CN117069797A

CN117069797A - 一种依替巴肽的液相合成方法

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Publication number: CN117069797A
Application number: CN202310863140.0A
Authority: CN
Inventors: 梁泰刚; 李海迪; 段陈平; 罗霞; 王廉峻; 张林艳; 靳元逵; 段玥如
Original assignee: Shanxi Deyuantang Pharmaceutical Co ltd; Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Deyuantang Pharmaceutical Co ltd; Shanxi Medical University
Priority date: 2023-07-14
Filing date: 2023-07-14
Publication date: 2023-11-17

Abstract

一种依替巴肽的液相合成方法，利用标签分子作为载体辅助依替巴肽链酰胺偶联，偶联结束后的原溶液直接在含巯基化合物Fmoc残基捕获试剂辅助下脱除Fmoc保护，形成Fmoc‑巯基羧酸加合物萃取洗涤除去，达到净化原溶液中杂质的目的，从而在原溶液中直接进行肽链的后续偶联，实现一锅法的肽链延伸。本发明方法能够极大地降低化学试剂的使用并提高合成效率，通过在原始溶液体系中实现肽链的延伸，避免溶剂的大量浪费。

Description

一种依替巴肽的液相合成方法

技术领域

本发明属于有机合成及多肽化学合成技术领域，涉及依替巴肽的合成方法，特别是涉及一种依替巴肽的液相合成方法。

背景技术

依替巴肽，英文名称Eptifibatide，商品名Integrelin，是用于治疗心血管疾病的特效药物，具有药效高、副作用低等优势，现已得到临床的广泛使用。依替巴肽可以显著改善外周血流和组织灌注，是一种血细胞膜糖蛋白受体拮抗剂（GPIIb/IIIa），主要用于治疗急性冠脉综合征（ACS）和ST段抬高型心梗。

依替巴肽最初由美国COR Therapeutic公司开发，并于1998年在美国上市。依替巴肽为六个氨基酸与巯基丙酸组成的环状碳末端酰胺化多肽，化学结构及氨基酸序列结构如下所示。

目前，依替巴肽的合成主要包括液相多肽合成（LPPS）及固相多肽合成（SPPS）技术。其中，固相多肽合成是以难溶性的高分子树脂作为依替巴肽的合成载体，在进行氨基酸的非均相偶联及脱保护后，通过溶剂的多次洗涤即可完成中间肽的分离纯化，如CN110498834A、CN 105585613A和CN105037496A均公开了基于高分子树脂载体辅助的依替巴肽固相制备方法。然而，依替巴肽的固相多肽合成不仅合成树脂载体价格昂贵，装载率较低（0.3～2.0mmol/g），而且制备路线繁琐，在每一步依替巴肽氨基酸的偶联后，都需要使用大量的非绿色化学试剂对树脂进行反复洗涤，以去除过量原料及副产物。同时，依替巴肽的固相合成中氨基酸需要过量3～5倍，才能保证树脂上反应位点的最大化偶联反应，造成依替巴肽的合成成本极高，限制了依替巴肽原料药物的规模化生产制备。

而依替巴肽肽链的液相合成则在每次进行偶联后，都需要进行色谱纯化，或通过沉淀方法纯化依替巴肽中间体，如CN 102924569A和CN 103450346A所公开的有关依替巴肽液相合成方法。依替巴肽液相合成方法需要耗费大量的人力及物力，同样需要使用超量的非绿色化学试剂，造成试剂污染物的浪费及排放，不利于大规模化的依替巴肽生产制备和环境保护。

目前，依替巴肽原料药物市场需求不断扩大，传统的固相和液相依替巴肽合成面临化学试剂严重浪费、难降解高分子污染物排放造成的经济与环境方面的挑战，无论从经济成本还是从社会效益上看，依替巴肽的合成都缺乏经济绿色的合成方案。因此，探索开发试剂节约型的绿色依替巴肽合成制备方法，将很大程度上改善依替巴肽生产所面临的挑战。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种新的依替巴肽的液相合成方法，通过在原始溶液体系中实现肽链的延伸，以避免溶剂的大量浪费。

