CN116804659A - 一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，涉及定量检测技术领域，检测方法包括：对待测血清进行前处理时加入内标物，制得待测液；对所述待测液进行HPLC色谱检测；通过内标法，建立标准工作曲线，根据所述待测液中的硫酸吲哚酚的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，计算待测液中硫酸吲哚酚的浓度含量。本申请仅采用两种蛋白质沉淀剂，即甲醇溶液和无水乙醇，对血清样本进行前处理，减少所用试剂的数量，检测血液样本前处理的成本，而且操作步骤简便、效率更高。另外，本申请采用的HPLC色谱检测的流动相仅为甲醇溶液和水溶液，相比于使用乙腈、PBS、三氟乙酸等多种试剂，检测成本大大降低，检测步骤少且简单，容错率更高。

Description

一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法

技术领域

本申请涉及定量检测技术领域，尤其是涉及一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法。

背景技术

慢性肾脏疾病是引发心血管疾病的重要危险因素，在慢性肾脏疾病患者中尿毒素，尤其是蛋白结合类尿毒素,不仅会加重慢性肾脏疾病,还会促进心血管疾病的发生、发展。其中，硫酸吲哚酚是一种重要的蛋白结合类尿毒素,肾功能衰竭时硫酸吲哚酚蓄积在肾脏中。所以测定人体血清中硫酸吲哚酚含量对于预测心血管疾病及慢性肾脏疾病肾功能减退，以及个体化用药具有重要的临床指导意义。

目前所用的检测人体血清中硫酸吲哚酚含量的方法为：将辛酸钠、乙腈、二氯甲烷分批次加入血液样本中进行蛋白质沉淀；将沉淀后的血液样本进行低温静置、离心、涡旋等操作后制得样本液，然后采用色谱法测定样本中硫酸吲哚酚的含量，其色谱条件中的流动相为含有PBS和三氟乙酸的乙腈。

上述方法中样本血清的前处理过程较为复杂，需要采用多种试剂处理血液样本，另外，流动相需要使用乙腈、PBS、三氟乙酸等多种昂贵试剂，导致硫酸吲哚酚的检测成本高、检测精度低。

发明内容

本申请提供一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其样本前处理过程较为简便，减少检测所用试剂，降低检测成本，同时能更准确的测定人体血清中硫酸吲哚酚含量，为临床个体化用药提供指导。

人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法包括：

对待测血清进行前处理时加入内标物，制得待测液；

对待测液进行HPLC色谱检测；

通过内标法，建立标准工作曲线，根据待测液中的硫酸吲哚酚的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，计算待测液中硫酸吲哚酚的浓度含量；

HPLC色谱检测条件包括：

柱温：22-28℃；

色谱柱：C18；

流动相：A相为甲醇溶液、B相为含有甲酸的水溶液；

流速：0.5-1.0mL/min，进样量：0.5-1.2μL；

检测器：荧光检测器，激发光波长：250-300nm，发射波长：360-400nm。

通过采用上述技术方案，其中，甲酸的浓度为0.03-0.07％，优选为0.05％，甲酸主要起到离子抑制作用，以改善峰型,有助于得到良好、准确的硫酸吲哚酚和内标物的色谱峰。在检测硫酸吲哚酚含量时，HPLC色谱检测的流动相仅使用甲醇溶液和水，有效降低检测成本。而且检测方法更简便、快速、灵敏、准确,能够准确测定人血清中硫酸吲哚酚含量。

