CN116855410A - 一株粘质沙雷氏菌pdaw2和沙雷菌素及制备方法和应用 - Google Patents

一株粘质沙雷氏菌pdaw2和沙雷菌素及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株粘质沙雷氏菌PDAW2和沙雷菌素及制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一株粘质沙雷氏菌PDAW2，保藏编号为GDMCCNo:60023。所述粘质沙雷氏菌PDAW2能够产生新的沙雷菌素(结构式如式I所示)，所述沙雷菌素具有显著的抗菌效果，尤其是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐氨苄西林大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿甲单胞菌抑制效果显著，且所述沙雷菌素对实验动物毒性较低。所述沙雷菌素应用于感染伤口，能促进伤口愈合，抑制伤口感染细菌的生长。

Description

一株粘质沙雷氏菌PDAW2和沙雷菌素及制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株粘质沙雷氏菌PDAW2和沙雷菌素及制备方法和应用。
背景技术
微生物感染致死已是影响全球死亡的趋势。抗生素的出现则打破了这种趋势，并给予了人们战胜病原微生物的希望。虽然抗生素曾经能够治疗生物体内绝大多数的感染，但长期使用抗生素后生物体内不断产生耐药性会逐渐减弱抗生素的治疗效果，甚至出现“超级细菌”。在现代医学治疗中，已经发现了人体内许多部位(如泌尿道、呼吸道等)的病原体会产生出对抗生素的耐药性，抗生素滥用会导致耐药性问题日益严重，抗生素的耐药性不仅降低了病人的治疗效果，而且给病人带来更大的经济负担。
抗生素短缺正在影响各个国家的发展水平，特别是在卫生保健系统中。因此，设计出比传统抗生素更不易受进化抗性机制影响的抗菌药物是一个新的挑战。据此，全球科研人员在不断寻找新抗生素的来源来补充抗生素家族，应对细菌的耐药性，提高现有疾病治疗效果，甚至为新的疾病治疗寻找新药。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一株粘质沙雷氏菌PDAW2，所述粘质沙雷氏菌PDAW2能够产生沙雷菌素，所述沙雷菌素可以作为抗菌和/或抑菌的新药物。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)PDAW2，所述粘质沙雷氏菌PDAW2的保藏编号为GDMCC No:60023。
优选的，所述粘质沙雷氏菌PDAW2的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种沙雷菌素，所述沙雷菌素的结构如式I所示：
本发明提供了一种上述技术方案所述沙雷菌素的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述粘质沙雷氏菌PDAW2进行发酵培养，得到粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液；
收集粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液中的沉淀，乙醇浸提后取上清，得到粗提物浸提液；
将所述粗提物浸提液干燥后进行第一纯化，得到粗提物纯化液；
将所述粗提物纯化液进行第二纯化，得到沙雷菌素。
优选的，所述发酵培养的温度为26～34℃；所述发酵培养的时间为36～52h；所述发酵培养的转速为160～260rpm。
优选的，所述浸提的时间为30～120min。
优选的，所述第一纯化的方法包括：硅胶吸附色谱法纯化；所述纯化用洗脱液包括乙醇。
优选的，所述第二纯化的方法包括：高效液相色谱法。
本发明提供了上述技术方案所述沙雷菌素或上述技术方案所述制备方法制备得到的沙雷菌素在制备抗菌和/或抑菌药物中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述沙雷菌素或上述技术方案所述制备方法制备得到的沙雷菌素在制备促进伤口愈合药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)PDAW2，所述粘质沙雷氏菌PDAW2的保藏编号为GDMCC No:60023。本发明提供的粘质沙雷氏菌PDAW2能够产生新的沙雷菌素(结构式如式I所示)，所述沙雷菌素具有显著的抗菌效果，尤其是对临床上的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐氨苄西林大肠杆菌(Amp rE.coli)抑制效果显著，且所述沙雷菌素对实验动物毒性较低。实施例结果表明：从粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液中的提取到的活性成分沙雷菌素可以显著抑制金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐氨苄西林大肠杆菌、铜绿甲单胞菌和枯草芽孢杆菌的生长；将所述沙雷菌素应用于感染伤口，能显著促进伤口愈合，抑制伤口感染细菌的生长。
生物保藏说明