相比于传统的固相及液相依替巴肽合成，本发明方法利用标签分子作为载体辅助依替巴肽链的酰胺偶联，偶联结束后的原溶液直接在Fmoc残基捕获试剂的辅助下脱除Fmoc保护，经萃取洗涤后进行后续偶联，实现了一锅法的肽链延伸。本发明能够极大地降低化学试剂的使用并提高合成效率，主要解决了目前依替巴肽固相及液相合成制备过程中所面临的化学溶剂浪费等方面的不足。

本发明所述的依替巴肽的液相合成方法具体是以下述结构通式（I）所示的Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯（简称为NH₂-Rink-DPP）作为标签分子：

其中，取代基R选自H、OPOPh₂、卤原子或NO₂；

以含巯基化合物R'-SH作为Fmoc残基捕获试剂，

其中，取代基R'选自含有一个或多个-COOH侧链基团的烷基链；

按照下述步骤一锅法制备依替巴肽：

1）在反应媒介中以脱Fmoc试剂和Fmoc残基捕获试剂处理下述结构通式（II）所示的处于Fmoc保护状态下的Rink Amide酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯，分别以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取反应液，得到结构通式（I）所示的脱除Fmoc保护基团的Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯标签分子溶液；

2）将Fmoc与Trt保护的半胱氨酸Fmoc-Cys(Trt)-OH直接加入上述Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯标签分子溶液中，在偶联试剂作用下进行酰胺偶联反应，生成标签装载的中间体化合物Fmoc-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP溶液；

3）在偶联结束后的反应溶液中直接加入脱Fmoc试剂和Fmoc残基捕获试剂，再次脱除Fmoc保护基团，分别以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取反应液，得到脱除Fmoc保护基团的中间体NH₂-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP溶液；

4）依次以Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har(PG)-OH和氨基酸Mpa(Trt)-OH为原料，在偶联试剂、脱Fmoc试剂和Fmoc残基捕获试剂作用下，在原反应溶液中重复进行酰胺偶联反应和脱除Fmoc保护基团，并以无机酸和无机碱水溶液洗涤萃取反应液，肽链延伸得到标签装载的依替巴肽前体化合物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP溶液；

5）采用酸性裂解试剂对上述依替巴肽前体化合物溶液进行裂解处理，脱除依替巴肽前体化合物上的标签基团和侧链的Trt、tBu、Boc保护基团，得到无保护的线性依替巴肽化合物Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-CONH₂；

6）以线性依替巴肽化合物在空气环境下进行分子内二硫键的氧化环合，制备得到依替巴肽目标产物。

本发明中以含巯基化合物R'-SH作为Fmoc残基捕获试剂，其作用是与脱除掉的Fmoc基团形成Fmoc-巯基羧酸加合物，从而能够通过无机碱水溶液的洗涤萃取，将Fmoc基团从反应溶液中除去。

进一步地，在所述含巯基化合物R'-SH的取代基R'的烷基链上，除含有-COOH侧链基团外，还可以含有一个或多个-NH₂侧链基团。

Fmoc残基是与含巯基化合物中的巯基基团发生反应形成共价键，其中的羧基和氨基只是增加加合物的亲水性，因此，R'中包含的羧基、氨基基团越多，对Fmoc残基的洗涤效果也越好，更易于通过无机碱水溶液的洗涤萃取除去。

本发明除了采用芴甲氧羰酰基（Fmoc）对用于进行肽链延伸的各种氨基酸原料的α-氨基进行保护外，还对氨基酸上的侧链活泼基团也进行了保护。具体包括，以三苯甲基（Trt）保护半胱氨酸（Cys）和巯基丙酸（Mpa）的侧链巯基，以叔丁氧羰基（Boc）保护色氨酸（Trp）的侧链吲哚基，以叔丁基（tBu）保护天冬氨酸（Asp）的侧链羧基。同时，对于高精氨酸（Har）的侧链胍基，可以是采用芳磺酰类的Pbf保护基，或叔丁氧羰基（Boc）进行保护，或者是裸露的胍基无保护。

