋白固定化于传感器芯片。使用HBS-EP+将所述PAD4蛋白调整为4μg/mL，作为配体溶液。将配体溶液以10μL/min的流速添加到流动池中30秒，然后添加60秒的HBS-EP+。将未添加配体溶液的流动池作为参比池。使用HBS-EP+将受试抗体调整为10nM，作为分析液。另外，将电泳缓冲液作为空白液。将空白液或分析液以30μL/min的流速添加120秒，得到结合相的传感图。接着，通过添加180秒的电泳缓冲液，得到解离相的传感图。从添加了空白液或分析液时的添加了配体的流动池的传感图中减去参比池的传感图，进而从添加了分析液的传感图中减去添加了空白液的传感图，将差值用于分析。使用Biacore T200 Evaluation software v3.1(GEHealthcare)，确认了结合信号及非特异性吸附。
从改良了互补性决定区的克隆中确定了与G8相比与人PAD4蛋白的亲和性提高、且对传感器芯片的非特异吸附少的克隆，以及用G8进行实施例4以后的高级评价的5个克隆(G8、Lib2(4R)-1-47、Lib1(6R)-1-39、Lib1(6R)-2-37、Lib2(5R)-2-25)。将5个克隆的CDR序列示于表1。将5个克隆与人PAD4的结合亲和性示于表2。
对受试抗体(G8、Lib2(4R)-1-47、Lib1(6R)-1-39、Lib1(6R)-2-37、Lib2(5R)-2-25)的人PAD4酶抑制活性进行评价。以受试抗体的终浓度达到600、200、66.67、22.22、7.41、2.47、0.82、0.27、0.09nM的方式，将人PAD4(终浓度为10nM)与含有1mM DTT、150mM NaCl的50mM HEPES缓冲液(pH为7.6)混合。在37℃下孵育1小时后，边搅拌边加入BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)，进一步加入CaCl2充分搅拌(BAEE的终浓度为10mM，钙离子的终浓度为10mM)。将该溶液在37℃下孵育3小时后，使用含有2，3-丁二酮单肟和氨基硫脲的混合液对甲苯磷化后的BAEE的瓜氨酸化残基进行比色定量。
受试抗体(G8、Lib2(4R)-1-47、Lib1(6R)-1-39、Lib1(6R)-2-37、Lib2(5R)-2-25)抑制人PAD4的酶活性，IC50分别为21.6、9.6、8.7、13.4、8.3nM。
表1
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表2
克隆 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(pM)
G8 7.03×106 1.46×10-3 208
Lib2(4R)-1-47 9.39×106 1.64×10-4 17.5
Lib1(6R)-1-39 5.90×106 1.08×10-4 18.3
Lib1(6R)-2-37 10.1×106 3.61×10-4 35.8
Lib2(5R)-2-25 12.8×106 2.02×10-4 15.8
对于5个克隆、G8、Lib2(4R)-1-47、Lib1(6R)-1-39、Lib1(6R)-2-37及Lib2(5R)-2-25)，将第84位的天冬酰胺替换为丝氨酸，分别记为G8ss、2-1-47、3-1-39、3-2-37、及4-2-25。通过将编码受试抗体(G8ss、2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25)的轻链和重链的氨基酸序列的DNA插入到CMV启动子的下游，构建表达lgG的哺乳动物细胞用表达载体。各克隆的轻链的DNA序列分别使用编码序列表的序列号27、17、19、21和23的DNA序列，重链的DNA序列分别使用编码序列表的序列号11和12的DNA序列。使用基因导入试剂ExpiFectamine CHOTransfection Kit(LifeTechnologies)，将上述表达载体导入到ExpiCHO(LifeTechnologies)中。在基因导入后培养14天后，获得培养上清液，使用AKTA pure 25M(GE Healthcare)，通过使用了Protein A树脂(JSR Life Sciences、Amsphere A3 column)的亲和层析法从培养上清中纯化IgG。利用6Column Volume的100mM碳酸钠缓冲液(pH为11.0)对结合在Protein A树脂上的IgG进行清洗，然后利用6Column Volume的PBS(pH为7.2)(3×)进行清洗。然后，用pH为3.5的Gly-HCl缓冲液进行洗脱，通过迅速中和，使pH为中性附近。为了提高纯化纯度，用CHT(ceramic hydroxyapatite Type I树脂)(Bio-rad)对Protein A柱纯化后的IgG进行纯化，用NaCl浓度的梯度对结合在CHT上的IgG进行洗脱，回收目标级分后，使用透析法将溶液替换为PBS(pH为7.4)。
＜实施例4＞与人PAD4蛋白的结合亲和性