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)PDAW2，于2016年3月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，单位简称为GDMCC，地址为广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No:60023。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为粘质沙雷氏菌PDAW2的16S rDNA序列构建系统发育树；
图2为菌株PDAW2的菌落图；
图3为菌株PDAW2革兰氏染色结果如图；
图4为菌株PDAW216S rDNA电泳图；
图5为沙雷菌素液相分析结果图；
图6为沙雷菌素质谱分析结果图；
图7为沙雷菌素的结构图；
图8为沙雷菌素对不同菌株的抑菌圈结果图；
图9为沙雷菌素对P.aeruginosa菌液在0～8h的抑菌效果检测结果图；
图10为沙雷菌素最低抑制浓度(MIC)实验各试验组检测结果柱状图；
图11为荧光显微镜下，P.aeruginosa的活/死染色荧光图；
图12为采用荧光探针(DCFH-DA)检测P.aeruginosa细菌体内活性氧的水平检测结果图；
图13为每两天对感染创面沙雷菌素处理组和对照组的拍照结果图；
图14为沙雷菌素处理组和对照组处理伤口，第0、2、4、6、8、10天不同处理的小鼠伤口闭合率统计图；
图15为沙雷菌素处理组和对照组处理伤口，第0、2、4、6、8、10天不同处理的小鼠体重变化情况统计图；
图16为沙雷菌素处理组和对照组小鼠伤口H&E染色结果图；
图17为沙雷菌素处理组和对照组小鼠伤口三色染色结果图；
图18为沙雷菌素处理组和对照组愈合伤口菌落采集涂布结果图；
图19为沙雷菌素处理组和对照组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织切片H&E染色结果图；
图20为沙雷菌素处理组和对照组小鼠血常规检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)PDAW2，所述粘质沙雷氏菌PDAW2的保藏编号为GDMCC No:60023。
在本发明中，所述粘质沙雷氏菌PDAW2分离自怀化学院校园土壤或空气中。本发明所述粘质沙雷氏菌PDAW2于2016年3月21日保藏在广东省微生物菌种保藏中心。
在本发明中，所述粘质沙雷氏菌PDAW2在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落光滑有粘性不透明、中心颗粒状、有恶臭的菌落，并能产生红色色素物质。在本发明中，所述粘质沙雷氏菌PDAW2菌体球形或短杆状，大小约为0.5×(0.5～1.0)μm。本发明对所述粘质沙雷氏菌PDAW2进行生理生化反应，结果图表1所示，生理生化反应结果与粘质沙雷氏菌的反应结果相似度达99％。在本发明中，所述粘质沙雷氏菌PDAW2为革兰氏阴性菌，能产生一种新的沙雷菌素，所述沙雷菌素的结构式如式I所示。
本发明所述粘质沙雷氏菌PDAW2的16S rDNA序列共1423bp，如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列如下：
CTTACCATGCAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGT
GACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGG
GGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCA
AAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTA
GCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTG
AGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG
GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA
TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGG
AGGAAGGTGGTGAACTTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGA
AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAG
CGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTC
AGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAA
GCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC
GTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAG
ACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT
GGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCG
TGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGC
AAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCA
GAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTG
CTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA
ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAA
AGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCA
TCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAA
GAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTC
CGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG
TAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC
GTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGG
GAGGGCGCTACCACTTTG。
将粘质沙雷氏菌PDAW2的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，与Serratia marcescens strain HL1(EU371058.1)相似度达到100。将粘质沙雷氏菌PDAW2的16S rDNA序列构建系统发育树如图1所示。经形态学、生理生化反应和分子生物学以及其活性物质鉴定，确认本发明所述菌株PDAW2属于Serratia marcescens。
本发明提供了一种沙雷菌素，所述沙雷菌素的结构如式I所示。在本发明中，所述沙雷菌素的分子式为C13H23NO3；所述沙雷菌素的精确质量为257.1627；所述沙雷菌素的分子量为257.3300。
本发明提供的沙雷菌素具有显著的抗菌效果，尤其是金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、大肠杆菌、耐氨苄西林大肠杆菌(Amp r E.coli)、枯草芽孢杆菌和铜绿甲单胞菌抑制效果显著，且所述沙雷菌素对实验动物毒性较低。将所述沙雷菌素应用于创伤伤口，可促进伤口愈合，显著降低伤口有害菌的数量。
本发明提供了一种上述技术方案所述沙雷菌素的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述粘质沙雷氏菌PDAW2进行发酵培养，得到粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液；
收集粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液中的沉淀，乙醇浸提后取上清，得到粗提物浸提液；
将所述粗提物浸提液干燥后进行第一纯化，得到粗提物纯化液；
将所述粗提物纯化液进行第二纯化，得到沙雷菌素。
本发明将上述技术方案所述粘质沙雷氏菌PDAW2进行发酵培养，得到粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液。
本发明将上述技术方案所述粘质沙雷氏菌PDAW2进行发酵培养之前，优选获得粘质沙雷氏菌PDAW2种子液。在本发明中，所述粘质沙雷氏菌PDAW2种子液的制备方法优选包括：将粘质沙雷氏菌PDAW2接种于种子培养基中进行种子培养，得到粘质沙雷氏菌PDAW2种子液。在本发明中，所述种子培养基按质量百分含量计，优选包括：葡萄糖5％、牛肉膏0.3％、蛋白胨1％和余量的水；所述种子培养基的pH值优选为7.0。在本发明中，所述种子培养基进行配制时优选在水中进行溶解。得到种子培养基后，本发明将粘质沙雷氏菌PDAW2接种于种子培养基中。本发明对粘质沙雷氏菌PDAW2的接种量没有特殊限定，采用本领域常规接种量即可。在本发明中，所述种子培养的温度优选为26～37℃，更优选为37℃；所述种子培养的时间优选为14～24h，更优选为18h；所述种子培养过程优选在摇床中进行，所述摇床的转速优选为160～220rpm，更优选为180rpm。种子培养完成后，本发明得到粘质沙雷氏菌PDAW2种子液。
得到粘质沙雷氏菌PDAW2种子液后，本发明优选将粘质沙雷氏菌PDAW2种子液进行发酵培养，得到粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液。本发明所述发酵培养优选在发酵培养基中进行。在本发明中，所述发酵培养基优选包括：葡萄糖5g/L、甘油10g/L和蛋白胨10g/L；所述发酵培养基的pH优选为7.0。在本发明中，所述发酵培养基的制备方法优选包括将发酵培养基组分用水进行溶解。本发明所述发酵培养的温度优选为26～34℃，进一步优选为26～32℃，更优选为30℃；所述发酵培养的时间优选为36～52h，更优选为48h。本发明所述发酵培养优选在摇床中进行，所述发酵培养的转速优选为160～260rpm，更优选为180rpm。本发明发酵培养完成后，得到发酵培养液。
得到发酵培养液后，本发明收集发酵菌液中的沉淀，乙醇浸提后取上清，得到粗提物浸提液。