进一步地，本发明所述液相合成方法中，所述脱除Fmoc保护基团的反应是采用脱Fmoc试剂和Fmoc残基捕获试剂在0～25℃条件下搅拌反应2～3h，以脱除掉Fmoc基团，并形成Fmoc-巯基羧酸加合物。

具体地，所述的Fmoc残基捕获试剂可以包括但不限于是巯基丁二酸（Msa）、巯基丁酸（Mba）、半胱氨酸（Cys）等中的一种或几种。

更具体地，所述的脱Fmoc试剂可以包括但不限于是二乙胺（DEA）/乙腈混合液、哌啶/乙腈混合液、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）溶液中的一种或几种。

通过本发明上述的脱除Fmoc保护基团的反应，实现了本发明依替巴肽肽链的一锅法延伸。偶联结束后，在偶联反应的原反应溶液中直接加入脱Fmoc试剂和Fmoc残基捕获试剂，标签装载的多肽中间体、过量的Fmoc保护氨基酸或氨基酸与偶联试剂形成的活化酯在脱Fmoc试剂处理下均脱除Fmoc基团，被脱除的Fmoc残基与Fmoc残基捕获试剂反应形成Fmoc-巯基羧酸加合物，可以通过使用无机酸性和碱性水溶液洗涤萃取的简单方式被方便地从原反应溶液中除去。而偶联试剂、过量的氨基酸原料在脱除Fmoc保护后，也可以通过无机酸和无机碱性水溶液的洗涤萃取除去，从而达到净化原反应溶液中杂质的目的，使得净化后的原反应溶液可以直接用于进行下一步的氨基酸偶联而无需补充反应溶剂。

具体地，本发明所述液相合成方法中使用的反应媒介为各种能与水形成良好相分离的有机溶剂，例如，可以是氯仿、二氯甲烷等中的一种或几种。

进一步地，本发明所述液相合成方法中，所述的酰胺偶联反应可以是在各种常规的偶联试剂作用下进行，本发明对其并没有特殊的限定。优选地，本发明使用的偶联试剂可以是EDCl/HOBt、HATU/DIEA、DIC/HOBt、PyBOP/DIEA、DCC/HOSU中的一种或几种。

更具体地，所述酰胺偶联反应优选是在0～40℃下搅拌反应0.5～2h。

本发明中，采用酸性裂解试剂对所述依替巴肽前体化合物进行裂解处理3～5h，即可将依替巴肽前体化合物上的Rink-DPP标签基团以及侧链上的Trt、tBu、Boc保护基团全部裂解脱除。

所述的酸性裂解试剂同样是各种常规的用于氨基酸保护基团脱除的各种酸性裂解试剂，本发明对其没有特殊限定。例如，可以是三氟乙酸/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇/三异丙基硅烷/水（TFA/DODT/Tis/H₂O）溶液组合物，也可以是三氟乙酸/三异丙基硅烷/水（TFA/Tis/H₂O）溶液组合物或三氟乙酸/1,2-乙二硫醇/水/苯甲醚（TFA/EDT/H₂O/ PhOMe）溶液组合物。

进一步地，由依替巴肽前体化合物裂解后得到的无保护的线性依替巴肽化合物可以通过冷异丙醚、冷乙醚，或者其他冰冷的低级性醚类溶剂进行沉淀纯化处理。

进一步地，本发明中线性依替巴肽化合物的氧化环合具体是将线性依替巴肽化合物用水/乙腈混合液溶解后，在室温下暴露于空气中搅拌进行线性依替巴肽分子内二硫键的氧化环合。

更进一步地，本发明所述线性依替巴肽化合物的氧化环合还可以是在存在有氧化试剂的条件下进行，所述的氧化试剂是DMSO、双氧水、I₂中的一种或几种。

更进一步地，所述的氧化环合反应优选是在弱酸性或弱碱性条件下进行的。

更具体地，本发明是采用醋酸或NH₄OH将水/乙腈混合液调至弱酸性或弱碱性，进行线性依替巴肽化合物的分子内二硫键的氧化环合。

本发明最后采用制备型色谱柱对最终氧化环合得到的依替巴肽目标产物进行纯化处理。

本发明利用可溶性的Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯标签作为依替巴肽合成的载体，实现氨基酸的液相偶联反应，并通过在脱除Fmoc保护基团的过程中加入了含巯基的Fmoc残基捕获试剂，使得副产物Fmoc基团易于通过洗涤萃取的方式除去以达到净化原反应溶液的目的，从而获得了一种一锅法依替巴肽液相合成方法。

