CN116836700A - 一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸修饰红光碳点HA‑R‑CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用。本发明以柠檬酸和尿素为原料，溶剂热法制备红光碳点R‑CDs，然后将与肺癌细胞表面高表达的CD44受体有特异性结合能力的透明质酸HA共价接枝于R‑CDs表面，构建了透明质酸修饰红光碳点HA‑R‑CDs。基于HA与肺癌细胞表面高表达的CD44受体之间的特异性亲和力，增强了荧光碳点与肺癌细胞结合率，易于通过胞吞内化作用主动摄入肺癌细胞，以此实现靶向荧光实时点亮癌细胞。本发明提供的透明质酸修饰红光碳点HA‑R‑CDs具有较好的pH稳定性和抗光漂白能力，最大荧光发射峰位于为630nm，其长波长发光特性降低了生物背景干扰，在肺癌细胞成像和术中导航定位癌细胞等医学领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于荧光纳米材料技术领域，具体涉及一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用。
背景技术
红光碳点(发射波长大于600nm)具有对生物组织损害小、深组织穿透能力和背景信号低等特点，而被广泛用于生物传感、荧光成像的材料设计当中。近年来，越来越多的具有长波长红光发射的碳点被制备出来。前驱体酸度环境是碳点红移的一个重要因素。但这种策略合成的碳点具有明显的嗜酸性，在碱性条件下，碳点表面的氨基去质子化导致荧光猝灭，并不适合在合成的碳点基础之上对其进一步的修饰。与水热法相比，采用溶剂热法制备红光碳点，不仅可以获得发光性质优异的长波长发射碳点，还可以避免水热法酸化红移碳点的嗜酸性特点。
肺癌是全世界发病率和死亡率高的恶性肿瘤之一，荧光成像导航技术可以为术中实时、精确地观察肿瘤及其周围健康组织提供切实可行的应对措施。通常，对荧光团修饰靶向分子可以促进细胞内吞。透明质酸(HA)，是一种分布于细胞外间质的天然高分子多糖，由重复的N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸两个亚基构成。HA因其具有生物相容性、可降解性、非免疫原性和高亲水性，参与着人体大多数的生理过程(包括细胞粘附、迁移和伤口愈合等)，并在其中发挥着重要作用。除此以外，HA与肺癌细胞表面高表达的CD44受体(细胞分化簇44受体)有很强的亲和力。基于HA和CD44受体的特殊相互作用，荧光碳纳米材料可以通过受体介导的内吞作用，被识别、结合并内化到肿瘤细胞，为靶向型荧光探针的构建用于细胞成像提供了良好的分子基础。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法，包括以下步骤：
1)柠檬酸和尿素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，置于聚四氟乙烯反应釜中加热反应，反应结束后，向得到的深棕色溶液中加入NaOH溶液，室温搅拌，离心得到沉淀，用超纯水对沉淀多次洗涤，收集上清液，通过冷冻干燥得到红光碳点粉末R-CDs；
2)将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到透明质酸水溶液中，室温下搅拌活化透明质酸的羧基，得到混合液；将R-CDs水溶液逐滴加入到上述混合液中，用NaOH溶液调节溶液pH，室温下搅拌进行酰胺化反应，经纯化、冷冻干燥后，得到透明质酸修饰红光碳点粉末HA-R-CDs。
进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，柠檬酸和尿素的质量比为0.5-2:1；加热反应是在150-180℃下进行4-8h。
进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，NaOH溶液的浓度为30-60mg/mL，体积为10-30mL。
进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，透明质酸水溶液的浓度为5-15mg/mL；活化的时间为6-16h。
进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:0.8-1.4。
进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，R-CDs水溶液的浓度为1-10mg/mL。
进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，pH范围为6-8。
进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，酰胺化反应的时间为12-36h。
