CN116806698A - 一种脱毒柑橘苗繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱毒柑橘苗繁育方法，步骤1：摘取成熟期柑橘果实，将其在无菌条件下取出其内的败育胚，即获得无菌败育胚；步骤2：将步骤1所得到的无菌败育胚接种在诱导培养基中，将接种了无菌败育胚的诱导培养基进行暗培养，以诱导无菌败育胚生长成白色子叶型胚状体；步骤3：将步骤2所获得的白色子叶型胚状体继代到生长培养基上，并在光照条件下进行诱导生芽培养，以诱导白色子叶型胚状体分化出丛芽；步骤4：将步骤3中白色子叶型胚状体分化出丛芽切下，且丛牙的底端修剪成楔形并嫁接在管培砧木上，将整株嫁接苗置于装有清水的试管中进行光培养，待砧木的茎秆部分转绿后移入栽培基质，本方法脱毒效率可达100％，且丛芽嫁接易于成活。
Description
技术领域
本发明属于果树无性繁育技术领域，尤其涉及一种脱毒柑橘苗繁育方法。
背景技术
柑橘的的繁殖方式有实生繁殖、嫁接繁殖、以及组织培养繁殖这几种。实生繁殖周期较长、投产晚，较少用于商品化品种生产，主要用于砧木的繁殖。嫁接繁殖周期较短，且可配套使用亲和力强、根系发达、抗性强的砧木，嫁接后使之发育成优良的苗木，有利于实现良种商品化大规模生产。但上述两种繁殖方式均无法产生脱毒植株。组织培养繁殖主要以是新兴的微繁殖技术，操作程序复杂、成本较高，是繁殖无病毒柑橘苗木接穗的主要技术之一。目前，柑橘生产上使用的脱毒方法主要有热处理法脱毒、茎尖组织培养脱毒、超低温脱毒以及茎尖微嫁接脱毒等。这些方法虽然都能生产柑橘无病毒苗木，但也都有一定的不足之处。热处理法需要控制较为精准的时间和温度，超低温脱毒对设备和材料的要求较高，茎尖组织培养和微嫁接成活率低且对部分病毒无效。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可基于柑橘果实中的败育胚来繁育脱毒柑橘苗的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种脱毒柑橘苗繁育方法，包括如下步骤：
步骤1：摘取成熟期柑橘果实，将摘取的柑橘果实在无菌条件下取出其内的败育胚，并用无菌水洗去败育胚上的残留物，即获得无菌败育胚；
步骤2：将步骤1所得到的无菌败育胚接种在诱导培养基中，将接种了无菌败育胚的诱导培养基进行暗培养，以诱导无菌败育胚生长成白色子叶型胚状体；
步骤3：将步骤2所获得的白色子叶型胚状体继代到生长培养基上，并在光照条件下进行诱导生芽培养，以诱导所述白色子叶型胚状体分化出丛芽；
步骤4：将步骤3中白色子叶型胚状体分化出丛芽切下，且所述丛芽的底端修剪成楔形并嫁接在管培砧木上，将砧木根部的培养基洗净，并将整株嫁接苗置于装有清水的试管中进行光培养，待砧木的茎秆部分转绿后移入栽培基质，栽培至少一个月后即可获得脱毒柑橘苗木。
上述技术方案中所述步骤1中败育胚从柑橘果实中取出的具体操作是：
柑橘果实消毒：将当天摘取的柑橘果实在自来水下洗净，然后在无菌条件下，将洗净后柑橘果实先用酒精浸泡，再用无菌水洗净，随后在酒精灯上晃烤3-5mi n以对柑橘果实的外皮进行消毒；
取败育胚：将外皮消毒后的柑橘果实的果肉剥开，于果肉囊衣内紧靠中柱处取出败育胚即完成从柑橘果实中取出败育胚。
上述技术方案中所述步骤2中柑橘果实消毒的具体操作是：将柑橘果实在自来水下冲洗5-10mi n(可以是冲洗5mi n、6mi n、7mi n、8mi n、9mi n或10mi n)，在超净工作台的无菌条件下，先用浓度为70-80vo l％酒精浸泡10-20mi n(可以是75vo l％的酒精浸泡10-15mi n，也可以是采用70vo l％或80vo l％的酒精浸泡20mi n)，再用无菌水冲洗多次直至柑橘果实上无明显的酒精味，随后将柑橘果实置于酒精灯上晃烤3-5mi n(可以是3min、4mi n或5mi n)即可。
上述技术方案中所述步骤3中柑橘果实酒精消毒是的酒精浓度为75vo l％，酒精浸泡的时长是15mi n。
上述技术方案中所述步骤2中取败育胚的具体操作是：取两个垫有无菌滤纸的无菌培养皿，分别为第一无菌培养皿和第二无菌培养皿，所述第一无菌培养皿中加入无菌水以将其内的无菌滤纸浸润，将外皮消毒后的柑橘果实置于第二无菌培养皿中，采用消毒后的刀片和镊子将柑橘果实的果肉剥开，于果肉囊衣内紧靠中柱处取出败育胚置于第一无菌培养皿内，即完成从柑橘果实中取出败育胚。