本发明中所述含巯基的Fmoc残基捕获试剂不仅能够与脱除的Fmoc残基反应形成加合物，还可以避免脱除的Fmoc残基与脱Fmoc试剂中的有机碱结合形成复合物，干扰影响后续氨基酸的多肽偶联。该方法在脱除Fmoc基团后，通过简便的洗涤萃取即可实现反应液的初步纯化，并在原反应溶液中直接进行下一个氨基酸的偶联，达到一锅法肽链延伸的目的。

本发明提供的利用Fmoc残基捕获试剂和易溶性标签辅助的液相一锅法依替巴肽合成工艺实现了一锅原始反应溶剂即可完成所有依替巴肽肽链的延长，避免了传统液相依替巴肽合成中需要每步反复减压浓缩去除溶剂和添加溶剂的繁琐操作。同时，一锅法依替巴肽的合成相比于固相依替巴肽合成，避免了化学试剂对树脂的溶胀程序，以及偶联后需要使用大量有毒化学试剂洗涤树脂来实现净化的过程。

本发明依替巴肽的一锅法合成，最大化地节约了化学有毒溶剂的使用，解决了依替巴肽在传统的固相或液相制备中面临的氨基酸原料消耗大、花费成本高、难以批量化生产制备，以及难降解高分子废弃物造成的环境污染等难题，简便高效地实现了依替巴肽的绿色合成，极大降低了化学试剂的使用，减少了试剂排放对环境的污染，高度符合国家四部门联合发布的《推动原料药产业绿色发展的指导意见》。

附图说明

图1是一锅法液相合成依替巴肽的合成流程图。

图2是中间体Fmoc-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱图。

图3是中间体NH₂-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱图。

图4是中间体NH₂-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱图。

图5是前体化合物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱图。

实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。

本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。

本发明实施例中的一锅法液相合成依替巴肽主要包括以下步骤：

1）、Rink Amide酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯分子在反应溶液中的脱Fmoc保护和Fmoc残基的巯基捕获，以及对反应溶液的洗涤萃取纯化，从而得到NH₂-Rink-DPP标签分子的DCM溶液：

2）、Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯标签分子与Fmoc氨基酸的一锅法可持续偶联、脱除Fmoc保护和Fmoc残基的巯基捕获，以及反应溶液的洗涤萃取纯化，得到标签偶联氨基酸的DCM溶液：

3）、Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯标签辅助液相一锅法依替巴肽肽链的延伸：

4）、Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯标签及侧链保护基团的裂解脱除，以及线形依替巴肽的沉淀纯化：

5）、线性依替巴肽的氧化环合、依替巴肽的制备与纯化：

在本发明说明书中出现的一些常用缩写的具体含义如下所示：

Fmoc：芴甲氧羰基

EDCl：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

HOBt：1-羟基苯并三唑

HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

DIC：1,3-二异丙基碳二亚胺

PyBOP：1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

DCC：N,N-二环己基羰二亚胺

HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺

Msa：巯基丁二酸

Mba：巯基丁酸

DBU：1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯

DEA：二乙胺

Trt：三苯甲基

Boc：叔丁氧羰基

tBu：叔丁基

实施例

实施例1

步骤1：Rink Amide酸4,4'-二苯基膦酰氧基二苯甲酯脱Fmoc保护制备Rink-NH₂酸4,4'-二苯基膦酰氧基二苯甲酯（NH₂-Rink-DPP）标签反应溶液

称取Rink Amide酸4,4'-二苯基膦酰氧基二苯甲酯（5.7g，5mmol），溶于30mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min。依次向溶液体系中加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除3h。

