CN116854780A - 一种lr12肽的液相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种LR12肽的液相合成方法，是利用标签分子作为载体辅助LR12肽链酰胺偶联，偶联结束后的原溶液直接在含巯基化合物Fmoc捕获试剂辅助下脱除Fmoc保护，形成Fmoc‑巯基羧酸加合物萃取洗涤除去，达到净化原溶液中杂质的目的，从而在原溶液中直接进行肽链的后续偶联，实现肽链的可持续延伸。本发明方法能够极大地降低化学试剂的使用并提高合成效率，通过在原始溶液体系中实现肽链的延伸，避免溶剂的大量浪费。
Description
技术领域
本发明属于有机合成及多肽化学合成领域，涉及一种LR12肽的合成方法，特别是一种标签辅助液相肽链延伸的LR12肽合成方法。本发明以小分子标签代替固相多肽合成树脂，通过液相可持续的肽链延伸，简便高效实现LR12肽的绿色合成，最大化减少反应溶剂的使用，降低化学试剂过量排放对环境造成的污染。
背景技术
LR12肽，也称南吉博肽（Nangibotide），是一种从鼠类血液中发现的碳末端酰胺化十二肽，其氨基酸结构序列为H-LQEEDTGEYGCV-NH2，具体的化学分子结构及多肽序列如下图所示。
LR12肽作为一种髓样细胞表达的驱动受体-1（TREM-1）抑制剂，可以通过充当诱饵受体来干扰TREM-1受体与其配体的结合，并以剂量依赖性方式抑制由TREM-1诱导的白细胞活化。LR12肽可在无菌/感染性急性炎症综合征中阻断TREM-1介导的免疫失调，恢复平衡的炎症反应并改善预后。此前，LR12肽已在感染性休克模型中显示出调节免疫平衡，改善血管功能和提高感染性休克动物存活率的潜力，并在治疗COVID-19重症患者的Ⅱ期临床上表现出积极数据。2019年9月，Nangibotide获FDA授予的快速通道指定，以治疗感染性休克。
目前，LR12肽的化学合成主要通过固相多肽合成（SPPS）技术。SPPS是以难溶性高分子树脂作为载体进行LR12肽的氨基酸非均相偶联及脱保护，并通过化学溶剂的反复洗涤实现中间肽的纯化，如CN 114945580A公开的一种基于固相MBHA树脂载体片段法制备南吉博肽的方法。
LR12肽的固相树脂制备不仅路线繁琐，且具有较低的装载率，在进行LR12肽的氨基酸偶联后，需要使用大量化学试剂对树脂进行反复洗涤，以去除过量的原料及副产物。另外，LR12肽的固相合成还需要远过量（3～5倍当量）的原料，才能保证最大化的非均相偶联，造成LR12肽的制备成本增高，并限制了南吉博肽的批量化生产制备。
随着LR12肽原料需求的扩大，传统SPPS面临着化学试剂严重浪费、难降解高分子污染物排放造成经济与环境方面的挑战，LR12肽也缺乏经济绿色的制备方案。因此，开发试剂节约型的LR12肽制备方法，将在很大程度上改善LR12肽所面临的挑战。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种LR12肽的液相合成方法，通过在原始溶液体系中实现肽链的延伸，以避免溶剂的大量浪费。
本发明提供的LR12肽的液相合成方法相比于LR12肽的SPPS合成，利用易溶性标签分子为载体，协助LR12肽的Fmoc策略氨基酸偶联，偶联结束后在Fmoc捕获试剂辅助下直接在原溶液中脱除Fmoc保护，萃取洗涤后直接进行后续偶联，实现持续的LR12肽链延伸，从而能够极大地降低反应溶剂使用并提高合成效率，解决当前LR12肽SPPS制备过程所面临的化学溶剂浪费等方面的不足。
本发明所述的LR12肽的液相合成方法具体是以下述结构通式（I）所示的NH2-Rink-TAG作为标签分子：
其中，取代基R是碳数大于10且小于40的直链或支链烷基或环烷基，或者是4-二苯基膦酰氧基二苯甲基或4,4’-二苯基膦酰氧基二苯甲基；
以含巯基化合物R'-SH作为Fmoc捕获试剂，
其中，取代基R'选自含有一个或多个-COOH侧链基团的烷基链；
按照下述步骤制备LR12肽：
1）、在反应溶剂中以脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂处理下述结构通式（II）所示Fmoc保护的Fmoc-NH-Rink-TAG，直接以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取，得到结构通式（I）所示的脱除Fmoc保护基团的NH2-Rink-TAG标签分子溶液；
2）、在偶联试剂作用下，将Fmoc保护的缬氨酸Fmoc-Val12-OH直接加入到上述NH2-Rink-TAG标签分子溶液中进行酰胺偶联反应，生成标签装载的中间体化合物Fmoc-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；偶联结束后在原反应液中加入脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂脱除Fmoc保护基团，直接以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取，得到脱除Fmoc保护基团的中间体NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；