本发明优选通过离心收集发酵培养液中的沉淀。本发明优选将发酵培养液分装至15mL离心管中进行离心；所述离心的转速优选为4000～10000rpm，更优选为8000rpm；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。得到发酵培养液中的沉淀后，本发明优选将沉淀清洗后进行乙醇浸提。本发明所述清洗优选采用蒸馏水进行。本发明对清洗的方法没有特殊限定，采用本领域常规沉淀清洗方法均可。清洗完成后，本发明优选将清洗后的沉淀与乙醇混合进行浸提。本发明将沉淀与乙醇混合后，优选将沉淀搅拌打散，以使沉淀与乙醇充分接触。在本发明中，所述乙醇优选为无水乙醇。本发明所述浸提的时间优选为30～120min，更优选为90min。浸提完成后，本发明优选通过离心取上清，得到粗提物浸提液。本发明所述离心的转速优选为6000～10000rpm，更优选为8000rpm；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。
得到粗提物浸提液后，本发明将所述粗提物浸提液干燥后进行第一纯化，得到粗提物纯化液。
将粗提物浸提液进行干燥前，本发明优选将粗提物浸提液进行浓缩。本发明对所述浓缩的方法没有特殊限定，采用本领域常规提取液浓缩方法均可。得到浓缩产物后，本发明将浓缩产物进行干燥。本发明所述干燥的方法优选包括冷冻干燥。本发明对冷冻干燥的方法没有特殊限定，采用本领域常规冷冻干燥方法均可。本发明将干燥完成后，得到浸提液干样品。
得到浸提液干样品后，本发明优选将浸提液干样品溶解后进行第一纯化，得到粗提物纯化液。本发明优选使用无水乙醇对粗提物干样品进行溶解，得到粗提物-乙醇溶液。在本发明中，所述粗提物-乙醇溶液中粗提物的质量浓度优选为100～200mg/mL，更优选为150mg/mL。本发明所述第一纯化优选采用硅胶吸附色谱法进行；所述吸附色谱用吸附剂优选为大孔树脂101。本发明进行硅胶吸附色谱法纯化时，所述洗脱的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。洗脱完成后，本发明优选先用蒸馏水进行冲洗后，再用无水乙醇进行洗脱，收集粗提物洗脱液，即得粗提物纯化液。
得到粗提物纯化液后，本发明优选将粗提物纯化液浓缩后进行第二纯化。本发明对所述浓缩的方法没有特殊限定，采用本领域常规浓缩方法均可。得到浓缩产物后，本发明优选对浓缩产物进行第二纯化。本发明所述第二纯化的方法优选包括高效液相色谱法分离纯化，更优选为通过高效液相色谱梯度洗脱方法分离纯化。本发明所述高效液相色谱法优选采用岛津液相色谱仪进行。本发明进行梯度洗脱的流动相A优选为甲酸水溶液；所述甲酸水溶液中甲酸和水的体积比为1:1000。在本发明中，所述水优选为一级超纯水或怡宝纯净水。本发明进行梯度洗脱的流动相B优选为乙腈。本发明对高效液相色谱的方法没有特殊限定，采用本领域常规高效液相色谱梯度洗脱方法均可。本发明所述梯度洗脱程序优选如表2所示。
在本发明中，梯度洗脱程序具体可以描述为：0～0.01min，流动相B的体积分数为25％；0.01～15min，流动相B的体积分数为25％；15～16min，流动相B的体积分数由25％增加至40％；16～30min，流动相B的体积分数由40％增加至90％；30～35min，流动相B的体积分数90％；35～36min，流动相B的体积分数由90％增加至100％；36～37min，流动相B的体积分数由100％降低至25％。本发明通过以上条件分离得到的第5号样品即为新沙雷菌素。
本发明通过对高效液相色谱法分离得到具有抗菌和/或抑菌作用的物质，经液相分析、质谱分析、碳谱分析和氢谱分析，确定此物质为如式I所示的沙雷菌素。
本发明提供了一种上述技术方案所述粘质沙雷氏菌PDAW2、上述技术方案所述沙雷菌素或上述技术方案所述制备方法制备得到的沙雷菌素在制备抗菌抑菌药物中的应用。
本发明还提供了一种上述技术方案所述粘质沙雷氏菌PDAW2、上述技术方案所述沙雷菌素或上述技术方案所述制备方法制备得到的沙雷菌素在制备促进伤口愈合药物中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下技术方案中所涉及的培养菌的培养基均进行高温高压灭菌。
以下实施例中每个实验至少进行3次平行试验。每个数据表示为平均值，±标准偏差，并使用单向方差分析(ANOVA)进行分析，然后进行Tukey后测。不同组之间在*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001的差异被认为具有统计学意义。
实施例1
1.菌株来源
本发明粘质沙雷氏菌PDAW2分离自怀化学院校园土壤或空气中。
2.菌株鉴定
1)菌落形态观察
将菌株PDAW2在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，观察菌株的菌落结构。
菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上培养的菌落结构图如图2所示。在平板上菌落光滑有粘性不透明、中心颗粒状、有恶臭的菌落，并能产生红色色素物质。
2)革兰氏染色
采取常规使用的革兰氏染色方法，将菌株PDAW2固定在载玻片上，待其风干，用草酸铵结晶紫染色1min，之后用去离子水轻轻冲洗，然后加碘液覆盖涂面浸染1min，再用去离子水将碘液轻轻冲洗干净并用吸水纸将水分吸走，然后滴加95％乙醇轻轻摇晃20s对其进行脱色，脱色完成后用去离子水轻轻冲洗并用吸水纸吸干水分，最后用泛红染色液染色1min，然后用去离子水冲洗，待其干燥后进行镜检。革兰氏染色结果如图3所示。图3中所述结果图为放大(10×100倍图)。