上述技术方案中所述步骤2中暗箱培养的具体操作是将接种了败育胚的诱导培养基置于人工气候箱进行暗箱培养，培养温度为26±1℃(可以是25℃、26℃或27℃)，相对湿度65-75％(可以是65％、70％或75％)，培养时长为45-60d(具体因样本个体的实际情况而定)即可得到白色子叶型胚状体。
上述技术方案中所述步骤3中诱导生芽培养的具体操作是：将继代有白色子叶型胚状体的生长培养基上置于24-26℃(可以是24℃、25℃或26℃)、相对湿度65-75％(可以是65％、70％或75％)、光照强度2000-2500Lux(可以是2000Lux、2250Lux或2500Lux)、光照10-12h/d(可以是10h/d、11h/d或12h/d)的培养条件下进行诱导生芽培养，培养时长为45-60d(具体因样本个体的实际情况而定)后即可。
上述技术方案中所述步骤4中管培砧木是将枳壳种子置于装有培养基的试管中培育出的枳壳嫩苗。
上述技术方案中所述步骤4中光培养的时长是10-15天(可以是10d、11d、12d、13d、14d或15d)，所述嫁接苗在移载至栽培基质中先覆膜栽培30天，然后进行常规栽培管理。
本发明的有益效果在于：首先，由于柑橘果实中的败育胚基本不携带病毒，故采用败育胚繁育出来的植株基本能做到完全无毒；其次，败育胚取材方便，因为败育胚来源于柑橘果实，柑橘果实可长时间储存于4度冷库，实现周年随取随；其脱毒效率高且成活率高，通过病毒检测显示，本方法脱毒效率可达100％，且丛芽嫁接易于成活。
附图说明
图1为本发明实施例1中所述样品母本裂皮病的检测结果图；
图2为本发明实施例1中所述样品母本黄脉病的检测结果图；
图3为本发明实施例1中所述样品母本碎叶病的检测结果图；
图4为本发明实施例1中所述样品母本碎叶病的另一检测结果图；
图5为本发明实施例1中所述样品母本衰退病的检测结果图；
图6为本发明实施例2中所述样本败育胚所繁育的嫁接苗裂皮病的检测结果图；
图7为本发明实施例2中所述样本败育胚所繁育的嫁接苗黄脉病的检测结果图；
图8为本发明实施例2中所述样本败育胚所繁育的嫁接苗的碎叶病的检测结果图；
图9为本发明实施例2中所述样本败育胚所繁育的嫁接苗的衰退病的检测结果图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中柑橘母本均是材料均取自秭归县归州镇向家店村的伦晚脐橙果园中，母本品种分别为棕橙和伦晚两个品种，其中棕橙品种用“Z”表示，而伦晚品种用“L”表示。
本发明中裂皮病和碎叶病的检测方法参考江西省地方标准《柑橘裂皮病和柑橘碎叶病RT-PCR检测技术规程》DB36/T 1744-2023I CS 65.020.01碎叶病检测方法参考江西省地方标准柑橘裂皮病和柑橘碎叶病RT-PCR检测技术规程DB36/T 1744-2023I CS65.020.01。
本发明中黄脉病检的测方法参考文献(周彦,陈洪明,王雪峰,李中安,王亮,周常勇.柑橘黄化脉明病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用[J].植物保护学报,2016,43(02):255-259.)中所记载的方法，而样品叶片中的RNA提取是采用下述试剂盒及参照其说明书提供的操作方法完成(南京诺唯赞公司生产的一步法高效RT-PCR试剂盒，产品货号：P611-01)。
本发明中衰退病检测方法参考文献资料(Sambade A,López C,Rubio L,FloresR,Guerri J,Moreno P.Polymorphism of a specific region in gene p23 of Citrustristeza virus allows discrimination between mild and severe isolates.ArchVirol.2003Dec；148(12):2325-40.doi:10.1007/s00705-003-0191-9.Epub 2003Sep16.PMID:14648289.)中所公开的检测方法。
本实施例试管枳壳苗内的培养基为MS培养基中额外加入蔗糖和琼脂[额外添加量分别为25g/L(蔗糖)和8g/L(琼脂)]。