受试抗体(G8ss、2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25)与人PAD4蛋白的结合亲和性通过使用表面等离子体共振装置Biacore T200(GE Healthcare)测定HBS-EP+中的解离常数(KD)来确定。使用Biotin Capture Kit(GE Healthcare)将生物素标记的人PAD4蛋白固定化于传感器芯片。使用HBS-EP+将所述PAD4蛋白调整为0.5μg/mL，作为配体溶液。将配体溶液以10μL/min的流速添加到流动池中30秒，然后添加60秒的HBS-EP+。将未添加配体溶液的流动池作为参比池。使用HBS-EP+将受试抗体从数百pM调整成数nM，作为分析液。另外，将电泳缓冲液作为空白液。使用single-cycle法以30μL/min的流速将空白液或分析液添加180秒，使解离时间为1200秒。从添加了空白液或分析液时的添加了配体的流动池的传感图中减去参比池的传感图，进而从添加了分析液的传感图中减去添加了空白液的传感图，将差值用于分析。使用Biacore T200Evaluation software(GE Healthcare)，使用1：1结合模型来算出结合参数。将算出的结合参数示于表3。如表3所示，受试抗体G8ss以结合速度常数kon＝6.15×106(1/Ms)、解离速度常数koff＝1.22×10-3(1/s)、解离常数KD＝199pM的结合亲和性与人PAD4蛋白结合。改良了互补性决定区的抗体2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25与人PAD4蛋白的解离常数分别为31、48、73、20pM。
表3
克隆 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(pM)
G8ss 6.15×106 1.22×10-3 199
2-1-47 1.61×107 5.07×10-4 31
3-1-39 1.30×107 6.26×10-4 48
3-2-37 8.51×106 6.17×10-4 73
4-2-25 1.47×107 2.99×10-4 20
<实施例5>抗体的保存稳定性的评价
作为抗体的保存稳定性的指标之一，包括抗原结合活性的保持。根据抗体的不同，保存稳定性大大不同是公知的，例如，在DiCara et al.，mAbs，2018 Vol.10(7)，p1073所教示的抗体中，将在4℃或40℃下保存的抗体的抗原结合能力进行比较，在40℃下保存的抗体的相对抗原结合活性为在4℃下保存的抗体的相对抗原结合活性的30％以下至100％。
为了评价受试抗体(G8ss、2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25)的保存稳定性，将受试抗体以约10mg/mL的浓度溶解于柠檬酸缓冲液(50mM柠檬酸、150mM NaCl、pH为6.3)，在4℃或40℃下保存4周。
为了研究保存后有无抗原结合能力，进行使用了表面等离子体共振装置BiacoreT200(GE Healthcare)的抗原结合活性测定。将冷冻保存后的受试抗体、在4℃或40℃下保存4周后的受试抗体用电泳缓冲液HBS-EP+调整为10μg/mL。使用Series S SensorchipProtein A(GE Healthcare)将受试抗体溶液以10μL/min的流速添加到流动池2中60秒，固定化于传感器芯片。将流动池1作为参比池。从流动池1的结合量中减去流动池2的受试抗体添加结束后的55秒后的结合量，作为抗体结合量。接着，使用HBS-EP+将人PAD4(CaymanChemical company，Cat.10500)调整为50nM，作为分析液。将分析液以30μL/min的流速添加120秒，得到结合相的传感图。从流动池1的结合量中减去流动池2的分析液添加结束5秒前的结合量，作为抗原结合量。接着，通过添加180秒的电泳缓冲液，得到解离相的传感图。测定在25℃下进行。抗体结合量及抗原结合量使用数据分析程序(GE Healthcare、BiacoreT200 Evaluation Software v3.1)算出，将各条件下的抗原结合量除以抗体结合量，作为相对抗原结合量。冷冻保存后的受试抗体的相对抗原结合量和在4℃下保存的受试抗体的相对抗原结合量不变。将在4℃下保存4周后的各种受试抗体的相对抗原结合量与40℃下保存4周后的受试抗体的相对抗原结合量进行比较，作为抗原结合活性。
如表4所示，G8ss在40℃保存4周后的抗原结合活性为82.2％。2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25在40℃保存4周后，保持了90％以上的抗原结合活性。例如，如在Pisupati etal.，mAbs，2017Vol.9(7)，p1197中所教示的那样，抗体药品Remicade(注册商标)即使在40℃下保管1个月，抗原结合活性也保持80％以上。另外，作为抗体的生物活性的稳定性，与抗体制剂制备时的抗体的生物活性相比，优选保持80％以上、更优选90％以上的生物活性(例如参照国际公开公报WO2003/018056)。由以上可知，对于受试抗体G8ss、2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25，观察到良好的保存稳定性。
