CN116855519A - 油莎豆CePP2C19基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油莎豆CePP2C19基因，所述CePP2C19基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；油莎豆CePP2C19基因是将干旱胁迫12 h油莎豆叶片的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物进行PCR扩增获得。油莎豆CePP2C19基因在提高植株耐旱性方面的应用：油莎豆中CePP2C19基因沉默后，干旱胁迫下，叶片萎蔫程度增加，干旱敏感度提高；CePP2C19基因超表达拟南芥株系在干旱胁迫下，相比较对照株系，叶片萎蔫及枯黄程度不明显，对干旱耐受，表明油莎豆CePP2C19基因表达能够提高植物耐旱性，为培育抗旱油莎豆新品系奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及油莎豆CePP2C19基因及应用。
背景技术
油莎豆(Cyperus esculentus)又称油莎草，是一种草本油料作物，产自于非洲地区，具有悠久的栽培历史。油莎豆块茎中油脂含量丰富，可榨取食用油，油莎豆在干旱条件下易减产，因而提高其耐旱性显得尤为重要。蛋白磷酸酶在植物细胞逆境信号转导中起到重要作用，植物磷酸酶被分为两个超家族PPs，即丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸酶和酪氨酸(Tyr)磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可进一步分为PP1s、PP2As、PP2Bs和PP2Cs。在大多数植物中，PP2Cs (Protein phosphatase 2C)是PPs最大的分类，通过系统发育分析将植物PP2Cs划分为13个分支，即A-M，在水稻、番茄及玉米等植物中，通过表达分析发现A亚族PP2C基因在干旱及ABA、盐碱等非生物胁迫下起重要作用，研究表明，在拟南芥及水稻中A类亚家族PP2Cs在干旱胁迫中起重要作用，能够负向调控脱落酸信号，而其在油莎豆中的作用却鲜见报道。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题，而提供了一种油莎豆CePP2C19基因及其应用。
油莎豆CePP2C19基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
油莎豆CePP2C19基因，以干旱胁迫12 h后的油莎豆叶片的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物：
CePP2C19F: ATGGCGGAGGTTTGTTGCG
CePP2C19R: TTACAATCTTCTAGCTC
进行PCR扩增获得。
一种重组植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。
所述的植物表达载体为pCAMBIA3301。
油莎豆CePP2C19基因在提高植株耐旱性方面的应用；
所述的植物为油莎豆或拟南芥。
本发明提供了油莎豆CePP2C19基因及其应用，所述CePP2C19基因的核苷酸序列如-所示。本发明的油莎豆CePP2C19基因是将干旱胁迫12 h油莎豆叶片的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物进行PCR扩增获得；一种TRV病毒介导的基因沉默载体pTRV2;一种植物表达载体pCAMBIA3301;油莎豆CePP2C19基因在提高植株耐旱性方面的应用；结果表明，干旱胁迫下，油莎豆CePP2C19基因沉默株系与对照组相比更加萎蔫，干旱敏感度提高，CePP2C19基因超表达拟南芥株系与对照组相比叶片变黄，枯萎程度不明显；本发明提供的油莎豆CePP2C19基因，能够增强植株耐旱性，为油莎豆抗旱性研究提供新的候选基因资源。
附图说明
图1：油莎豆叶片RNA提取；
图2：CePP2C19基因连接克隆载体的菌液PCR鉴定；
图3：pTRV2-CePP2C19重组载体的菌液PCR鉴定；
图4：干旱胁迫下油莎豆对照组及基因沉默组表型图；
图5：干旱胁迫下拟南芥对照组及CePP2C19基因沉默组干重、鲜重及含水量测定。
图6：pCAMBIA3301-CePP2C19重组载体的菌液PCR鉴定；
图7：干旱胁迫下拟南芥对照组及CePP2C19超表达组表型图；
图8：干旱胁迫下拟南芥对照组及CePP2C19超表达组MDA含量测定；
图9：干旱胁迫下拟南芥对照组及CePP2C19超表达组干重、鲜重及含水量测定。
具体实施方式
实施例1 油莎豆RNA提取及反转录
实验材料：吉林农业大学培育的油莎豆HJ2(Cyperus esculentus)，在油莎豆干旱胁迫12 h后，采摘叶片；实验步骤如下:
1、干旱胁迫下油莎豆叶片RNA提取
使用南京诺维赞公司RNA提取试剂盒对干旱胁迫下油莎豆叶片RNA进行提取，具体步骤如下：
（1） 利用液氮对油莎豆叶片样本进行充分研磨，取适量的研磨后样本，加入65℃预热的500 μL Buffer PRL（使用前加入5% β-巯基乙醇），立即剧烈涡旋振荡30-60 sec，使其充分裂解。
（2） 将裂解物在65℃水浴5 min，期间颠倒1-2次以帮助裂解，12000 rmp 离心10min。
（3） 转移上清至新的1.5 mL RNase-free离心管中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，立即吹打混匀。
（4） 将上述混合液转移至FastPure gDNA-Filter Column II中，12000 rmp 离心2 min，弃滤液。
（5） 将FastPure gDNA-Filter Column II放至新的Collection Tubes 2 mL，加入500 μL Buffer PRLPlus，12000 rmp离心30 sec，收集滤液。
