CN116814541A - 一种脐带间充质干细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种脐带间充质干细胞的制备方法，分别在脐带间充质干细胞的原代和传代培养过程中采用不同的培养基和操作办法，其中在原代中采用消化法，有效缩短脐带间充质干细胞的原代培养时间，提高培养效率，在传代中使用验证的接种密度以及更换培养液时间，提高脐带间充质干细胞的增殖活性。本发明的制备方法有助于短时间内就有细胞从组织边缘长出，提高了初始细胞数量，在常规原代细胞生长时间内能扩增出更多的原代细胞，提高细胞增殖率与数量；有助于缩短脐带间充质干细胞原代培养时间，使用克瑞斯普消化液，加快了脐带间充质干细胞自组织中爬出的速度，缩短了培养周期，降低了培养成本。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种脐带间充质干细胞的制备方法。
背景技术
间充质干细胞时一类起源于早期中胚层，并且能够自我更新和具有多向分化潜能的成体干细胞，其来源丰富，可从脐带、脂肪、骨髓、牙髓种分离提取。并表现出旁分泌、免疫调节等多种功能，间充质干细胞被认为是细胞治疗最具应用前景的种子细胞。间充质干细胞来源多样、易分离扩增培养、免疫原性低、更新和分化能力强、治疗范围广等。目前间充质干细胞疗法可以作为一种新兴疗法用于治疗骨/软骨疾病、肾病、糖尿病、神经系统疾病以及免疫性疾病等临床领域。
脐带中的干细胞含量较丰富，也最容易获得，脐带间充质干细胞来源于产妇产后的脐带组织，通常情况下是作为医疗废物丢弃的，从脐带组织中分离提取的干细胞不存在伦理道德争议，应用前景广阔。近年来，期待间充质干细胞的体外扩增是在补充有胎牛血清或补充有人的自体血清的培养基中进行。然而，牛血清、人血清或者其他动物血清可能含有血液传播的病原体，牛血清还会激发抗异性生物质蛋白抗体的产生，异型生物质蛋白可激发受体患者的免疫应答，另外，牛血清还会显示出批次间差异，导致性能不一致。
现有的一些脐带间充质干细胞在培养过程中也有选择不添加血清的，但是培养效果不理想，存在细胞增殖速度慢、表达低和获得增殖的细胞数量有限等技术缺陷。因此，如何提高脐带间充质干细胞体外扩增活性是脐带间充质干细胞研究领域的重要问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞的制备方法，以解决上述背景技术中提出如何提高脐带间充质干细胞体外扩增活性是脐带间充质干细胞研究领域的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
S10：取人源脐带间充质干细胞合格脐带中剥离两根静脉与一根动脉，保留华通氏胶，将获得的华通氏胶剪碎后，使用pbs重悬组织后，500g，10分钟离心两次；
S20：弃掉上清废液后加入等体积的克瑞斯普脐带组织消化液，震荡消化1h，加入等体积pbs终止消化，再次使用pbs，500g，10分钟离心两次；
S30：加入脐带组织消化液，水解结缔组织中胶原蛋白成分，从溶组织梭状细胞芽孢杆菌中提取，使脐带组织消化完全，保护细胞不受影响与破坏，用于单细胞快速生长；
S40：将获得的消化组织均匀铺在TC处理的T75透气盖培养瓶中，置于温度37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养，待细胞融合度达到80-90%后用0.25%胰蛋白酶消化传代；
S50：将步骤（2）收集的脐带间充质干细胞用传代培养基重悬，按照175万个细胞/瓶，进行传代培养。
步骤S40中，在培养过程中第三天进行半量换液，保持培养瓶原始环境，也补充到营养物质，第五天进行全量换液、去除其他杂质，使其细胞能够更加快速的生长，后面平均2-3天更换培养基，在置于温度为37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养。
作为优选，步骤S40中，传代培养基中脐带间充质干细胞的密度为1-7×104个/ml。