3）、在偶联试剂作用下，将Fmoc与Trt保护的半胱氨酸Fmoc-Cys(Trt)11-OH直接加入到上述NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液中进行酰胺偶联反应，生成标签装载的中间体化合物Fmoc-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；偶联结束后在原反应液中加入脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂脱除Fmoc保护基团，直接以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取，得到脱除Fmoc保护基团的中间体NH2-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；
4）、依次以Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Gly10-OH、Fmoc-Tyr(tBu)9-OH、Fmoc-Glu(tBu)8-OH、Fmoc-Gly7-OH、Fmoc-Thr(tBu)6-OH、Fmoc-Asp(tBu)5-OH、Fmoc-Glu(tBu)4-OH、Fmoc-Tyr(tBu)3-OH、Fmoc-Gln(Trt)2-OH和Fmoc-Leu1-OH为原料，在偶联试剂、脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂作用下，在原溶液中重复进行酰胺偶联反应和脱除Fmoc保护基团，并以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取反应液，肽链延伸得到标签装载的LR12肽前体化合物NH2-Leu1-Gln(Trt)2-Glu(tBu)3-Glu(tBu)4-Asp(tBu)5-Thr(tBu)6-Gly7-Glu(tBu)8-Tyr(tBu)9-Gly10-Cys(Trt)11-Val12-COHN-Rink-TAG溶液；
5）、将上述LR12肽前体化合物溶液采用酸性裂解试剂进行裂解处理，脱除LR12肽前体化合物上的Rink-TAG标签基团和侧链的Trt、tBu保护基团，得到目标LR12肽化合物H-Leu1-Gln2-Glu3-Glu4-Asp5-Thr6-Gly7-Glu8-Tyr9-Gly10-Cys11-Val12-COHN2。
本发明中以含巯基化合物R'-SH作为Fmoc捕获试剂，其作用是与脱除掉的Fmoc基团形成Fmoc-巯基羧酸加合物，利用其中的羧基增加加合物的亲水性，从而能够通过无机碱水溶液的洗涤萃取，将Fmoc基团从反应溶液中除去。
具体地，所述的Fmoc捕获试剂可以包括但不限于是巯基丁二酸（Msa）、巯基丁酸（Mba）、半胱氨酸（Cys）等中的一种或几种。
本发明所使用的氨基酸原料中，除采用芴甲氧羰酰基（Fmoc）对各种氨基酸的α-氨基进行保护外，氨基酸上的侧链活性基团也进行了保护。具体包括，以三苯甲基（Trt）保护半胱氨酸（Cys）的侧链巯基和谷氨酰胺（Gln）的侧链氨基，以叔丁基（tBu）保护天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的侧链羧基，以及酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）的侧链羟基。
进一步地，本发明所述液相合成方法中，所述脱除Fmoc保护基团的反应具体是采用脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂在0～25℃条件下搅拌反应2～3h脱除掉Fmoc基团，并形成Fmoc-巯基羧酸加合物。
更具体地，所述的脱Fmoc试剂可以包括但不限于是二乙胺（DEA）/乙腈混合液、哌啶/乙腈混合液或1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）溶液中的一种或几种。
通过本发明上述的脱除Fmoc保护基团反应，可以实现LR12肽的氨基酸的可持续延伸。偶联结束后，在偶联反应原反应溶液中直接加入脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂，标签装载的LR12肽中间体以及过量的Fmoc保护氨基酸在脱Fmoc试剂处理下均脱除Fmoc基团，被脱除的Fmoc残基与Fmoc捕获试剂反应形成Fmoc-巯基羧酸加合物，与过量的偶联试剂和氨基酸原料均可以通过使用无机酸性和碱性水溶液洗涤萃取的简单方式被方便地从原反应溶液中除去，从而达到净化原反应溶液中杂质的目的，使得净化后的LR12肽中间体原反应溶液可以直接用于进行下一步的氨基酸偶联而无需补充反应溶剂。
具体地，本发明所述液相合成方法中使用的反应溶剂为各种能与水形成良好相分离的有机溶剂，例如，可以是氯仿、二氯甲烷等中的一种或几种。
进一步地，本发明所述液相合成方法中，所述的酰胺偶联反应可以是在各种常规的偶联试剂作用下进行，本发明对其并没有特殊的限定。优选地，本发明使用的偶联试剂可以是EDCl/HOBt、DIC/HOBt、DCC/HOSU、HATU/DIEA、PyBOP/DIEA中的一种或几种。
更具体地，所述酰胺偶联反应优选是在0～40℃下搅拌反应0.5～2h。
本发明中，采用酸性裂解试剂对所述LR12肽前体化合物进行裂解处理1～2h，即可将LR12肽前体化合物上的Rink-TAG标签基团、侧链上的Trt、tBu保护基团全部裂解脱除。