表4
克隆 40℃下保存1M
G8ss 82.2
2-1-47 95.6
3-1-39 93.9
3-2-37 94.7
4-2-25 97.0
<实施例6>体外的人PAD4的酶抑制活性的评价
对受试抗体(G8ss、3-2-37、3-1-39、4-2-25、2-1-47)的人PAD4酶抑制活性进行评价。按照受试抗体的终浓度达到600、200、66.67、22.22、7.41、2.47、0.82、0.27、0.09nM的方式，将人PAD4(终浓度为10nM)与含有1mM EDTA、1mM DTT、150mM NaCl的50mM HEPES缓冲液(pH为7.4)混合。在37℃孵育1小时后，边搅拌边加入BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)，进一步加入CaCl2充分搅拌(BAEE的终浓度为10mM，钙离子的终浓度为10mM)。将该溶液在37℃下孵育3小时后，使用含有2,3-丁二酮单肟和氨基硫脲的混合液对甲苯磷化后的BAEE的瓜氨酸化残基进行比色定量。
受试抗体(G8ss、3-2-37、3-1-39、4-2-25、2-1-47)抑制人PAD4的酶活性，IC50分别为20.3、15.3、8.8、7.6、12.2nM。
＜实施例7＞CAIA模型
使用抗胶原抗体诱导关节炎(CAIA)小鼠模型，进行受试抗体G8ss、2-1-47、3-1-39、3-2-37、4-2-25的药效评价。CAIA小鼠模型是关节风湿病(RA)及关节炎的小鼠模型。CAIA小鼠模型的制作方法按照小鼠关节炎引发用抗体鸡尾酒(Chondrex Inc.,Cat.53040)的试验方案进行。将实验条件的概要示于图1。在第0天，向9周龄的雌性Balb/c小鼠(6小鼠/组)的尾静脉静脉内给予抗胶原抗体混合液(1.5mg)。在第3天腹膜内给予25μg LPS(诱发炎症的物质)。在第3天的LPS给药4小时前静脉内给予(15mg/kg)受试抗体或对照抗体(人IgG1)。第3-10天按照以下的(i)～(iii)对关节炎评分进行评价。
(i)将评价部位定为四肢的各指、甲、关节。(ii)关节炎评分按照表5进行。(iii)关节炎评分用四肢的各指、甲、关节的合计值的平均来表示(最大值为16/小鼠)。将关节炎评分的评价结果示于图1。根据该结果可知，所有的受试抗体具有较高的RA治疗效果。
表5
评分 症状
0 任意关节均未见炎症
1 任意关节中的1个可见炎症时
2 任意关节中的2个可见炎症时
3 全部关节可见炎症时
4 全部关节可见炎症并且肢体整体红肿时
＜实施例8＞CIA模型
使用胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型，进行受试抗体3-2-37的药效评价。CIA小鼠模型通过对5-7周龄的雌性DBA/1小鼠在第1天、及从初次免疫起21天后这2次免疫牛型II胶原和弗氏佐剂来制作。从初次免疫起29天后，对关节炎发病的小鼠以0.3mg/kg、1mg/kg、或3mg/kg的用量向尾静脉内给予受试抗体(各组9只)。从初次免疫起36天后、及43天后也等量地给予3-2-37。按照以下(i)～(iii)对关节炎评分进行评价。(i)将评价部位定为四肢的各指、甲、关节。(ii)关节炎评分按照表6进行。(iii)关节炎评分用四肢的各指、甲、关节的合计值的平均来表示(最大值为16/小鼠)。将关节炎评分的评价结果示于图2。根据该结果可知，3-2-37与对照抗体给药组相比在本次设定的任意的用量下都在试验后半段，使关节炎评分平均显著性地降低了(Shirley-Williams的多重比较检验、*p<0.025,**p<0.005)。
表6
评分 症状
0 任意关节均未见炎症
1 任意关节中的1个可见炎症时
2 任意关节中的2个可见炎症时
3 可见甲的重度炎症和各指关节处的炎症时
4 可见伴随活动范围减少的肢体整体的重度炎症或关节的变形时
＜实施例9＞cGvHD模型
使用慢性移植物抗宿主病(cGvHD)小鼠模型，进行受试抗体3-2-37的药效评价。cGvHD小鼠模型通过向8周龄的雌性B6D2F1小鼠植入8-9周龄的雌性DBA/2小鼠的脾细胞来制作。该小鼠会发生在SLE患者中发生的狼疮性肾炎样的肾损害。脾细胞植入的前一天、2周后、4周后及6周后以3mg/kg或30mg/kg的用量向腹腔内给予受试抗体(各组13只)。从脾细胞植入的2周后至8周后，以每周1次的频率压迫小鼠的下腹部进行采尿，测定尿中的蛋白浓度和肌酐浓度。按照表7对脾细胞植入8周后的尿蛋白浓度进行评分。将尿蛋白评分的评价结果示于图3。根据该结果可知，在受试抗体3-2-37的30mg/kg的给予组中，与对照抗体给予组相比，确认到尿蛋白评分的显著性的减少(Shirley-Williams的多重比较检验，*p＜0.025)。另外，将尿中的蛋白/肌酐比小于3(Pro/Cre＜3)定义为未发病个体，将受试抗体3-2-37的30mg/kg给予组和对照抗体给予组的未发病率经时地图表化的结果示于图4。受试抗体给予组的未发病期的中间值为7周，而对照抗体给予组的未发病期间的中间值为4周，在受试抗体给予组可见显著性的未发病期的延长(Log Rank检验，p<0.05)。