脱除Fmoc结束后，以1M HCl水溶液将反应溶液调至中性，并萃取洗涤得到二氯甲烷有机相。有机相继续加入10% Na₂CO₃水溶液洗涤萃取，得到NH₂-Rink-DPP标签的二氯甲烷有机相溶液。

步骤2：NH₂-Rink-DPP标签与Fmoc-Cys(Trt)-OH一锅法偶联并脱Fmoc保护，制备NH₂-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP反应溶液

在步骤1的NH₂-Rink-DPP标签的二氯甲烷有机相溶液中依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH（3.1g，5.3mmol）、EDCl（1.15g，6mmol）、HOBt（0.8g，6mmol），室温下继续搅拌反应1h，TLC监测反应终点，制备得到中间体Fmoc-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP。

HRMS (ESI) m/z calcd for C₉₁H₇₇N₂O₁₂P₂S⁺(M+H)⁺1483.46670，found1483.46960，具体质谱图见图2。

反应结束后，将溶液体系转至冰浴条件下搅拌10min，依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（1.9g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除3h。

脱Fmoc结束后，以1M HCl水溶液将反应溶液调至中性，萃取洗涤得到的二氯甲烷有机相，继续加入10% Na₂CO₃水溶液洗涤萃取，得到NH₂-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的二氯甲烷有机相溶液。

步骤3：NH₂-Rink-DPP标签辅助依替巴肽链的一锅法延伸，制备Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP反应溶液

在步骤2的NH₂-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的二氯甲烷有机相溶液中继续重复步骤2的酰胺偶联方法，使用EDCl/HOBt偶联试剂系统进行氨基酸Fmoc-Pro-OH的偶联，得到NH₂-Rink-DPP装载的二肽中间体Fmoc-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP。

重复步骤1的脱Fmoc保护方法，继续使用二乙胺/乙腈/巯基丁二酸体系脱除Fmoc基团，并分别使用1M HCl水溶液和10% Na₂CO₃水溶液萃取洗涤得到脱保护产物的二氯甲烷有机相溶液。

以上一锅法的偶联和脱保护为一个循环，继续连续重复以上偶联和脱保护步骤，依次进行Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har-OH、Mpa(Trt)-OH的酰胺偶联和脱Fmoc保护反应，得到NH₂-Rink-DPP标签装载的依替巴肽前体化合物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP二氯甲烷有机相溶液。

其中NH₂-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱图如图3，HRMS (ESI) m/z calcd for C₁₀₇H₁₀₇N₇O₁₈P₂SNa⁺(M+Na)⁺1894.67607，found 1894.67725。

NH₂-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱如图4，HRMS (ESI) m/z calcd for C₁₁₄H₁₂₂N₁₁O₁₉P₂S⁺(M+H)⁺2042.81089，found 2042.81384。

前体化合物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP的质谱图如图5，HRMS (ESI) m/z calcd for C₁₃₆H₁₄₀N₁₁O₂₀P₂S₂ ⁺(M+H)⁺2372.91873，found 2372.92285。

步骤4：裂解脱除NH₂-Rink-DPP标签及侧链保护基团，制备线性依替巴肽Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-CONH₂

向步骤3得到的NH₂-Rink-DPP标签装载和含有侧链保护基团的依替巴肽前体化合物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP二氯甲烷有机相溶液中加入20mL由三氟乙酸/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇/三异丙基硅烷/水混合得到的裂解试剂（TFA/DODT/Tis/H₂O=91/2.3/2.3/4.4，v/v/v/v），室温下搅拌反应5h。

裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去二氯甲烷及大部分三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚至析出白色沉淀，离心进行固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到线性依替巴肽粗肽Mpa(SH)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-CONH₂，产率84%。

步骤5：线性依替巴肽氧化环合制备依替巴肽

将步骤4的线性依替巴肽粗肽Mpa(SH)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-CONH₂（1.0g，1.2mmol）溶解在DMSO/H₂O/乙腈（V _DMSO /V _H2O /V _ACN，0.05/0.8/0.15，1200mL）混合溶液中，滴加冰醋酸溶液调节pH至6.5，室温搅拌反应，HPLC监测环合过程，环合结束后停止反应，得到依替巴肽粗品混合液。