由图3可得，所述菌株PDAW2为革兰氏阴性菌，菌体为球形或短杆状，大小约为0.5×(0.5～1.0)μm。
3)生理生化反应
细菌系统生化鉴定按照VITEK II鉴定系统说明书中的标准操作流程和GN鉴定卡说明书操作，取一环PDAW2菌株的纯培养物接种到普通营养琼脂平板上，置(36±1)℃培养箱培养(24±2)h，得到单个纯菌株。取专用无菌小试管，加入3mL经灭菌的NaCl质量百分含量为0.45％盐水，用无菌不吸水棉签挑取单个菌落，在盛有3mL无菌盐水的小试管中轻轻搅匀，菌悬液的稀释度应在0.5～0.6麦氏度之间(最后要在浊度仪上测试确定)，将小试管与GN鉴定卡连接后上机分析，4～5h后仪器工作系统自动打印出实验报告，结果如表1所述。
表1菌株的生理生化反应结果
表1中所述的结果为菌株的生理生化反应结果与粘质沙雷氏菌的反应结果相似度达99％。
4)分子鉴定
提取菌株PDAW2的DNA，进行PCR，进行电泳检测，电泳检测结果如图4所示，同时将PCR产物进行测序，获得菌株PDAW2的16S rDNA序列结果如SQE ID NO.1所示。根据所获得的16S rDNA序列结果，在GenBank数据库中进行比对，Blast搜索同源序列。得出菌株PDAW2的16S rDNA序列与Serratia marcescens strain HL1(EU371058.1)相似度达到100。对菌株16S rDNA序列，使用MEGA-X软件，构建系统发育树，如图1所示。
5)菌株PDAW2活性物质的提取与检测
(1)菌株PDAW2种子液培养方法
种子培养基组成为以水为溶剂葡萄糖的质量百分含量为0.5％，牛肉膏的质量百分含量为0.3％，蛋白胨的质量百分含量为1％，种子培养基的pH为7.0。
将菌株PDAW2接种于种子培养基中于恒温摇床37℃，180rpm进行种子培养，培养时间为18h，获得菌株PDAW2种子培养液。
(2)菌株PDAW2发酵培养液培养方法
发酵培养基组成为以水为溶剂，葡萄糖5g/L，甘油10g/L，蛋白胨10g/L，发酵培养液的pH为7.0。
将菌株PDAW2种子培养液接种于发酵培养基中于恒温摇床32℃，180rpm进行发酵培养，培养时间为48h，获得菌株PDAW2发酵培养液。
(3)菌株PDAW2活性物质提取
取35mL菌株PDAW2发酵培养液分装到50mL离心管中，于8000rpm离心10min，收集沉淀物；将收集的沉淀用蒸馏水清洗3次，弃蒸馏水后加入5mL无水乙醇，搅拌打散后浸提90min。浸提完成后，取浸提液于8000rpm离心10min，去沉淀，收集上清液。
将以上步骤重复数次，收集足够多的浸提液，将浸提液浓缩、冷冻干燥进行定量，获得浸提液干样品。将浸提液干样品用无水乙醇溶解，配制成150mg/mL粗提物-乙醇溶液。
将150mg/mL粗提物-乙醇溶液均匀倒入装有大孔树脂101的色谱柱中，让大孔树脂吸附粗提物1h，1h后用蒸馏水冲洗，最后用无水乙醇洗脱，收集。
将收集到的粗提物洗脱液进行浓缩，然后在岛津分析液相中进行梯度洗脱分析，并进行分离纯化物质的收集。高效液相洗脱条件为：采用250×10.0mm大柱子，进样量为0.2mL，总流速3.5mL/min，分析波长为250nm；流动相A：甲酸：水(一级超纯水或怡宝)＝1:1000；流动相B：乙腈。
进行梯度洗脱时流动相的洗脱比例优选如表2所示。
表2高效液相色谱流动相洗脱比例
时间/min 单元 控制器 乙腈比例/％
0.01 泵 B.Conc 25
15 泵 B.Conc 25
16 泵 B.Conc 40
30 泵 B.Conc 90
35 泵 B.Conc 90
36 泵 B.Conc 100
37 泵 B.Conc 25
38 控制器 stop
本发明通过以上条件分离得到的第5号样品即Compound-5(后面称之为5号活性物质或者5号样品)。将该化合物进行了抗菌实验，5号活性物质具有显著的抗菌效果，后续将活性物质5号进行物质结构鉴定。
(4)活性物质5号(Compound-5)样品的鉴定
将高效液相色谱仪分离纯化得到的高浓度5号样品进行液相分析、质谱分析、碳谱分析和氢谱分析。5号样品的液相分析结果如图5所示。5号样品的质谱分析结果如图6所示。5号样品的核磁共振检查结果如表3所示。
表35号样品的核磁共振检查结果
由表3和图5、图6检查结果得出5号物质的结构如图7所示，5号物质的分子式为C13H23NO3；5号物质的精确质量为257.1627；5号物质的分子量为257.3300。进一步分析得出5号物质为一种新的沙雷菌素((3S,7S)-7-己基-3-(羟甲基)-1,4-恶嗪烷-2,5-二酮(SS))，与前人研究报道的沙雷菌素(C12H21O4N)的相差一个甲基。沙雷菌素(Serratin)分子组成为C12H21NO4，分子量为243。
(5)沙雷菌素的抗菌实验
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)、耐氨苄西林大肠杆菌(Amp rE.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)从湖南省疾病预防控制中心获得。所有细菌在37℃新鲜液体LB培养基中单独培养过夜。
(i)抑菌圈实验