所述的酸性裂解试剂同样是在SPPS中使用的各种常规的用于氨基酸保护基团脱除的酸性裂解试剂，本发明对其没有特殊限定。例如，可以是三氟乙酸/三异丙基硅烷/水/甲基苯硫醚（TFA/Tis/H2O/PhSMe）溶液组合物，也可以是三氟乙酸/三异丙基硅烷/水（TFA/Tis/H2O）溶液组合物，或者是三氟乙酸/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇/三异丙基硅烷/水（TFA/DODT/Tis/H2O）溶液组合物中的任意一种。
进一步地，由LR12肽前体化合物裂解后得到的无保护的粗LR12肽化合物可以通过冷异丙醚、冷乙醚，或者其他冰冷的低级性醚类溶剂进行沉淀纯化处理。
本发明最后采用制备型色谱柱对粗LR12肽目标产物进行纯化处理。
本发明利用可溶性标签作为LR12肽合成载体实现Fmoc氨基酸的均相偶联，并在脱除Fmoc保护的过程中加入含巯基的Fmoc捕获试剂，使Fmoc残基副产物易于通过洗涤去除达到净化目的，进而提供了一种可持续的LR12肽液相制备方法，在脱除Fmoc基团后通过简便的洗涤萃取即可实现反应溶液的初步净化，并在原反应溶液中直接进行下一个氨基酸的偶联，达到可持续肽链延伸的目的。
本发明所提出的Fmoc捕获试剂和易溶性标签辅助的液相可持续LR12肽制备实现了原始的反应溶剂即可完成所有LR12肽链的延长，避免了传统液相肽制备中需要每步反复的减压浓缩去除溶剂和重新添加溶剂的繁琐。同时，LR12肽的可持续合成相比于SPPS避免了化学试剂对树脂的溶胀程序，以及偶联后需要使用大量有毒化学试剂洗涤树脂的净化过程。该LR12肽的简便高效合成最大化地节约了有毒溶剂使用，解决了LR12肽在传统SPPS中面临的氨基酸原料消耗大、花费成本高、难以批量化生产制备，以及难降解树脂废弃物造成的环境污染等挑战，高度符合国家四部门联合发布的《推动原料药产业绿色发展的指导意见》。
附图说明
图1是LR12肽前体化合物的高分辨质谱图。
图2是LR12肽目标化合物的高分辨质谱图。
实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
以下实施例的工艺主要包括以下步骤。
（1）Fmoc-Rink-TAG在反应溶液中的脱Fmoc保护和Fmoc的巯基捕获，以及反应溶液的洗涤萃取纯化，得到NH2-Rink-TAG标签分子的DCM溶液。
（2）NH2-Rink-TAG标签分子与Fmoc氨基酸的可持续偶联、脱除Fmoc保护和Fmoc巯基捕获，以及反应溶液洗涤萃取纯化，得到标签偶联氨基酸的DCM溶液。
（3）NH2-Rink-TAG标签分子标签辅助液相LR12肽链剩余Fmoc氨基酸的延伸。
（4）Rink-TAG标签及侧链保护基团（Trt、tBu）的酸性裂解脱除，以及目标化合物LR12肽的沉淀纯化。
实施例
实施例1
步骤1：Rink Amide酸环十二酯脱除Fmoc保护制备NH2-Rink-TAG标签反应溶液
称取Rink Amide酸环十二酯（3.5g，5mmol），溶于30mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min，依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，并萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到Rink-NH2酸环十二酯（NH2-Rink-TAG）标签的二氯甲烷溶液。
步骤2：NH2-Rink-TAG与Fmoc-Val12-OH酰胺偶联及脱Fmoc保护，制备NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液
直接在上述制备的NH2-Rink-TAG标签二氯甲烷溶液中依次加入Fmoc-Val12-OH（1.8g，5.25mmol）、EDCl（1.15g，6mmol）、HOBt（0.8g，6mmol），室温搅拌反应1h，TLC监测反应终点。反应结束后将溶液体系转至冰浴下搅拌10min，并依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到NH2-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
步骤3：NH2-Rink-TAG标签辅助延伸制备LR12肽前体化合物
重复步骤2，在NH2-Val12-CONH-Rink-TAG二氯甲烷溶液中使用EDCl/HOBt偶联试剂系统继续进行氨基酸Fmoc-Cys(Trt)11-OH的酰胺偶联，并使用二乙胺/乙腈/巯基丁二酸体系脱除Fmoc基团后，分别使用1M HCl水溶液和10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到脱保护的二肽中间体产物NH2-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
以上述酰胺偶联和脱Fmoc保护为一个循环重复以上步骤，依次进行Fmoc-Gly10-OH、Fmoc-Tyr(tBu)9-OH、Fmoc-Glu(tBu)8-OH、Fmoc-Gly7-OH、Fmoc-Thr(tBu)6-OH、Fmoc-Asp(tBu)5-OH、Fmoc-Glu(tBu)4-OH、Fmoc-Tyr(tBu)3-OH、Fmoc-Gln(Trt)2-OH和Fmoc-Leu1-OH的酰胺偶联和脱Fmoc保护反应，得到NH2-Rink-TAG标签装载的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液。