作为优选，步骤S40中，传代培养过程中视细胞生长情况2-3天更换培养基，置于温度为37°、饱和湿度为5%的二氧化碳培养箱中培养。
作为优选，步骤S50中，所述传代培养的具体步骤为：
S51：取新鲜健康的脐带，取1cm长，经过盛有75%酒精的空白培养皿中冲洗一次，后转入到盛有0.9%氯化钠注射液培养皿中冲洗两次，洗掉残余血液与杂质。使用消毒后的镊子沿静脉将脐带撕开，暴露出静脉，动脉，将1根动脉与2根静脉撕去废弃，保留华通氏胶，将华通胶放入盛有0.9%氯化钠注射液中清洗两次，用剪刀剪成1mm³大小的组织块，离心500g，10分，倒掉上清，保留华通氏胶，加入等体积的PBS十倍稀释的克瑞斯普脐带组织消化酶，消化后的组织用友康干细胞完全培养基悬浮组织块，平均分到TC处理过的T75培养瓶中，使得培养瓶底平均分布组织块，总体积为12ml；
S52：将处理好的培养瓶放入温度为37°、饱和湿度为5%的二氧化碳培养箱中培养；
S53：于第3天进行半量换液，加入等体积的新鲜完全培养基，并观察组织铁壁状态；
S54：于第5天进行全量换液，重新加入12ml新鲜完全培养基；
S55：后期进行细胞观察，根据生长情况，适当进行换液，以保证细胞营养供给充足，待细胞融合度达到80%-90%时进行传代，加入胰蛋白酶进行消化传代，加入收集时的培养过的培养基进行消化终止；
S56：将步骤S55中消化获得的细胞进行洗涤，使用pbs将细胞离心，300g，6分钟，洗涤两次后，使用干细胞完全培养基重悬，并取样进行细胞流式检测，检测合格后接种到TC处理培养瓶中，每瓶接种数量为175万，加入完全培养基25ml，将种瓶细胞放入温度为37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养；
S57：待细胞融合度达到80-90%，重复步骤S56，在温度为37°、饱和湿度为5%二氧化碳培养箱中培养，直至传到p3代次，经检测p3代次的细胞活力，有效性与细胞干性最佳；
S58：将p3收获细胞经检测合格的细胞冻存，使用克瑞斯普无血清细胞冻存液，按照1×107cell/ml进行细胞冻存。
作为优选，步骤S55中胰蛋白酶的浓度为0.25%。
作为优选，步骤S56中TC处理培养瓶具体为T175。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本脐带间充质干细胞的制备方法分别在脐带间充质干细胞的原代和传代培养过程中采用不同的培养基和操作办法。其中在原代中采用消化法，有效缩短脐带间充质干细胞的原代培养时间，提高培养效率。在传代中使用验证的接种密度以及更换培养液时间，提高脐带间充质干细胞的增殖活性；此外还具备以下有益效果：
（1）采用本发明的培养方法有助于短时间内就有细胞从组织边缘长出，提高了初始细胞数量，在常规原代细胞生长时间内能扩增出更多的原代细胞，提高细胞增殖率与数量；
（2）采用本发明的培养方法有助于缩短脐带间充质干细胞原代培养时间，使用克瑞斯普消化液，加快了脐带间充质干细胞自组织中爬出的速度，缩短了培养周期，降低了培养成本；
（3）采用本发明的培养方法，有效提高脐带间充质干细胞的增殖活性，提高细胞体外扩增的效率。
实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）合格脐带中剥离两根静脉与一根动脉，将获得的华通氏胶剪碎后，使用pbs重悬组织后，500g，10分钟离心两次。
（2）弃掉上清废液后加入等体积的克瑞斯普脐带组织消化液，震荡消化1h，加入等体积pbs终止消化，使用pbs，500g，10分钟离心两次。
（3）将获得的消化组织均匀铺在TC处理的T75透气盖培养瓶中，置于37°，饱和湿度，5%二氧化碳培养箱中培养，待细胞融合度达到80-90%后用0.25%胰蛋白酶消化传代。
（4）将收集的脐带间充质干细胞用传代培养基重悬，按照7×104个/ml/瓶种瓶，进行传代培养。
实施例
一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）自脐带中剥离华通氏胶组织，用pbs清洗三遍后将华通氏胶组织剪至1-3mm3后平铺到培养瓶中;