表7
评分 尿蛋白浓度(mg/mL)
0 <0.3
1 0.3≤x<1
2 1≤x<3
3 3≤x<10
4 x≤10
＜序列表的说明＞
序列号1：抗PAD4抗体的HCDR1的氨基酸序列
序列号2：抗PAD4抗体的HCDR2的氨基酸序列(混合序列)
序列号3：抗PAD4抗体的HCDR3的氨基酸序列(混合序列)
序列号4：抗PAD4抗体的LCDR1的氨基酸序列
序列号5：抗PAD4抗体的LCDR2的氨基酸序列
序列号6：抗PAD4抗体的LCDR3的氨基酸序列(混合序列)
序列号7：抗PAD4抗体Lib2(4R)-1-47、2-1-47的HCDR2的氨基酸序列
序列号8：抗PAD4抗体Lib1(6R)-1-39、3-1-39的HCDR2的氨基酸序列
序列号9：抗PAD4抗体Lib1(6R)-2-37、3-2-37的HCDR2的氨基酸序列
序列号10：抗PAD4抗体Lib2(5R)-2-25、4-2-25的HCDR2的氨基酸序列
序列号11：抗PAD4抗体G8、G8ss、Lib2(4R)-1-47、2-1-47、Lib1(6R)-1-39、3-1-39、Lib2(5R)-2-25、4-2-25的HCDR3的氨基酸序列
序列号12：抗PAD4抗体Lib1(6R)-2-37、3-2-37的HCDR3的氨基酸序列
序列号13：抗PAD4抗体Lib2(4R)-1-47、2-1-47、Lib1(6R)-1-39、3-1-39的LCDR3氨基酸序列
序列号14：抗PAD4抗体Lib1(6R)-2-37、3-2-37的LCDR3的氨基酸序列
序列号15：抗PAD4抗体Lib2(5R)-2-25、4-2-25的LCDR3的氨基酸序列
序列号16：抗PAD4抗体2-1-47的重链全长的氨基酸序列
序列号17：抗PAD4抗体Lib2(4R)-1-47、2-1-47的轻链全长的氨基酸序列
序列号18：抗PAD4抗体3-1-39的重链全长的氨基酸序列
序列号19：抗PAD4抗体Lib1(6R)-1-39、3-1-39的轻链全长的氨基酸序列
序列号20：抗PAD4抗体3-2-37的重链全长的氨基酸序列
序列号21：抗PAD4抗体Lib1(6R)-2-37、3-2-37的轻链全长的氨基酸序列
序列号22：抗PAD4抗体4-2-25的重链全长的氨基酸序列
序列号23：抗PAD4抗体Lib2(5R)-2-25、4-2-25的轻链全长的氨基酸序列
序列号24：抗PAD4抗体G8、G8ss的HCDR2的氨基酸序列
序列号25：抗PAD4抗体G8、G8ss的LCDR3的氨基酸序列
序列号26：抗PAD4抗体G8的重链全长的氨基酸序列
序列号27：抗PAD4抗体G8、G8ss的轻链全长的氨基酸序列
序列号28：抗PAD4抗体G8ss的重链全长的氨基酸序列
序列号29：PAD4的氨基酸序列
序列号30：编码抗PAD4抗体G8的重链全长的碱基序列
序列号31：编码抗PAD4抗体G8、G8ss的轻链全长的碱基序列序列号32：编码抗PAD4抗体2-1-47的重链全长的碱基序列
序列号33：编码抗PAD4抗体2-1-47的轻链全长的碱基序列
序列号34：编码抗PAD4抗体3-1-39的重链全长的碱基序列
序列号35：编码抗PAD4抗体3-1-39的轻链全长的碱基序列
序列号36：编码抗PAD4抗体3-2-37的重链全长的碱基序列
序列号37：编码抗PAD4抗体3-2-37的轻链全长的碱基序列
序列号38：编码抗PAD4抗体4-2-25的重链全长的碱基序列
序列号39：编码抗PAD4抗体4-2-25的轻链全长的碱基序列
序列号40：编码抗PAD4抗体G8ss的重链全长的碱基序列
产业上的可利用性
本发明对RA或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防或治疗是有用的，在药品产业中具有高的利用价值。

Claims (28)

1.一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号2的氨基酸序列、HCDR3包含序列号3的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号6的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号7～10中的任一个氨基酸序列、HCDR3包含序列号11或12的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号13～15中的任一个氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号7的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号13的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号8的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