本实施例中诱导培养基和继代培养基成分一致，均由MT培养基基盐(含维生素，其购自酷来搏科技有限公司，产品型号为PM1161)配制出基本培养基，然后额外添加蔗糖、琼脂和植物激素[基本培养基中的蔗糖添加量为40g/L,琼脂的添加量为8g/L,ME(麦芽浸粉)的添加量为500mg/L，GA3(事赤霉素)的添加量为1mg/L，SAD(硫酸腺嘌呤)的添加量为40mg/L]。
本发明中所采用的mark购自常州天地人和生物科技有限公司的DL5000 DNAMarker(产品型号为SDM201)。
实施例1(母本带毒检测)
其中，两个品种的柑橘母本各随机选取十棵果树进行病毒检测(母本分别为Z1、Z2、Z3、Z4……Z10；L1、L2、L3、L4……L10)，母本病毒检测主要是取母本的叶片进行检测，主要检测指标是对裂皮病(CEVd)、黄脉病(CYVCV)、碎叶病(CTLV)和衰退病(CTV)进行检测，其中，检测时分别设置，mark组(用“M”表示)、阴性对照组(用“CK-”表示)、阳性对照组(用“CK+”表示)以及水阴性对照(用“W”表示)。其检测结构分别如图1-图5所示，其中，图1表明20个母本样品中仅L8组未携带裂皮病病毒，而其余19组均携带；图2表明母本样品中仅Z1、Z3、Z6、Z7和Z9携带黄脉病；图3是对碎叶病进行检测的结果图，由于图3中阳性对照组无条带，从而增加新的阳性对照组样品与原阳性对照组一起再次以L7-L10四组样品进行重复实验，实验结果如图4所示(图4中CK1+为新的阳性对照组，CK2+为原阳性对照组)，由此可知，原阳性对照组失效，故在图3中阳性对照组未出现条带，而新的阳性对照组具有条带，同时L7-L10的重复结果一致，故可认定原阳性对照组的样品失效，而图3中的二十组母本样品的检测结果有效，即二十组母本样品中除了L7组未携带碎叶病病毒外，其余19组均携带碎叶病病毒；图5表明二十组母本样品中除了L8未携带衰退病病毒外，其余19组均携带衰退病病毒。
实施例2(败育胚繁育苗带毒检测)
分别取二十个母本(母本分别为Z1、Z2、Z3、Z4……Z10；L1、L2、L3、L4……L10)的成熟期柑橘果实(果实取自花期后210d),将每个母本的柑橘果实分别取败育胚并进行繁育获得移植苗(20个母本样品分别获得20棵移植苗)，对每个母本样品对应的移植苗取叶片进行如实施例1一致的病毒检测，检测结果如图6-图9所示，图6表面20个母本样品败育胚繁育出的移植苗均不携带裂皮病、碎叶病、黄脉病和衰退病病毒，其脱毒效果佳。
本实施例中败育胚繁育获得移植苗的具体方法是：
S1:取成熟期柑橘果实，将所取的柑橘果实当天用自来水下冲洗10mi n(去除柑橘果实外皮上的泥尘)，然后将洗净后的柑橘果实在超净工作台的无菌条件下，先用75vo l％酒精浸泡15mi n(浸泡时将柑橘果实会没入到酒精液面下)，然后取出柑橘果实再用无菌水冲洗干净(以冲洗后柑橘果实无明显的酒精味即可认为冲洗干净)，随后将果实置于酒精灯上晃烤4mi n(晃烤时利用消毒后的夹子将柑橘果实夹住进行烘烤，同时要确保柑橘果实外皮各处均能被烤到)以达到果实外皮彻底消毒无菌，而在无菌操作台上再取一垫有无菌滤纸的无菌培养皿，加入少量无菌水(无菌水的加入量以无菌滤纸恰好完全浸润为佳)备用，再另取一垫有无菌滤纸的无菌培养皿，将柑橘果实置于其内，用消毒后的刀片和镊子剥开果肉，于果肉囊衣内紧靠中柱处取出败育胚置于备用的无菌培养皿的湿润滤纸上，后用无菌水清洗3次，洗去败育胚上的果汁，即获得无菌败育胚；
S2:将S1所取的败育胚接种在诱导培养基上，并置于人工气候箱中进行暗培养，培养条件控制为温度26℃，相对湿度70％，培养至诱导出白色子叶型胚状体(诱导时长存在个体差异，通常为45-60d)；
S3:将S2在无菌条件下诱导成功的白色子叶型胚状体(直径为1.0-2.0cm)转移至继代培养基上，置于25℃、相对湿度70％、光照强度2300Lux、光照11h/d的培养条件下进行诱导生芽培养，培养至白色子叶型胚状体分化出丛芽(诱导培养时长存在个体差异，通常为45-60d)；
S4:将S3中获得的白色子叶型胚状体分化出的丛芽用刀片切割下，底端修剪成楔形，以试管枳壳苗(枳壳种子在装有培养基的试管中发芽所得为试管枳壳苗)为砧木，进行嫁接，嫁接口用封口膜绑紧，并将砧木根部培养基洗净后，将整株嫁接苗置于清水试管中进行光培养，待茎秆部分转绿(转绿时长存在个体差异，通常为10-15d)后移入栽培基质，覆膜栽培30天后常规栽培管理(常规栽培管理即定期除草、浇水、施肥等)。