(2)向步骤（1）的培养瓶中加入原代培养基，在置于37°，饱和湿度，5%二氧化碳培养箱中培养，过程中3天更换一次培养基，，待细胞融合度达到80-90%后用0.25%胰蛋白酶消化传代；
（3）将步骤（2）收集的脐带间充质干细胞用传代培养基重悬，接种到T175瓶中置于37°，饱和湿度，5%二氧化碳培养箱中培养，密度为5×104个/ml。传代培养过程中每2天换液。
对比例1提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，和实施例1对比的区别为：剥离静、动脉与脐带表皮，使用贴壁法，其余均和实施例1相同。
对比例2提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，和实施例1对比的区别为：使用消化法，使用友康脐带消化液，其余均和实施例1相同。
对比例3提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，和实施例1对比的区别为：剥离静、动脉与脐带表皮，使用贴壁法，降低传代接种密度，其余均和实施例1相同。
值得说明的是，本发明的脐带组织消化液具体采用克瑞斯普消化液。
分别统计实施例1采用脐带组织消化法，实施例2采用脐带组织贴壁法，从组织状态爬出脐带间充质干细胞所用时间，即显微镜观察细胞从组织边缘长出的时间，结果如下表所示：
由上表可以看出，实施例1的脐带间充质干细胞所需要的从组织边缘长出细胞时间较短，实施例2与对比例1-3调整了操作方法，细胞从组织边缘长出细胞时间较长，说明采用本发明的培养方法有助于短时间内就有细胞从组织边缘长出，提高了初始细胞数量，在常规原代细胞生长时间内能扩增出更多的原代细胞，提高细胞增殖率与数量。
分别统计实施例1和2，对比例1-3中脐带间充质干细胞原代培养过程中所用时间，即细胞融合度达到80-90%所用的培养时间，结果如下表所示：
由上表可以看出，实施例1中的脐带间充质干细胞所需的原代培养时间较短，实施例2与对比例1-3中调整了操作方法，细胞的原代培养时间变长，说明采用本发明的培养方法有助于缩短脐带间充质干细胞原代培养时间，使用克瑞斯普消化液，加快了脐带间充质干细胞自组织中爬出的速度，缩短了培养周期，降低了培养成本。
采用台盼蓝染色方法分别统计实施例1和2，对比例1-3中的脐带间充质干细胞在传代培养7天后，脐带间充质干细胞的增殖倍数，计算方式如下：增殖倍数=培养七天收集细胞数量/种瓶时的初始接种细胞数量,结果如下表所示：
由上表可以看出，实施例1中用于传代的脐带间充质干细胞的增殖能力最好，使用克瑞斯普消化液的消化法，更够提高增长率，在短时间内可培养得到大量的脐带间充质干细胞，对比例1-3中调整了培养过程中的操作方法及接种密度，增殖能力由所下降，说明采用本发明的培养方法，有效提高脐带间充质干细胞的增殖活性，提高细胞体外扩增的效率。
综上本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法，分别在脐带间充质干细胞的原代和传代培养过程中采用不同的培养基和操作办法。其中在原代中采用消化法，有效缩短脐带间充质干细胞的原代培养时间，提高培养效率。在传代中使用验证的接种密度以及更换培养液时间，提高脐带间充质干细胞的增殖活性；
（1）采用本发明的培养方法有助于短时间内就有细胞从组织边缘长出，提高了初始细胞数量，在常规原代细胞生长时间内能扩增出更多的原代细胞，提高细胞增殖率与数量；
（2）采用本发明的培养方法有助于缩短脐带间充质干细胞原代培养时间，使用克瑞斯普消化液，加快了脐带间充质干细胞自组织中爬出的速度，缩短了培养周期，降低了培养成本；
（3）采用本发明的培养方法，有效提高脐带间充质干细胞的增殖活性，提高细胞体外扩增的效率。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
S10：取人源脐带间充质干细胞合格脐带中剥离两根静脉与一根动脉，保留华通氏胶，将获得的华通氏胶剪碎后，使用pbs重悬组织后，500g，10分钟离心两次；