进一步的，HPLC色谱检测的洗脱程序为：

0min时，A相的体积为35％，B相的体积为65％；

0-3.8min，A相的体积由35％变为65％，B相的体积由65％变为35％；

3.8-3.9min，A相的体积由65％变为95％，B相的体积由35％变为5％；

3.9-6.0min，A相的体积保持在95％，B相的体积保持在5％；

6.0-6.1min，A相的体积由95％变为35％，B相的体积由5％变为65％；

6.1-8.0min，A相的体积保持在35％，B相的体积保持在65％。

进一步的，内标物选自吲哚-3-甲酸、甲氧基苯甲酸和4-氰基吡啶中的一种。

优选的，内标物为吲哚-3-甲酸。

进一步的，对待测血清进行前处理的步骤包括：

取85-95μL血清，将5-15μL吲哚-3-甲酸溶液加入血清中，在血清中分批加入第一沉淀剂，混合后离心分离，制得悬浊液；

取150-250μL悬浊液中的上层液，加入第二沉淀剂，混合后离心分离，取上清液制得待测液。

进一步的，第一沉淀剂为甲醇溶液或苯酚，第二沉淀剂为无水乙醇或丙酮。

优选的，第一沉淀剂为甲醇溶液，第二沉淀剂为无水乙醇。

通过采用上述技术，在前处理血液样本时，仅采用两种蛋白质沉淀剂进行沉淀处理，减少所用试剂种类和数量，有效降低检测成本，提高检测的经济适用性。且蛋白质沉淀剂为甲醇溶液和无水乙醇，成分简单，因此血清前处理的操作步骤简单，反应条件简单，常温常压下既能完成，提高容错率。

进一步的，离心分离的转速均为10000-13000r/min；

加入第一沉淀剂后的离心分离时间为5-15min，加入第二沉淀剂后的离心分离时间为3-7min。

进一步的，在血清中再分批加入第一沉淀剂的步骤包括：

第一沉淀剂为甲醇溶液；

取85-95μL血清，将5-15μL吲哚-3-甲酸溶液和5-15μL甲醇溶液加入血清中混合，制得预制液；

再将150-250μL甲醇溶液加入预制液中，混合后离心分离，制得悬浊液。

进一步的，甲醇溶液的浓度为45-55％。

综上，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1.本申请仅采用两种蛋白质沉淀剂，即甲醇溶液和无水乙醇，对血清样本进行前处理，减少所用试剂的数量，降低血液样本前处理的成本。另外，本申请采用的HPLC色谱检测的流动相仅为甲醇溶液和水溶液，相比于使用乙腈、PBS、三氟乙酸等多种试剂，检测成本大大降低，检测步骤少且简单，容错率更高；

2.本申请采用内标法检测人体血清中硫酸吲哚酚含量，通过建立标准工作曲线，再根据待测液中的硫酸吲哚酚的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，计算硫酸吲哚酚的浓度含量，检测结果更准确，专属性更强、灵敏度高。

附图说明

图1是本申请实施例中待测液(制备例1)HPLC色谱检测的色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下实施例中所用仪器和原料除特殊说明外均可来源于普通市售。

本申请提供一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法：发明人发现，现有技术对血清的前处理方法比较复杂且需要使用多种价格昂贵的试剂，而现有技术对血清前处理的方法包括：

用无肝素管采集血液标本，将其置于4℃的冰箱内，静置1h后离心(3000r/min,5min)分离血清，再将血清置于-20℃的环境下保存待测；

在检测分析前，取200μL血清于洁净试管中，加入250μL辛酸钠，混匀后静置5min；

再加乙腈500μL，涡旋混匀后离心(3000r/min,20min，4℃)，取5μL上清液；

将5μL上清液转移至洁净试管中，再加入1mL二氯甲烷，充分混匀后离心(3000r/min,10min，4℃)。

参考现有技术对血液的前处理方法能够看出，操作步骤繁多且麻烦，处理条件苛刻，还需要加入多种不同类型的试剂，这样的处理方法，一方面会导致制得的待测血清中可能混有干扰物，降低检测精度；另一方面需要精确把控每种试剂的添加量、添加浓度和反应条件，降低容错率，加大操作难度，因此能够发现，现有技术的方法适用性较差且成本高。

另外，现有技术中对待测血清进行HPLC色谱检测条件中，流动相：A相为8％乙腈、B相为92％磷酸缓冲盐溶液(含0.1％三氟乙酰，pH2.5)。参考现有技术的HPLC色谱条件，不仅需要多种试剂，且乙腈等试剂价格成本还很高，大大增加检测成本。

基于上述内容，发明人经过研究发现有两种仅对血清中的免疫蛋白具有极强针对性的蛋白质试剂，用其对血液样本进行前处理，能够将血液中大量的免疫蛋白去除，得到纯度更高的待测血清，并实现在血液样本前处理的步骤中大大降低检测成本的效果。而在检测方法中，发明人采用内标法，选择一种价格低廉、方便使用的内标物，就能完成整个硫酸吲哚酚含量的定量检测。而HPLC色谱检测中仅需要水和甲醇溶液即可精确检测，在保证待测血清具备高纯度、成本低廉的情况下，进一步提高检测精度和专属性。