进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，纯化的步骤为：将酰胺化反应完的溶液用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析6-24h，透析过程每隔4h更换一次超纯水。
上述任意一项所述的制备方法制备的透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs在肺癌细胞靶向成像中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法简单易行，无需复杂反应设备。
2、本发明所制备的透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs最佳激发波长位于560nm，最大发射波长位于630nm，其荧光稳定性强，克服了有机染料水溶性差、抗光漂白性差的缺点。
3、本发明所制备的长波长碳点细胞毒性低，可靶向标记A549人肺癌细胞，并在细胞内发射明亮的红色荧光，其长波长发光特性可有效降低生物背景的干扰，增强了细胞内的荧光信号，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为HA-R-CDs的合成路线图。
图2为R-CDs的透射电子显微镜图像(a)和粒径分布直方图(b)，其中，(a)中插图为高分辨率透射电子显微镜图像。
图3为HA-R-CDs的紫外吸收光谱(a)和荧光光谱图(b)。
图4为HA-R-CDs的荧光稳定性图(a)和在不同pH溶液中的荧光性能图(b)。
图5为R-CDs和HA-R-CDs的细胞毒性图。
图6为PBS(对照组)、R-CDs和HA-R-CDs分别与A549细胞共孵育的荧光成像图，其中，a,b,c分别为PBS(对照组)、R-CDs和HA-R-CDs的暗场成像图，d,e,f分别为PBS(对照组)、R-CDs和HA-R-CDs的明场成像图，g,h,i分别为PBS(对照组)、R-CDs和HA-R-CDs的明场与暗场的叠加成像图。
具体实施方式
实施例1透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法
本发明透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的合成路线如图1所示。
HA-R-CDs的制备方法如下：
1)将1g柠檬酸和2g尿素固体溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超声溶解，转移到30mL聚四氟乙烯反应釜中，加热至160℃，反应6h，待体系冷却至室温后，向反应得到的深棕色溶液中加入20mL NaOH溶液(50mg/mL)，室温搅拌，离心得到沉淀，用超纯水对沉淀多次洗涤，收集上清液，通过冷冻干燥得到深绿色粉末固体R-CDs；
2)称取50mg透明质酸(HA)加入到含有5mL超纯水的烧杯中，在磁力搅拌器上持续搅拌至溶解完全；精确称量239.7mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、143.7mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于2个5mL离心管中，分别向样品管中各加入1mL超纯水，超声至完全溶解，将EDC·HCl水溶液、NHS水溶液依次加入装有HA水溶液的烧杯中，室温下避光搅拌反应12h；随后，向上述反应体系中逐滴加入R-CDs溶液，用NaOH溶液调节pH至7，在磁力搅拌器上继续反应24h；最后，取出反应液，将其倒入透析袋(MWCO＝8000-14000Da)，在超纯水中透析12h(每隔4h更换一次超纯水)，得到纯化后的HA-R-CDs溶液，将其进行冷冻干燥处理，可得HA-R-CDs固体粉末。
实施例2R-CDs的形貌特征
通过透射电子显微镜证明了红光碳点R-CDs的成功合成，结果如图2(a)所示。我们可以观察到所制备的R-CDs具有良好的分散性且没有明显的聚集，插图为红光碳点R-CDs的高分辨率透射电子显微镜图像，显示R-CDs有明显的晶格条纹，晶格间距为0.21nm，呈一定的石墨化结构。通过对红光碳点颗粒进行统计，得到相应的粒径频率分布柱状图和高斯拟合曲线，结果如图2(b)所示，R-CDs的粒度分布在1.23nm到2.65nm范围内，计算得到平均粒径尺寸为1.92nm，粒径比较均一。
实施例3HA-R-CDs的荧光性质
HA-R-CDs的紫外可见吸收光谱在500nm有最大吸收，最佳激发波长在560nm，发射中心在630nm，在365nm紫外光照射下为明亮的红色荧光，如图3(a)所示。图3(b)为不同激发波长下HA-R-CDs的荧光光谱图，从图中可以看出，当激发波长从360nm增加到600nm，HA-R-CDs呈现单个发射中心，具有非激发依赖特性。
实施例4HA-R-CDs的荧光稳定性