沙雷菌素对S.aureus，MRSA，E.coli和Amp rE.coli的抗菌活性使用滤纸扩散技术进行评估。具体而言，将100μL对数期的金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠杆菌和Amp r大肠杆菌悬浮液(108CFU mL-1)铺展到琼脂平板上。然后，将包含25μL浓度为1mg/mL沙雷菌素的滤纸转移到S.aureus、MRSA、E.coli和Amp rE.coli、B.subtilis和P.aeruginosa涂层琼脂平板。此外，在每一个培养皿上还设置了浸泡有DMSO的无菌滤纸片组为对照，用以设计为比较沙雷菌素的杀菌活性。最后将琼脂平板置于37℃培养箱中。培养24h后，测量抑菌圈的直径和面积。每组实验进行三组平行实验，最后取平均值得到结果。
沙雷菌素对S.aureus、MRSA、E.coli和Amp r E.coli、B.subtilis和P.aeruginosa涂层琼脂平板实验抑菌圈结果如图8中的A所示，其中5代表沙雷菌素，D代表对照组DMSO处理组，抑菌圈大小统计结果如表4，抑菌圈大小统计结果柱状图如图8中的B所示。
表4沙雷菌素对不同菌株的抑菌圈大小统计结果(均值)
菌株 对照组抑菌圈直径/mm 沙雷菌素组抑菌圈直径/mm
AmprE.coli 0 10.16**
E.coli 0 11.46**
MRSA 0 12.72**
S.aureus 0 15.25**
B.subtilis 0 19.13**
P.aeruginosa 0 23.01**
由图8和表4可得，1mg/mL，加量为25μL的条件下，沙雷菌素对于P.aeruginosa的抑制作用显著，抑菌圈平均直径可达到23.01mm。沙雷菌素对S.aureus、MRSA、E.coli和AmprE.coli、B.subtilis和P.aeruginosa抑制效果均较显著，具有抗菌谱广，能抑制革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，而且对耐药性的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果也较显著，将有较好的应用前景。
(ii)时间动态试验
用时间动力学实验来研究沙雷菌素与细菌相互作用时间的变化，得出沙雷菌素的杀菌效果。
将P.aeruginosa菌液稀释至在紫外分光光度计以OD600nm条件下检测值为0.1，同时保证每个实验组的菌液初始浓度是一致的。在试管中分别加入5mL稀释好的P.aeruginosa菌液，各实验组分别加入150μL 2mg/mL沙雷菌素，对照组加入相同体积的PBS，充分混匀后，在37℃，200rpm恒温培养箱中培养12h，中间每隔一个小时取一次样，然后在酶标仪上测量OD600值。每组实验进行三组平行实验。其中，沙雷菌素对P.aeruginosa菌液在0～8h的抑菌效果检测结果如表5和图9所示。
表5沙雷菌素对P.aeruginosa菌液在0～8h的抑菌效果检测结果(均值)
时间/h 对照组生物量/OD600 沙雷菌素组生物量/OD600
0 0.1 0.1
1 0.697 0.049**
2 1.910 0.040**
3 2.179 0.037**
4 2.591 0.043**
5 2.727 0.032**
6 2.719 0.016**
7 2.902 0.040**
8 2.877 0.056**
由表5和图9可得，通过时间动力学实验结果确定其抑菌浓度为58μg/mL时，能彻底抑制P.aeruginosa的生长。
(iii)沙雷菌素最低抑制浓度(MIC)实验
参考前人报道，利用MIC微版检测法检测沙雷菌素最低抑菌浓度(Kowalska-Krochmal,B.；Dudek-Wicher,R.The Minimum Inhibitory ConcentrationofAntibiotics:Methods,Interpretation,Clinical Relevance.Pathogens,2021,10,165.https://doi.org/10.3390/pathogens10020165)。
采用96孔板进行测试实验，每孔200μL体系。首先在96孔板中接种100μL处于对数生长期的铜绿假单胞菌，菌液浓度控制在105CFU/mL。然后加入设置好的浓度梯度式的沙雷菌素溶液。处理后，沙雷菌素的浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15.6μg/mL和7.8μg/mL，每孔加量为100μL。且以PBS处理作为空白对照。每个处理设置三组平行试验。充分摇匀后，将96孔板放到37℃的恒温箱中培养24h。24h后，用肉眼可以观察到96孔板中菌液澄清无浑浊为沙雷菌素的MIC值，同时，在酶标仪上测量各试验组的OD600值。
沙雷菌素最低抑制浓度(MIC)实验各试验组检测结果如表6；沙雷菌素最低抑制浓度(MIC)实验各试验组检测结果柱状图10所示。
表6沙雷菌素最低抑制浓度(MIC)实验各试验组检测结果(均值)
沙雷菌素浓度 生物量/OD600nm
对照组(0μg/ml) 0.390
25μg/ml 0.220**
32.5μg/ml 0.111**
37.5μg/ml 0.119**
42.5μg/ml 0.101**
47.5μg/ml 0.116**
52.5μg/ml 0.109**
57.5μg/ml 0.114**
62.5μg/ml 0.094**
由表6和图10可得，P.aeruginosa的最低抑菌浓度为32.5μg/mL。