粗品混合液浓缩后经制备色谱柱纯化（色谱条件为流动相：乙腈/水0.1% TFA；C18柱；波长220nm，流速3mL/min）得到依替巴肽目标产物860mg，产率86%。

实施例2

称取Rink Amide酸4,4'-二苯基膦酰氧基二苯甲酯（5.7g，5mmol），溶于30mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min。依次向溶液体系中加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和半胱氨酸（1.5g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除3h。

在步骤1的NH₂-Rink-DPP标签的二氯甲烷有机相溶液中依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH（3.1g，5.3mmol）、EDCl（1.15g，6mmol）、HOBt（0.8g，6mmol），室温下继续搅拌反应1h，TLC监测反应终点。

反应结束后，将溶液体系转至冰浴条件下搅拌10min，依次加入15mL乙腈、5mL二乙胺（DEA）和半胱氨酸（1.5g，12.5mmol），转至室温继续搅拌脱除3h。

重复步骤1的脱Fmoc保护方法，使用二乙胺/乙腈/半胱氨酸体系脱除Fmoc基团，并分别使用1M HCl水溶液和10% Na₂CO₃水溶液萃取洗涤得到脱保护产物的二氯甲烷有机相溶液。

裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去二氯甲烷及大部分三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚至析出白色沉淀，离心进行固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到线性依替巴肽粗肽Mpa(SH)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-CONH₂，产率79%。

步骤5：线性依替巴肽氧化环合制备依替巴肽

将步骤4的线性依替巴肽粗肽Mpa(SH)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-CONH₂，（1.0g，1.2mmol）溶解在DMSO/H₂O/乙腈（V _DMSO /V _H2O /V _ACN，0.05/0.8/0.15，1200mL）混合溶液中，滴加冰醋酸溶液调节pH至6.5，室温搅拌反应，HPLC监测环合过程，环合结束后停止反应，得到依替巴肽粗品混合液。

粗品混合液浓缩后经制备色谱柱纯化（色谱条件为流动相：乙腈/水0.1% TFA；C18柱；波长220nm，流速3mL/min）得到依替巴肽目标产物840mg，产率84%。

实施例3

称取Rink Amide酸4,4'-二苯基膦酰氧基二苯甲酯（11.4g，10mmol），溶于60mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌10min。依次向溶液体系中加入30mL乙腈、10mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（3.8g，25mmol），转至室温继续搅拌脱除3h。

在步骤1的NH₂-Rink-DPP标签的二氯甲烷有机相溶液中依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH（6.2g，10.5mmol）、EDCl（2.3g，12mmol）、HOBt（1.62g，12mmol），室温下继续搅拌反应1h，TLC监测反应终点。

反应结束后，将溶液体系转至冰浴条件下搅拌10min，依次加入30mL乙腈、10mL二乙胺（DEA）和巯基丁二酸（3.8g，25mmol），转至室温继续搅拌脱除3h。

向步骤3得到的NH₂-Rink-DPP标签装载和含有侧链保护基团的依替巴肽前体化合物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-CONH-Rink-DPP二氯甲烷有机相溶液中加入40mL由三氟乙酸/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇/三异丙基硅烷/水混合得到的裂解试剂（TFA/DODT/Tis/H₂O=91/2.3/2.3/4.4，v/v/v/v），室温下搅拌反应5h。

裂解反应结束后，室温下减压浓缩除去二氯甲烷及大部分三氟乙酸，浓缩液中加入20mL冷异丙醚至析出白色沉淀，离心进行固液分离得到白色固体，固体中继续加入冷异丙醚并辅助以超声重复沉淀4次，干燥后得到线性依替巴肽粗肽Mpa(SH)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-CONH₂，产率82%。