上述制备的LR12肽前体化合物结构为：NH2-Leu1-Gln(Trt)2-Glu(tBu)3-Glu(tBu)4- Asp(tBu)5-Thr(tBu)6-Gly7-Glu(tBu)8-Tyr(tBu)9-Gly10-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG，其质谱图如图1所示，HRMS (ESI) m/z calcd for C146H199N14O28S+ (M+H)+2628.42935，found 2628.42969。
步骤4：裂解脱除LR12肽前体化合物的标签及侧链保护基团制备LR12肽
在上述获得的含有标签和侧链保护基团的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸/三异丙基硅烷/水/苯甲硫醚（TFA/Tis/H2O/PhSMe=85/2.5/2.5/10，v/v/v/ v）裂解试剂20mL，室温下搅拌反应2h。
裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚，至出现白色沉淀，离心，固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚，并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到目标产物LR12粗肽，再以制备液相色谱纯化得到LR12肽，总产率31%。
目标化合物LR12肽结构为：H-Leu1-Gln2-Glu3-Glu4-Asp5-Thr6-Gly7-Glu8-Tyr9-Gly10- Cys11-Val12-CONH2，质谱图如附图2，HRMS (ESI) m/z calcd for C55H85N14O23S+ (M+H)+ 1341.56272，found 1341.56272。
实施例2
步骤1：Rink Amide酸环十二酯脱除Fmoc保护制备NH2-Rink-TAG标签反应溶液
称取Rink Amide酸环十二酯（3.5g，5mmol），溶于30mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min，依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，并萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到Rink-NH2酸环十二酯（NH2-Rink-TAG）标签的二氯甲烷溶液。
步骤2：NH2-Rink-TAG与Fmoc-Val12-OH酰胺偶联及脱Fmoc保护，制备NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液
直接在上述制备的NH2-Rink-TAG标签二氯甲烷溶液中依次加入Fmoc-Val12-OH（1.8g，5.25mmol）、EDCl（1.15g，6mmol）、HOBt（0.8g，6mmol），室温搅拌反应1h，TLC监测反应终点。反应结束后将溶液体系转至冰浴下搅拌10min，并依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到NH2-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
步骤3：NH2-Rink-TAG标签辅助延伸制备LR12肽前体化合物
重复步骤2，在NH2-Val12-CONH-Rink-TAG二氯甲烷溶液中使用EDCl/HOBt偶联试剂系统继续进行氨基酸Fmoc-Cys(Trt)11-OH的酰胺偶联，并使用二乙胺/乙腈/巯基丁二酸体系脱除Fmoc基团后，分别使用1M HCl水溶液和10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到脱保护的二肽中间体产物NH2-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
以上述酰胺偶联和脱Fmoc保护为一个循环重复以上步骤，依次进行Fmoc-Gly10-OH、Fmoc-Tyr(tBu)9-OH、Fmoc-Glu(tBu)8-OH、Fmoc-Gly7-OH、Fmoc-Thr(tBu)6-OH、Fmoc-Asp(tBu)5-OH、Fmoc-Glu(tBu)4-OH、Fmoc-Tyr(tBu)3-OH、Fmoc-Gln(Trt)2-OH和Fmoc-Leu1-OH的酰胺偶联和脱Fmoc保护反应，得到NH2-Rink-TAG标签装载的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液。
步骤4：裂解脱除LR12肽前体化合物的标签及侧链保护基团制备LR12肽
在上述获得的含有标签和侧链保护基团的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇（TFA/H2O/Tis/DODT=91/2.3/2.3/4.4，v/v/v/v）裂解试剂20mL，室温下搅拌反应2h。
裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚，至出现白色沉淀，离心，固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚，并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到目标产物LR12粗肽，再以制备液相色谱纯化得到LR12肽，总产率26%。
实施例3
步骤1：Rink Amide酸环十二酯脱除Fmoc保护制备NH2-Rink-TAG标签反应溶液
称取Rink Amide酸环十二酯（7.0g，10mmol），溶于60mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min，依次加入30mL乙腈、10mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（3.8g，25mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，并萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到Rink-NH2酸环十二酯（NH2-Rink-TAG）标签的二氯甲烷溶液。
步骤2：NH2-Rink-TAG与Fmoc-Val12-OH酰胺偶联及脱Fmoc保护，制备NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液
直接在上述制备的NH2-Rink-TAG标签二氯甲烷溶液中依次加入Fmoc-Val12-OH（3.6g，10.5mmol）、EDCl（2.3g，12mmol）、HOBt（1.6g，12mmol），室温搅拌反应1h，TLC监测反应终点。反应结束后将溶液体系转至冰浴下搅拌10min，并依次加入30mL乙腈、10mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（3.8g，25mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到NH2-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
步骤3：NH2-Rink-TAG标签辅助延伸制备LR12肽前体化合物
重复步骤2，在NH2-Val12-CONH-Rink-TAG二氯甲烷溶液中使用EDCl/HOBt偶联试剂系统继续进行氨基酸Fmoc-Cys(Trt)11-OH的酰胺偶联，并使用二乙胺/乙腈/巯基丁二酸体系脱除Fmoc基团后，分别使用1M HCl水溶液和10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到脱保护的二肽中间体产物NH2-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
以上述酰胺偶联和脱Fmoc保护为一个循环重复以上步骤，依次进行Fmoc-Gly10-OH、Fmoc-Tyr(tBu)9-OH、Fmoc-Glu(tBu)8-OH、Fmoc-Gly7-OH、Fmoc-Thr(tBu)6-OH、Fmoc-Asp(tBu)5-OH、Fmoc-Glu(tBu)4-OH、Fmoc-Tyr(tBu)3-OH、Fmoc-Gln(Trt)2-OH和Fmoc-Leu1-OH的酰胺偶联和脱Fmoc保护反应，得到NH2-Rink-TAG标签装载的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液。
步骤4：裂解脱除LR12肽前体化合物的标签及侧链保护基团制备LR12肽
在上述获得的含有标签和侧链保护基团的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸/三异丙基硅烷/水/苯甲硫醚（TFA/Tis/H2O/PhSMe=85/2.5/2.5/10，v/v/v/ v）裂解试剂20mL，室温下搅拌反应2h。
裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚，至出现白色沉淀，离心，固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚，并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到目标产物LR12粗肽，再以制备液相色谱纯化得到LR12肽，总产率29%。
实施例4
步骤1：4,4'-二苯基膦酰氧基-Rink Amide酸二苯甲基酯脱除Fmoc保护制备NH2-Rink-TAG标签反应溶液
称取4,4'-二苯基膦酰氧基-Rink Amide酸二苯甲基酯（5.7g，5mmol），溶于30mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min，依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，并萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到4,4'-二苯基膦酰氧基Rink酸二苯甲基酯（NH2-Rink-TAG）标签的二氯甲烷溶液。
步骤2：NH2-Rink-TAG与Fmoc-Val12-OH酰胺偶联及脱Fmoc保护，制备NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液