号13的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号9的氨基酸序列、HCDR3包含序列号12的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号14的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号10的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号15的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号7的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号13的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号8的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号13的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号9的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号12的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号14的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号10的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3由序列号15的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
5.一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-3)重链可变区包含序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-3)重链可变区包含序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-3)重链可变区包含序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-3)重链可变区包含序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段。
6.根据权利要求5所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-4)重链可变区由序列号16的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号17的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-4)重链可变区由序列号18的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号19的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-4)重链可变区由序列号20的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号21的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-4)重链可变区由序列号22的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号23的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
7.根据权利要求5或6所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其选自：
a-5)重链由序列号16的氨基酸序列构成、轻链由序列号17的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
b-5)重链由序列号18的氨基酸序列构成、轻链由序列号19的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，
c-5)重链由序列号20的氨基酸序列构成、轻链由序列号21的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段，及
d-5)重链由序列号22的氨基酸序列构成、轻链由序列号23的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸是丝氨酸。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其与PAD4的KD值为100pM以下。
10.一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其为权利要求1～9中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，且将所述抗PAD4抗体或其抗体片段在40℃下保存1个月时，与该保存前的抗PAD4抗体或其抗体片段所具有的PAD4结合量相比，具有90％以上的结合量。
11.一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-1)的抗PAD4抗体或其抗体片段，且相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸为丝氨酸：
e-1)HCDR1包含序列号1的氨基酸序列、HCDR2包含序列号24的氨基酸序列、HCDR3包含序列号11的氨基酸序列、LCDR1包含序列号4的氨基酸序列、LCDR2包含序列号5的氨基酸序列、LCDR3包含序列号25的氨基酸序列的抗PAD4抗体或其抗体片段。
12.根据权利要求11所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-2)的抗PAD4抗体或其抗体片段，且相当于重链的第84位氨基酸的氨基酸为丝氨酸：
e-2)HCDR1由序列号1的氨基酸序列构成、HCDR2由序列号24的氨基酸序列构成、HCDR3由序列号11的氨基酸序列构成、LCDR1由序列号4的氨基酸序列构成、LCDR2由序列号5的氨基酸序列构成、LCDR3为由序列号25的氨基酸序列构成的抗PAD4抗体或其抗体片段。
13.一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-3)的抗PAD4抗体或其抗体片段：
e-3)重链可变区包含序列号28的氨基酸编号1～120的氨基酸序列、轻链可变区包含序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-4)的抗PAD4抗体或其抗体片段：
e-4)重链可变区由序列号28的氨基酸编号1～120的氨基酸序列构成、轻链可变区由序列号27的氨基酸编号1～105的氨基酸序列构成。
15.根据权利要求13或14所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其是e-5)的抗PAD4抗体或其抗体片段：
e-5)重链由序列号28构成，轻链由序列号27构成。
16.一种抗PAD4抗体或其抗体片段，其是权利要求11～15中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，且生成时发生的剪切小于总生成量的3％。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，抗体为中和抗体。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段，其中，抗体是序列号29所示的PAD4的结合抗体。
19.一种核酸分子，其包含编码权利要求1～15中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段的碱基序列。
20.一种重组载体，其包含权利要求19所述的核酸分子。
21.一种转化体，其包含权利要求20所述的重组载体。
22.一种药物组合物，其包含权利要求1～18中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其为关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂。
24.根据权利要求22或23所述的药物组合物，其为蛋白中的瓜氨酸化的抑制剂。
25.根据权利要求22～24中任一项所述的药物组合物，其为细胞中的NETosis的抑制剂。
26.权利要求1～18中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段、或者权利要求22～25中任一项所述的药物组合物的、用于预防或治疗关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的用途。
27.权利要求1～18中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段、或者权利要求22～25中任一项所述的药物组合物的、用于制造关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎或移植物抗宿主病的预防剂或治疗剂的用途。
28.一种关节风湿病或关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、或移植物抗宿主病的预防或治疗方法，其通过给予有效量的权利要求1～18中任一项所述的抗PAD4抗体或其抗体片段、或者权利要求22～25中任一项所述的药物组合物进行。
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