上述内标法定义为：内标法是一种将一定重量的纯物质作为内标物加入一定量的被分析样品中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)，再通过机器可生成被测组分在样品中的百分含量。本申请的发明人综合考量价格、操作难度等条件，内标物选自吲哚-3-甲酸、甲氧基苯甲酸和4-氰基吡啶中的一种，优选的内标物为吲哚-3-甲酸，硫酸吲哚酚和吲哚-3-甲酸的分子式：

注：A为硫酸吲哚酚、B为吲哚3-甲酸

另外，上述两种蛋白质试剂为甲醇和无水乙醇，甲醇沉淀蛋白的原理是在适宜的pH值下，将甲醇加入样品中使得蛋白质变性沉淀，然后通过离心操作将蛋白分离出来，甲醇溶液对于水溶性蛋白质和低丰度蛋白质具有极好的提取效果；无水乙醇沉淀蛋白的原理是无水乙醇会破坏水溶性蛋白质的水化膜,从而使水溶性蛋白质在水中的溶解度下降。而人体血液含有的大量的免疫蛋白正属于水溶性蛋白，因此上述两种蛋白质沉淀剂对人体血液的免疫蛋白的针对性极强，两者在常温常压下就能实现蛋白质沉淀，操作简单、高效。

下面详细列出现有技术以及本发明所采用的试剂及其价格，通过价格对比，可初步判断降低成本的程度，价格如表1所示：

表1试剂种类及其价格

参考表1,能够得到，本发明的采用的试剂主要为甲醇溶液和无水乙醇，所用试剂种类少其价格低廉。而现有技术采用的试剂不仅种类多，且含有多种价格昂贵的试剂，可以得出本发明对检测成本有显著降低。至于甲酸，本发明的使用量极少，对成本的影响很低，甚至可以忽略不计。吲哚-3-甲酸溶液作为内标物，引入量需参考待测血清的质量，使用量也较少，因此能够得出本发明的技术方案在检测过程中不仅降低检测成本、提高适用性，而且制备出的待测血清相比于现有技术减少了多种试剂，减少干扰物的影响，使待测血清的纯度更高，显著提高检测精度。

制备例

制备1

制备待测液：

1、取90μL血清，将10μL吲哚-3-甲酸溶液和10μL浓度为50％的甲醇溶液加入所述血清中，涡旋混合1min，制得预制液；

2、在所述预制液中加入200uL浓度为50％的甲醇溶液；涡旋混合5min后离心分离，制得悬浊液，离心转速为12000r/min，离心分离的时间为10min；

3、取200uL悬浊液中的上层液，在上层液中加入200uL无水乙醇，涡旋混合3min后，离心分离5min，离心分离的转速为12000r/min，取5uL上清液制成待测液。

制备例2

选用硫酸吲哚酚的标准品，制成浓度为1mg/mL的硫酸吲哚酚母液，再取部分硫酸吲哚酚母液，将其稀释成系列浓度的硫酸吲哚酚工作液。

制备例3

选用吲哚-3-甲酸标准品，制成浓度为2000mg/L的内标母液。

检测及数据分析

检测一

检测待测液(制备例1制备的待测液)中硫酸吲哚酚含量，检测方法为：

1、取5uL待测液，采用岛津高效液相色谱仪LC-20A进行HPLC色谱检测，得到硫酸吲哚酚和吲哚-3-甲酸的色谱图；

2、再采用内标法，根据HPLC色谱图中显示的硫酸吲哚酚的峰面积和吲哚-3-甲酸的色谱峰面积建立标准曲线，由于色谱检测仪连接有计算机，计算机根据标准曲线直接计算出待测液中硫酸吲哚酚色谱峰面积和吲哚-3-甲酸的色谱峰面积的比值，该比值即为待测液中硫酸吲哚酚的浓度含量。

上述HPLC色谱检测条件包括：

柱温：25℃；

色谱柱：C18(3.5μm，4.6mm×100mm)；

流动相：A相为甲醇溶液、B相为水(含有0.005％甲酸)；

流速：0.5-1.0mL/min，进样量：1μL；

洗针液：35％甲醇；

检测器：荧光检测器，激发光波长：280nm，发射波长：390nm。

梯度洗脱程序如表2所示：

表2.梯度洗脱程序

检测结果及分析

待测液HPLC的色谱图中有两组检测峰，分别是硫酸吲哚酚和吲哚-3-甲酸，参考图1。

根据图1能够准确得到硫酸吲哚酚和吲哚-3-甲酸的色谱峰值，两者之间有明显的差距，再由计算机计算得出两者的色谱峰峰面积比值，计算机根据标准曲线自动计算出硫酸吲哚酚的含量。可以发现，该检测方法简单，检测结果容易得到，而且结果精确，为临床个体化用药提供精确指导。