直接在上述制备的NH2-Rink-TAG标签二氯甲烷溶液中依次加入Fmoc-Val12-OH（1.8g，5.25mmol）、EDCl（1.15g，6mmol）、HOBt（0.8g，6mmol），室温搅拌反应1h，TLC监测反应终点。反应结束后将溶液体系转至冰浴下搅拌10min，并依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除Fmoc基团3h。
脱除Fmoc基团结束后，以1M HCl水溶液调节反应液至中性，萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到NH2-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
步骤3：NH2-Rink-TAG标签辅助延伸制备LR12肽前体化合物
重复步骤2，在NH2-Val12-CONH-Rink-TAG二氯甲烷溶液中使用EDCl/HOBt偶联试剂系统继续进行氨基酸Fmoc-Cys(Trt)11-OH的酰胺偶联，并使用二乙胺/乙腈/巯基丁二酸体系脱除Fmoc基团后，分别使用1M HCl水溶液和10% Na2CO3水溶液洗涤萃取，得到脱保护的二肽中间体产物NH2-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG的二氯甲烷溶液。
以上述酰胺偶联和脱Fmoc保护为一个循环重复以上步骤，依次进行Fmoc-Gly10-OH、Fmoc-Tyr(tBu)9-OH、Fmoc-Glu(tBu)8-OH、Fmoc-Gly7-OH、Fmoc-Thr(tBu)6-OH、Fmoc-Asp(tBu)5-OH、Fmoc-Glu(tBu)4-OH、Fmoc-Tyr(tBu)3-OH、Fmoc-Gln(Trt)2-OH和Fmoc-Leu1-OH的酰胺偶联和脱Fmoc保护反应，得到NH2-Rink-TAG标签装载的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液。
步骤4：裂解脱除LR12肽前体化合物的标签及侧链保护基团制备LR12肽
在上述获得的含有标签和侧链保护基团的LR12肽前体化合物的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸/三异丙基硅烷/水/苯甲硫醚（TFA/Tis/H2O/PhSMe=85/2.5/2.5/10，v/v/v/ v）裂解试剂20mL，室温下搅拌反应2h。
裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚，至出现白色沉淀，离心，固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚，并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到目标产物LR12粗肽，再以制备液相色谱纯化得到LR12肽，总产率34%。
目标化合物LR12肽结构为：H-Leu1-Gln2-Glu3-Glu4-Asp5-Thr6-Gly7-Glu8-Tyr9-Gly10- Cys11-Val12-CONH2。
上述4个实施例中，实施例2相比于实施例1和实施例3，将裂解试剂由三氟乙酸/三异丙基硅烷/水/苯甲硫醚（TFA/Tis/H2O/PhSMe=85/2.5/2.5/10，v/v/v/v）替换为三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇（TFA/H2O/Tis/DODT=91/2.3/2.3/4.4，v/v/v/v），裂解过程中LR12肽总体产率略有降低，出现部分杂质残留，影响总体产率及纯度，因此实施例2在产品纯度和产率上不如实施例1和实施例3。
实施例3相比于实施例1，将原始物料及偶联试剂的投料比、反应溶剂、脱保护试剂和捕获试剂均增加1倍，目标肽LR12肽总体产率略微降低，考虑可能是放大过程中原始物料和溶剂含水量、空气湿度造成的产率降低，均在有效范围内。
实施例4相比于实施例1，将Rink Amide酸环十二酯标签替换为4,4'-二苯基膦酰氧基-Rink Amide酸二苯甲基酯标签，得到LR12肽的产率略微增高，考虑在制备过程中每步偶联产率较高，造成整体制备的产率增高。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种LR12肽的液相合成方法，是以下述结构通式（I）所示的NH2-Rink-TAG作为标签分子：
，
其中，取代基R是碳数大于10且小于40的直链或支链烷基或环烷基，或者是4-二苯基膦酰氧基二苯甲基或4,4’-二苯基膦酰氧基二苯甲基；
以含巯基化合物R'-SH作为Fmoc捕获试剂，
其中，取代基R'选自含有一个或多个-COOH侧链基团的烷基链；
按照下述步骤制备LR12肽：
1）、在反应溶剂中以脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂处理下述结构通式（II）所示Fmoc保护的Fmoc-NH-Rink-TAG，直接以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取，得到结构通式（I）所示的脱除Fmoc保护基团的NH2-Rink-TAG标签分子溶液；
，