步骤5：线性依替巴肽氧化环合制备依替巴肽

将步骤4的线性依替巴肽粗肽Mpa(SH)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-CONH₂（2.0g，2.4mmol）溶解在DMSO/H₂O/乙腈（V _DMSO /V _H2O /V _ACN，0.05/0.8/0.15，1200mL）混合溶液中，滴加冰醋酸溶液调节pH至6.5，室温搅拌反应，HPLC监测环合过程，环合结束后停止反应，得到依替巴肽粗品混合液。

粗品混合液浓缩后经制备色谱柱纯化（色谱条件为流动相：乙腈/水0.1% TFA；C18柱；波长220nm，流速3mL/min）得到依替巴肽目标产物1.66mg，产率83%。

上述3个实施例中，实施例2相比于实施例1和实施例3，将Fmoc残基的巯基捕获试剂由巯基丁二酸替换为半胱氨酸，线性依替巴肽总体合成产率略微降低，这是由于巯基丁二酸包含两个羧酸基团，与脱除的Fmoc残基形成的复合物在10% Na₂CO₃洗涤时能够与碱性水溶液更好的结合，因此副产物能够被更好的洗涤萃取除去。半胱氨酸包含羧酸和氨基，虽然水溶性较好，但是10% Na₂CO₃洗涤效果与巯基丁二酸略有差别，因此会部分杂质残留，影响总体产率。但是半胱氨酸相比于巯基丁二酸价格低廉易得，因此实施例1和实施例3的经济性不如实施例2。

实施例3相比于实施例1，将原始物料的投料比增加一倍，线性依替巴肽总体产率略微降低，考虑可能是放大过程中原始物料和溶剂含水量、空气湿度造成的产率降低，均在有效范围内。

本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种依替巴肽的液相合成方法，是以下述结构通式（I）所示的Rink-NH₂酸二苯基膦酰氧基二苯甲酯（简称为NH₂-Rink-DPP）作为标签分子：

，

其中，取代基R选自H、OPOPh₂、卤原子或NO₂；

以含巯基化合物R'-SH作为Fmoc残基捕获试剂，

其中，取代基R'选自含有一个或多个-COOH侧链基团的烷基链；

按照下述步骤一锅法制备依替巴肽：

，

2.根据权利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是在所述含巯基化合物R'-SH的取代基R'的烷基链上除含有-COOH侧链基团外，还含有一个或多个-NH₂侧链基团。

3.根据权利要求2所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是所述的Fmoc残基捕获试剂是巯基丁二酸、巯基丁酸、半胱氨酸中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是所述的脱Fmoc试剂是二乙胺/乙腈混合液、哌啶/乙腈混合液、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯溶液中的一种或几种，在0～25℃条件下搅拌反应2～3h脱除Fmoc保护基团，并形成Fmoc-巯基羧酸加合物。

5.根据权利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是以EDCl/HOBt、HATU/DIEA、DIC/HOBt、PyBOP/DIEA、DCC/HOSU中的一种或几种为偶联试剂，0～40℃搅拌下进行酰胺偶联反应0.5～2h。

6.根据权利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是以三氟乙酸/3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇/三异丙基硅烷/水溶液组合物，三氟乙酸/三异丙基硅烷/水溶液组合物或三氟乙酸/1,2-乙二硫醇/水/苯甲醚溶液组合物作为酸性裂解试剂，对依替巴肽前体化合物裂解处理3～5h，脱除依替巴肽前体化合物上的Rink-DPP标签基团及侧链上的Trt、tBu、Boc保护基团。

7.根据权利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是将线性依替巴肽化合物用水/乙腈混合液溶解后，室温下暴露于空气中搅拌进行线性依替巴肽分子内二硫键的氧化环合。

8.根据权利要求7所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是所述线性依替巴肽化合物的氧化环合在存在氧化试剂的条件下进行，所述氧化试剂是DMSO、双氧水、I₂中的一种或几种。

9.根据权利要求7或8所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是采用醋酸或NH₄OH将水/乙腈混合液调至弱酸性或弱碱性，进行线性依替巴肽化合物的分子内二硫键的氧化环合。

10.根据权利要求1所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征是采用制备型色谱柱对氧化环合得到的依替巴肽目标产物进行纯化处理。