(iv)沙雷菌素的对P.aeruginosa的活/死染色试验
使用双荧光染料法对细菌活力进行成像(Khan,S.A.；Shahid,S.；Hanif,S.；Almoallim,H.S.；Alharbi,S.A.；Sellami,H.Green Synthesis of Chromium OxideNanoparticles for Antibacterial,Antioxidant Anticancer,and BiocompatibilityActivities.Int.J.Mol.Sci.2021,22,502.https://doi.org/10.3390/ijms22020502)研究细菌膜的损伤。
首先将P.aeruginosa菌液稀释到OD600nm≈0.1，同时保证每一实验组的初始OD值相同。分别于6支1.5mL的离心管之中加入900μL的P.aeruginosa菌液，然后再分别在其中的3支离心管之中加入100μL浓度为200μg/mL的沙雷菌素，于剩下的3支离心管中分别加入100μLH2O，作为对照组。
最后将这6支离心管置放于200rpm，37℃的恒温箱之中处理12h。取出处理好的样品，将其进行8000r/min离心5min，弃除上清液，收集沉淀物。然后在离心后得到沉淀物的离心管之中分别加入400μLPBS(pH＝7.4)。再加入活死细胞染色工作液，即终浓度为2μM的Calcein-AM和终浓度为4.5μM的PI，混匀之后再将其放到37℃的恒温箱之中温育20min。
在此之间，样品需要每隔5min颠倒使得染料充分结合到细菌之中。最后，在激光扫描共聚焦显微镜(FV1200，Olympus)下对不同处理的P.aeruginosa菌液进行共聚焦成像，并统计活/死比例。荧光显微镜下，P.aeruginosa的活/死染色荧光图如图11所示。
Calcein-AM和PI染色技术对细胞进行荧光染色，这两种物质，前者能够对活细胞进行绿色荧光标记，后者能够对死细胞进行红色标记。也就是说，对用沙雷菌素处理过的菌液染色后，在荧光显微镜下，显示绿色的为活细胞，红色的为死细胞。由图11可得，对照组中也出现了少量红色荧光，表明有少量的细胞凋亡，而实验组是几乎没有绿色荧光，红色荧光强度远远高于绿色荧光强度，致死率几乎是100％。
(v)沙雷菌素对P.aeruginosa的ROS水平的影响
活性氧参与了细胞死亡病理和生理过程，其中细胞的凋亡就与它相关。本次为了进一步验证沙雷菌素对于P.aeruginosa的杀伤作用和机理，采用荧光探针(DCFH-DA)来检测细菌体内活性氧的水平。
这个检测原理就是，当细胞内的活性氧水平升高，可氧化无荧光的DCFG就会生成有绿色荧光的产物DCF，细胞内的活性氧水平越高，绿色荧光强度就越强。
采用荧光探针(DCFH-DA)检测P.aeruginosa细菌体内活性氧的水平检测结果如图12所示。
由图12可得，对照组几乎没有绿色荧光，而实验组产生了强烈的绿色荧光，表明沙雷菌素会诱导细菌产生氧化应激反应，产生氧化应激性损伤，致使细菌死亡。
实施例2
1.沙雷菌素对P.aeruginosa感染伤口的体内治疗
所有动物程序均按照美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行。六周龄雌性Balb/c小鼠购自湖南SJA实验动物有限公司(中国长沙)。
P.aeruginosa被选定为小鼠感染细菌菌株。对八组(n＝3)小鼠进行麻醉，并在小鼠背部制备直径约13mm的圆形伤口。随后，将100μLP.aeruginosa菌悬液(108CFU/mL)被添加到圆形伤口上以感染所有小鼠。连续感染2天后，每2天向感染部位加入100μL沙雷菌素(1mg/mL)作为试验组，每2天向感染部位加入100μL PBS作为对照组，直到第10天。同时每两天对感染创面进行拍照，结果如图13所示，并用游标卡尺测量感染创面的大小并且记录每只小鼠的体重，统计结果如表7所示，第0、2、4、6、8、10天不同处理的小鼠伤口闭合率统计图如图14所示。第0、2、4、6、8、10天不同处理的小鼠体重变化情况统计如表8和图15所示。
表7试验组和对照组小鼠第0、2、4、6、8、10天伤口相对大小数据表(均值)
时间/天 对照组伤口相对大小/％ 沙雷菌素组伤口相对大小/％
0 100 100
2 93.72 83.83*
4 70.77 66.94*
6 62.84 60.31*
8 28.51 24.06*
10 17.45 11.19*
表8试验组和对照组小鼠第0、2、4、6、8、10天体重变化情况表(均值)
时间/天 对照组，小鼠相对体重/％ 沙雷菌素组，小鼠相对体重/％
0 100 100
2 100.67 106.95*
4 105.16 105.49
6 108.66 103.21
8 104.30 103.99
10 105.09 104.79
由表7、表8和图12～14结果得出，与对照组相比，试验组的愈合效果更快更好。在实验过程中，定期称量了小鼠的体重，发现各组之间小鼠的体重变化差异不大，这说明了沙雷菌素的生物安全性较好。
2.为了进一步探究伤口愈合情况，在试验第10天分别对试验组和对照组小鼠伤口组织进行了H&E染色和三色染色观察伤口再上皮化和肉芽组织形成的情况。
试验组和对照组小鼠伤口H&E染色结果如图16所示；试验组和对照组小鼠伤口三色染色结果如图17所示。