基于实施例1和实施例2所得结果可知，实施例2中采用柑橘果实的败育胚以组培的方式获得丛芽，并以试管枳壳苗作为砧木形成嫁接苗的脱毒效果好，且其遗传性状与母本的遗传性状一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：摘取成熟期柑橘果实，将摘取的柑橘果实在无菌条件下取出其内的败育胚，并用无菌水洗去败育胚上的残留物，即获得无菌败育胚；
步骤2：将步骤1所得到的无菌败育胚接种在诱导培养基中，将接种了无菌败育胚的诱导培养基进行暗培养，以诱导无菌败育胚生长成白色子叶型胚状体；
步骤3：将步骤2所获得的白色子叶型胚状体继代到生长培养基上，并在光照条件下进行诱导生芽培养，以诱导所述白色子叶型胚状体分化出丛芽；
步骤4：将步骤3中白色子叶型胚状体分化出丛芽切下，且所述丛芽的底端修剪成楔形并嫁接在管培砧木上，将砧木根部的培养基洗净，并将整株嫁接苗置于装有清水的试管中进行光培养，待砧木的茎秆部分转绿后移入栽培基质，栽培至少一个月后即可获得脱毒柑橘苗木。
2.根据权利要求1所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤1中败育胚从柑橘果实中取出的具体操作是：
柑橘果实消毒：将当天摘取的柑橘果实在自来水下洗净，然后在无菌条件下，将洗净后柑橘果实先用酒精浸泡，再用无菌水洗净，随后在酒精灯上晃烤3-5min以对柑橘果实的外皮进行消毒；
取败育胚：将外皮消毒后的柑橘果实的果肉剥开，于果肉囊衣内紧靠中柱处取出败育胚即完成从柑橘果实中取出败育胚。
3.根据权利要求2所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤2中柑橘果实消毒的具体操作是：将柑橘果实在自来水下冲洗5-10min，在超净工作台的无菌条件下，先用浓度为70-80vol％酒精浸泡10-20min，再用无菌水冲洗多次直至柑橘果实上无明显的酒精味，随后将柑橘果实置于酒精灯上晃烤3-5min即可。
4.根据权利要求3所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤3中柑橘果实酒精消毒是的酒精浓度为75vol％，酒精浸泡的时长是15min。
5.根据权利要求2所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤2中取败育胚的具体操作是：取两个垫有无菌滤纸的无菌培养皿，分别为第一无菌培养皿和第二无菌培养皿，所述第一无菌培养皿中加入无菌水以将其内的无菌滤纸浸润，将外皮消毒后的柑橘果实置于第二无菌培养皿中，采用消毒后的刀片和镊子将柑橘果实的果肉剥开，于果肉囊衣内紧靠中柱处取出败育胚置于第一无菌培养皿内，即完成从柑橘果实中取出败育胚。
6.根据权利要求1所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤2中暗箱培养的具体操作是将接种了败育胚的诱导培养基置于人工气候箱进行暗箱培养，培养温度为26±1℃，相对湿度65-75％，培养时长为45-60d即可得到白色子叶型胚状体。
7.根据权利要求1所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤3中诱导生芽培养的具体操作是：将继代有白色子叶型胚状体的生长培养基上置于24-26℃、相对湿度65-75％、光照强度2000-2500Lux、光照10-12h/d的培养条件下进行诱导生芽培养，培养时长为45-60d后即可。
8.根据权利要求1所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤4中管培砧木是将枳壳种子置于装有培养基的试管中培育出的枳壳嫩苗。
9.根据权利要求8所述脱毒柑橘苗繁育方法，其特征在于，所述步骤4中光培养的时长是10-15天，所述嫁接苗在移载至栽培基质中先覆膜栽培30天，然后进行常规栽培管理。
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2023
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