2）、在偶联试剂作用下，将Fmoc保护的缬氨酸Fmoc-Val12-OH直接加入到上述NH2-Rink-TAG标签分子溶液中进行酰胺偶联反应，生成标签装载的中间体化合物Fmoc-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；偶联结束后在原反应液中加入脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂脱除Fmoc保护基团，直接以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取，得到脱除Fmoc保护基团的中间体NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；
3）、在偶联试剂作用下，将Fmoc与Trt保护的半胱氨酸Fmoc-Cys(Trt)11-OH直接加入到上述NH2-Val12-CONH-Rink-TAG溶液中进行酰胺偶联反应，生成标签装载的中间体化合物Fmoc-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；偶联结束后在原反应液中加入脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂脱除Fmoc保护基团，直接以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取，得到脱除Fmoc保护基团的中间体NH2-Cys(Trt)11-Val12-CONH-Rink-TAG溶液；
4）、依次以Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Gly10-OH、Fmoc-Tyr(tBu)9-OH、Fmoc-Glu(tBu)8-OH、Fmoc-Gly7-OH、Fmoc-Thr(tBu)6-OH、Fmoc-Asp(tBu)5-OH、Fmoc-Glu(tBu)4-OH、Fmoc-Tyr(tBu)3-OH、Fmoc-Gln(Trt)2-OH和Fmoc-Leu1-OH为原料，在偶联试剂、脱Fmoc试剂和Fmoc捕获试剂作用下，在原溶液中重复进行酰胺偶联反应和脱除Fmoc保护基团，并以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取反应液，肽链延伸得到标签装载的LR12肽前体化合物NH2-Leu1-Gln(Trt)2-Glu(tBu)3-Glu(tBu)4-Asp(tBu)5-Thr(tBu)6-Gly7-Glu(tBu)8-Tyr(tBu)9-Gly10-Cys(Trt)11-Val12-COHN-Rink-TAG溶液；
5）、将上述LR12肽前体化合物溶液采用酸性裂解试剂进行裂解处理，脱除LR12肽前体化合物上的Rink-TAG标签基团和侧链的Trt、tBu保护基团，得到目标LR12肽化合物H-Leu1-Gln2-Glu3-Glu4-Asp5-Thr6-Gly7-Glu8-Tyr9-Gly10-Cys11-Val12-COHN2。
2.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是所述Fmoc捕获试剂是巯基丁二酸、巯基丁酸、半胱氨酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是所述脱Fmoc试剂是二乙胺/乙腈混合液、哌啶/乙腈混合液或1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯溶液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是在0～25℃条件下搅拌反应2～3h脱除掉Fmoc基团，并形成Fmoc-巯基羧酸加合物。
5.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是所述反应溶剂是氯仿、二氯甲烷中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是以EDCl/HOBt、DIC/HOBt、DCC/HOSU、HATU/DIEA、PyBOP/DIEA中的一种或几种为酰胺偶联试剂，在0～40℃搅拌下进行酰胺偶联反应0.5～2h。
7.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是以三氟乙酸/三异丙基硅烷/水/甲基苯硫醚溶液组合物、三氟乙酸/三异丙基硅烷/水溶液组合物、三氟乙酸/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇/三异丙基硅烷/水溶液组合物中的任意一种作为酸性裂解试剂，对所述LR12肽前体化合物进行裂解处理1～2h脱除Rink-TAG标签基团和侧链上的Trt、tBu保护基团。
8.根据权利要求1所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是将LR12肽前体化合物裂解后得到的LR12肽通过冷异丙醚、冷乙醚，或者其他冰冷的低级性醚类溶剂进行沉淀纯化处理。
9.根据权利要求8所述的LR12肽的液相合成方法，其特征是采用制备型色谱柱对沉淀纯化处理后的LR12肽进行再次纯化处理。
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