（6） 向滤液中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇，立即吹打混匀。
（7） 将上述混合液转移至FastPure RNA Column IV中，12000 rmp离心2 min，弃滤液。
（8） 向FastPure RNA Column IV中加入700 μL Buffer PRW1，室温放置1 min，12000 rmp 离心30 sec，弃滤液。
（9） 向FastPure RNA Column IV中加入500 μL Buffer PRW2，12000 rmp 离心30sec，弃滤液。
（10） 重复步骤9。
（11） 将FastPure RNA Column IV吸附柱放回收集管中，12000 rmp离心2 min，去掉FastPure RNA Column IV中残留的Buffer PRW2。
（12） 将FastPure RNA Column IV转移至新的RNase-free Collection Tubes1.5 mL离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加30-100 μL的RNase-free ddH2O，室温放置2min，12000 rmp离心1min，获得RNA。
利用琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测，如图1所示，28SrRNA和18SrRNA清晰明亮且28SrRNA亮度约为18SrRNA的两倍，表明RNA提取完整。
2、cDNA第一条链的合成
取-80℃保存的RNA，按照反转录试剂盒的说明书进行反转录，反应体系见表1，反转录后的cDNA保存于-20℃冰箱备用。
表 反转录反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| 模板RNA | 1 μg |
| MonScriptTM5Xrtiii All-in-One Mix | 4 μL |
| MonScriptTMdsDNase | 1 μL |
| Nuclease-Free Water | To 20 μL |
反转录反应条件
37℃ 2 min
55℃ 15 min
85℃ 5 min
置于冰上冷却，得到cDNA用于后续反应，在-20℃冻存以备用。
实施例2 油莎豆CePP2C19基因编码区序列的克隆
以干旱胁迫下油莎豆叶片的cDNA为模板，设计特异性引物进行RT-PCR扩增，克隆引物：
CePP2C19F: ATGGCGGAGGTTTGTTGCG
CePP2C19R: TTACAATCTTCTAGCTC
以干旱胁迫下油莎豆叶片cDNA为模板进行扩增，RT-PCR扩增反应体系见表2，将扩增产物与pMD19-T克隆载体连接，并转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌落，进行菌液PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，在1146bp处获得一条清晰明亮的条带，表明克隆载体连接成功。（图2）
表2 RT-PCR反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| 模板cDNA | 1 μL |
| Forward Primer | 1 μL |
| Reverse Primer | 1 μL |
| 10x TransTaq-T Buffer | 5 μL |
| 2.5 mM dNTPs | 4 μL |
续表
| 试剂 | 用量 |
| Trans Taq-T DNA Polymerase | 0.5 μL |
| Nuclease-free Water | 37.5 μL |
实施例3 pTRV2-CePP2C19重组表达载体的构建及农杆菌转化
pTRV2是一种由TRV病毒介导的基因沉默载体，利用pTRV2载体中的EcoR Ⅰ及BamHⅠ酶切位点上下游序列及CePP2C19基因克隆引物设计同源重组引物。
同源重组引物：
pTRV2-CePP2C19F: gtgagtaaggttaccgaattcTATCTGAAGCCATACGTGATCC
pTRV2-CePP2C19R:
cgtgagctcggtaccggatccGTTATCGGCGCTCTGCTTTC
使用上述两种酶对pTRV2载体进行双酶切后，对产物进行DNA纯化，利用单片段无缝克隆试剂盒（莫纳生物科技有限公司）将目的片段与线性化载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌中，利用含有卡那霉素（50mg/L）的抗性平板进行阳性筛选，挑取单克隆摇菌后进行菌液PCR鉴定，目的条带大小为1146bp（图3），证明表达载体构建成功，命名为pTRV2-CePP2C19，并转入农杆菌中，具体转化步骤如下：
（1） 取-80°C保存的农杆菌感受态，在其即将融化时加入1μg质粒DNA，混匀，依次于冰上静置5 min、液氮5 min、37°C水浴5 min、冰浴5 min。
（2） 加入700 μL无抗生素的YEP液体培养基，于28°C振荡培养2~3 h。
（3） 6000 rpm离心1 min收菌，弃掉600 μL上清溶液，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含有卡那和利福平抗性的YEP固体培养基上。
（4） 放于28 ℃培养箱中倒置培养2-3天。
（5） 挑取培养基的单菌落，接种于有抗性的YEP液体培养基中，28℃ 180 rpm过夜培养。
（6） 对菌液进行PCR扩增检测，PCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳分析，选择目的片段大小正确的菌液，保存于甘油中，标记好放入-80℃冰箱存储。