从图4(a)中可知，HA-R-CDs在365nm紫外灯下照射60min后，荧光强度稍有降低，但60min时仍保持最初强度的80.4％，说明制备的HA-R-CDs具有较好的抗光漂白性，为实现靶向A549细胞成像提供了条件。此外，进一步测试了HA-R-CDs的在不同pH溶液中的荧光性能，如图4(b)所示，在pH为4-9范围内，HA-R-CDs均保持较好的荧光发射，随着pH的增大，HA-R-CDs的荧光强度略微增强。由于癌细胞pH环境呈现为弱酸性(pH在5.5-6)，所以制备的HA-R-CDs有望应用于生物成像领域。
实施例5R-CDs和HA-R-CDs的细胞毒性测试
采用MTT比色法评估R-CDs和HA-R-CDs对A549细胞的细胞毒性，如图5所示。将A549细胞与不同浓度(0-80μg/mL)的R-CDs和HA-R-CDs共孵育24h后，进行细胞毒性测定。结果表明，R-CDs和HA-R-CDs在一定的浓度范围(0-60μg/mL)内毒性较低，细胞的活性维持在80％以上，具有良好的生物相容性，具备作为荧光探针应用于生物成像研究的能力。
实施例6R-CDs和HA-R-CDs的细胞成像实验
以A549细胞为模型探究R-CDs、HA-R-CDs的荧光成像行为。首先将A549细胞接种到干净的细胞爬片中，置于5％ CO2、37℃的恒温培养箱中培养，至细胞贴壁生长至汇合度为60％左右，加入已配制好的R-CDs和HA-R-CDs溶液与细胞混合并共孵育40min，对照组设置为PBS与细胞共孵育，用PBS冲洗三次以除去游离的R-CDs和HA-R-CDs溶液；之后用多聚甲醛固定20min，用PBS冲洗，取出细胞爬片后用丙三醇封片；最后，采用正置荧光显微镜拍摄细胞成像图。在暗场下，我们观察到R-CDs和HA-R-CDs两组荧光强度的明显差异。通过观察明场以及叠加场的图像，我们发现荧光定位于A549细胞质内，虽然HA-R-CDs水溶液荧光强度低于R-CDs，但其在细胞质内呈现出比R-CDs更加明亮的红色荧光，这表明HA-R-CDs以CD44受体介导的方式，成功地内化于细胞内，这为有效、快速和准确的靶向癌细胞提供了新方法。
Claims (10)
1.一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)柠檬酸和尿素溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，置于聚四氟乙烯反应釜中加热反应，反应结束后，向得到的深棕色溶液中加入NaOH溶液，室温搅拌，离心得到沉淀，用超纯水对沉淀多次洗涤，收集上清液，通过冷冻干燥得到红光碳点粉末R-CDs；
2)将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到透明质酸水溶液中，室温下搅拌活化透明质酸的羧基，得到混合液；将R-CDs水溶液逐滴加入到上述混合液中，用NaOH溶液调节溶液pH，室温下搅拌进行酰胺化反应，经纯化、冷冻干燥后，得到透明质酸修饰红光碳点粉末HA-R-CDs。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，柠檬酸和尿素的质量比为0.5-2:1；加热反应是在150-180℃下进行4-8h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，NaOH溶液的浓度为30-60mg/mL，体积为10-30mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，透明质酸水溶液的浓度为5-15mg/mL；活化的时间为6-16h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:0.8-1.4。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，R-CDs水溶液的浓度为1-10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，pH范围为6-8。
8.根据权利要求1所述的其制备方法，其特征在于，步骤2)中，酰胺化反应的时间为12-36h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，纯化的步骤为：将酰胺化反应完的溶液用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析6-24h，透析过程每隔4h更换一次超纯水。
10.权利要求1-9中任意一项所述的制备方法制备的透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs在肺癌细胞靶向成像中的应用。
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