S20：弃掉上清废液后加入等体积的克瑞斯普脐带组织消化液，震荡消化1h，加入等体积pbs终止消化，再次使用pbs，500g，10分钟离心两次；
S30：加入脐带组织消化液，水解结缔组织中胶原蛋白成分，从溶组织梭状细胞芽孢杆菌中提取，使脐带组织消化完全，保护细胞不受影响与破坏，用于单细胞快速生长；
S40：将获得的消化组织均匀铺在TC处理的T75透气盖培养瓶中，置于温度37°、饱和湿度为5%的二氧化碳培养箱中培养，待细胞融合度达到80-90%后用0.25%胰蛋白酶消化传代；
S50：将步骤（2）收集的脐带间充质干细胞用传代培养基重悬，按照175万个细胞/瓶，进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S40中，在培养过程中第三天进行半量换液，保持培养瓶原始环境，也补充到营养物质，第五天进行全量换液、去除其他杂质，使其细胞能够更加快速的生长，后面平均2-3天更换培养基，在置于温度为37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S40中，传代培养基中脐带间充质干细胞的密度为1-7×104个/ml。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S40中，传代培养过程中视细胞生长情况2-3天更换培养基，置于温度为37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S50中，所述传代培养的具体步骤为：
S51：取新鲜健康的脐带，取1cm长，经过盛有75%酒精的空白培养皿中冲洗一次，后转入到盛有0.9%氯化钠注射液培养皿中冲洗两次，洗掉残余血液与杂质，使用消毒后的镊子沿静脉将脐带撕开，暴露出静脉，动脉，将1根动脉与2根静脉撕去废弃，保留华通氏胶，将华通胶放入盛有0.9%氯化钠注射液中清洗两次，用剪刀剪成1mm³大小的组织块，离心500g，10分，倒掉上清，保留华通氏胶，加入等体积的PBS十倍稀释的克瑞斯普脐带组织消化酶，消化后的组织用友康干细胞完全培养基悬浮组织块，平均分到TC处理过的T75培养瓶中，使得培养瓶底平均分布组织块，总体积为12ml；
S52：将处理好的培养瓶放入温度为37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养；
S53：于第3天进行半量换液，加入等体积的新鲜完全培养基，并观察组织铁壁状态；
S54：于第5天进行全量换液，重新加入12ml新鲜完全培养基；
S55：后期进行细胞观察，根据生长情况，适当进行换液，以保证细胞营养供给充足，待细胞融合度达到80%-90%时进行传代，加入胰蛋白酶进行消化传代，加入收集时的培养过的培养基进行消化终止；
S56：将步骤S55中消化获得的细胞进行洗涤，使用pbs将细胞离心，300g，6分钟，洗涤两次后，使用干细胞完全培养基重悬，并取样进行细胞流式检测，检测合格后接种到TC处理培养瓶中，每瓶接种数量为175万，加入完全培养基25ml，将种瓶细胞放入温度为37°、饱和湿度、5%的二氧化碳培养箱中培养；
S57：待细胞融合度达到80-90%，重复步骤S56，在温度为37°、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中培养，直至传到p3代次，经检测p3代次的细胞活力，有效性与细胞干性最佳；
S58：将p3收获细胞经检测合格的细胞冻存，使用克瑞斯普无血清细胞冻存液，按照1×107cell/ml进行细胞冻存。
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S55中胰蛋白酶的浓度为0.25%。
7.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S56中TC处理培养瓶具体为T175。
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