实施例4 干旱胁迫下CePP2C19基因沉默株系的耐旱性分析
（1）将油莎豆种子放于37℃培养箱中进行催芽，选取长势一致的油莎豆苗置于水培液中培养，待10天后注射农杆菌菌液。
（2）将pTRV1、pTRV2、pTRV2-CePP2C19的农杆菌菌液放至28℃摇床中，摇至OD600值至0.8-1.0。
（3）5000 rpm，离心10 min，收集菌体，用含有10 mM MgCl2、10 mM MES、200 μM AS缓冲液，重新悬浮菌体，调至OD600至0.8-1.0。
（4）将pTRV1重悬液分别与pTRV2、pTRV2-CePP2C19重悬液1：1混合，室温静置3 h，注射油莎豆叶片。
（5）10天后利用30% PEG 6000进行干旱胁迫，与对照株系相比表型出现明显变化后拍照。
如图4所示，与对照株系相比，干旱胁迫下CePP2C19基因沉默株系叶片更加萎蔫、卷曲，如图5所示，在干旱胁迫条件下，对照株系鲜重高于CePP2C19基因沉默株系约0.4g，干重高约0.02g，含水量高约0.04%，表明CePP2C19基因的表达能够影响植株的耐旱性。
实施例5 pCAMBIA3301-CePP2C19重组载体的构建及农杆菌转化
利用pCAMBIA3301载体中的Bgl Ⅱ及BstE Ⅱ酶切位点上下游序列及CePP2C19基因克隆引物设计同源重组引物
同源重组引物：
pCAMBIA3301-CePP2C19:
gtcttgaccatggtagatcttATGGGGAGAGGAAGGGTGC
pCAMBIA3301-CePP2C19:
cgggaaattcgagctggtcaccTTATTGGTTAATGTGACG
使用上述两种酶对pCAMBIA3301载体进行双酶切后进行DNA纯化，利用单片段无缝克隆试剂盒（莫纳生物科技有限公司）将目的片段与线性化载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌中，利用含有卡那霉素（50mg/L）的抗性平板进行阳性筛选，挑取单克隆摇菌后菌液PCR鉴定（图6），目的条带大小正确且明亮，证明表达载体构建成功，命名为pCAMBIA3301-CePP2C19并按照农杆菌转化步骤（同实施例4）转入农杆菌中。
实施例6 油莎豆CePP2C19基因转化拟南芥及干旱胁迫下拟南芥表型分析及生理指标测定
将构建好的pCAMBIA3301-CePP2C19重组表达载体通过花序侵染法转化拟南芥，利用Basta筛选获得T3代纯合体，对T3代拟南芥进行干旱胁迫，观测表型变化，如图7所示，干旱胁迫后，拟南芥对照株系叶片（WT）与超表达拟南芥株系叶片（OE1、OE2）相比，对照株系萎蔫枯黄，含水量降低约至0.84%.。而对照株系与突变体拟南芥株系（pp2c19）相比，叶片变黄枯萎程度较小，表明超表达CePP2C19基因使拟南芥耐旱。丙二醛含量可以反映植株细胞膜受损伤程度，检测拟南芥叶片中丙二醛含量，如图8所示，干旱胁迫下OE1、OE2株系丙二醛含量低于WT，而pp2c19突变株系丙二醛含量为WT的1.3倍，表明干旱胁迫下OE1、OE2株系受到干旱胁迫损伤程度小。对反映植株受干旱胁迫程度的重要指标干重、鲜重、含水量进行检测，如图9所示，干旱胁迫下OE1、OE2株系的干重、鲜重、含水量均高于WT，其中干重高于WT约0.03g，鲜重高于WT约0.5g，含水量高于WT约0.02%，而pp2c19突变株系的干重、鲜重、含水量指标均低于WT，其中干重低于WT约0.03g，鲜重低于WT约0.4g，含水量低于WT约0.02%，结合上述结果表明CePP2C19基因能够增强植株的耐旱性。
Claims (5)
1.油莎豆CePP2C19基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.油莎豆CePP2C19基因的制备方法，它包括：以干旱胁迫12 h后的油莎豆叶片的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物：
CePP2C19F: ATGGCGGAGGTTTGTTGCG
CePP2C19R: TTACAATCTTCTAGCTC
进行PCR扩增获得。
3.一种重组植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。
4.根据权利要求3所述的一种重组植物表达载体，其特征在于：所述的植物表达载体为pCAMBIA3301。
5.权利要求1所述的油莎豆CePP2C19基因在提高植株耐旱性方面的应用；所述的植物为油莎豆或拟南芥。
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|---|---|---|---|---|
| CN117402910A (zh) * | 2023-12-14 | 2024-01-16 | 海南大学三亚南繁研究院 | Pp2c01基因在调控水稻耐盐性方面的应用 |
| CN118064452A (zh) * | 2024-04-17 | 2024-05-24 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种油莎豆CeWRI2基因、表达载体及其在植物油脂调控方面的应用 |
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| CN117402910B (zh) * | 2023-12-14 | 2024-02-23 | 海南大学三亚南繁研究院 | Pp2c01基因在调控水稻耐盐性方面的应用 |
| CN118064452A (zh) * | 2024-04-17 | 2024-05-24 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 一种油莎豆CeWRI2基因、表达载体及其在植物油脂调控方面的应用 |
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