由图16和17结果得出，在PBS对照组处理中，可以观察到小鼠的表皮和真皮结构保持完整，但是有中性粒细胞和淋巴细胞，表明发生了炎症反应。而通过沙雷菌素处理10d的伤口，在愈合的皮肤中出现了完整的表皮层，以及较少量的炎性细胞。同时可以看到实验组中的皮肤中出现了较好的成纤维细胞和上皮细胞，以及肉芽组织和毛囊发育都相对于对照组更好。表明沙雷菌素对于小鼠的伤口有促进愈合效果。
3.动物愈合伤口菌落采集涂布实验
将试验第10d后的小鼠即将愈合的伤口采用上述试验1中的上药方式上药，上完药的时候拿杀菌棉签沾一下伤口，采集菌落，然后分开保存到事先准备好的装有5mL/管的液体培养基离心管中。在超净工作台中进行无菌操作，分别取不同的小鼠伤口采集回来的菌液，取100μL涂布在固体培养基上。培养条件为37℃，待菌落长好之后进行计数。计数结果如图18所示。
由图18可得，探讨沙雷菌素在小鼠伤口上对于P.aeruginosa的杀伤效果，从小鼠伤口上采集了菌落，进行涂布培养数菌落个数。实验组比对照组**P<0.01，可见，沙雷菌素在小鼠伤口上对于P.aeruginosa的杀伤效果是非常显著的。
4.沙雷菌素生物安全性评估
将试验1中处理10d后的小鼠，对小鼠进行眼球取血，收集小鼠处理过的伤口皮肤组织，然后用10mL的1×PBS从心脏注射，洗涤组织至干净，收集小鼠心、肝、脾、肺、肾。用4％的多聚甲醛溶液对上述皮肤和心、肝、脾、肺、肾进行24h固定。最后进行石蜡切片和H&E染色，于显微镜下观察结果。
(1)试验组和对照组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织切片H&E染色结果如图19所示。
由图19可得，沙雷菌素处理了10d的小鼠处理后，取其主要器官心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色，观察其病理变化。由对照组和实验组的结果，通过对比发现，实验组的主要器官染色图显示并没有发生明显的炎症病变或损伤，说明沙雷菌素对于小鼠的毒性较低，生物安全性较好。
(2)试验组和对照组小鼠血常规检测结果
为了进一步反映沙雷菌素的安全性，对不同处理的小鼠进行了血常规检测。
试验组和对照组小鼠血常规检测结果如图20所示。图20中的A为血红蛋白(HGB)检测结果；B为平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)检测结果；C为平均红细胞血红蛋白(MCH)检测结果；D为平均细胞体积(MCV)检测结果；E为红血细胞(RBC)检测结果；F为白细胞(WBC)检测结果；G为血小板(PLT)检测结果。
由图20可得，实验组跟对照组血常规检测结果并无明显差异，均无显著性差异，均在正常范围之内，据此可知，沙雷菌素的毒性较低，用它来治疗细菌感染疾病，对受治生物来说是较为安全的。
综上，本发明提供的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)PDAW2可以产生一种新的沙雷菌素，所述沙雷菌素有抗菌的效果，尤其在抑制铜绿假单胞菌方面，效果显著，并且安全性较高。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)PDAW2，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌PDAW2的保藏编号为GDMCC No:60023。
2.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌PDAW2，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌PDAW2的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种沙雷菌素，其特征在于，所述沙雷菌素的结构如式I所示：
4.权利要求3所述沙雷菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1或2所述粘质沙雷氏菌PDAW2进行发酵培养，得到粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液；
收集粘质沙雷氏菌PDAW2发酵菌液中的沉淀，乙醇浸提后取上清，得到粗提物浸提液；
将所述粗提物浸提液干燥后进行第一纯化，得到粗提物纯化液；
将所述粗提物纯化液进行第二纯化，得到沙雷菌素。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为26～34℃；所述发酵培养的时间为36～52h；所述发酵培养的转速为160～260rpm。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述浸提的时间为30～120min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一纯化的方法包括：硅胶吸附色谱法纯化；所述纯化用洗脱液包括乙醇。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二纯化的方法包括：高效液相色谱法。
9.权利要求3所述沙雷菌素或权利要求4～8任意一项所述制备方法制备得到的沙雷菌素在制备抗菌和/或抑菌药物中的应用。
10.权利要求3所述沙雷菌素或权利要求4～8任意一项所述制备方法制备得到的沙雷菌素在制备促进伤口愈合药物中的应用。
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