检测二

检测并考察制备例二中制备的硫酸吲哚酚母液、硫酸吲哚酚工作液和吲哚-3-甲酸母液的稳定性，检测的目的在于：储存性能也就是指稳定性，它是进行检测方法的方法学验证的一项指标。

其意义在于：(1)确保分析结果的准确性：稳定性考察可以帮助检测实验条件下的色谱峰的变化情况，特别是对于HPLC色谱法中使用的柱和检测器等设备，能够排除由于装置问题或其他人为因素而导致的分析数据失真的可能；(2)评价方法的可靠性和精密度：通过对HPLC色谱法中各个组分的检测结果进行反复测定，并对数据进行统计分析，可以评估分析方法的可靠性和精密度，从而提高质量控制体系和操作规范，确保实验结果的科学性和可信度；(3)确定方法的适用范围：稳定性考察有助于减少花费的时间和金钱，在不同的实验条件下检查所使用的仪器设备是否满足质量检测要求，确定该方法的适用范围，并避免将不适合某些条件的方法误用。因此在进行HPLC色谱法检测前对稳定性先进行考察，对于提高检测方法的可靠性、精密度和准确性十分重要，确保实验结果的科学性和可信度。

具体的，本发明进行了10组稳定性检测试验，每一组的具体检测方法及数据如下：第1组：取制备例2制备的硫酸吲哚酚母液(1mg/mL)，分装为三份，分别为样品1、样品2和样品3，将三份硫酸吲哚酚母液(1mg/mL)置于-80℃的环境下保存，分别在硫酸吲哚酚母液(1mg/mL)制备后的第0小时、第1天、第2天、第3天、第1周、第1个月、第1.5个月、第2个月、第3个月测定硫酸吲哚酚的峰面积，因硫酸吲哚酚母液浓度太高无法直接进样，故取5μL硫酸吲哚酚母液用浓度为50％的甲醇定容至2mL后进样分析，考察硫酸吲哚酚母液放置3个月内的不同时间点的稳定性。

第1组检测数据及分析：硫酸吲哚酚母液的稳定性参数如表3所示：

表3.硫酸吲哚酚母液稳定性参数

结论：硫酸吲哚酚母液的峰面积无明显变化，并且峰面积的RSD值小于15％，表明硫酸吲哚酚母液在-80℃的环境下保存3个月后的稳定性仍保持良好。

第2组：取制备例3制备的内标母液(2000mg/L)，分装成三份，分别为样品1、样品2和样品3，将三份内标母液(2000mg/L)置于-80℃的环境下保存，分别在内标母液(2000mg/L)制备后的第0小时、第1天、第2天、第3天、第1周、第1个月、第1.5个月、第2个月、第3个月测定内标物(吲哚-3-甲酸)的峰面积，因内标溶液浓度太高无法直接进样，故取5μL内标溶液用浓度为50％的甲醇定容至250μL后进样分析，考察内标母液储存3个月内的稳定性。

第2组检测数据及分析：内标母液的稳定性参数如表4所示：

表4.内标母液稳定性参数

结论：内标峰面积无明显变化并且峰面积的RSD值小于5％，表明内标溶液母液在-80℃的环境下保存3个月后的稳定性仍保持良好。

第3组：(1)取正常人的血清，平行分成6份样品，按照检测一种记录的检测方法测定6份样品中的硫酸吲哚酚含量，对6份样品连续测定4天，对测定结果进行计算。其中，计算方法为：先计算所有样品4天内测量的硫酸吲哚酚含量的均值，在均值放入基础上加、减3倍的SD值得到一个标准范围，去除超过此标准范围的硫酸吲哚酚含量的数据，再计算剩下的每份样品的硫酸吲哚酚含量的4天的均值，再均值的基础上加、减2倍的SD值得到一个范围值，以此作为基质(正常人血清)质控的范围。

(2)再取制备例2中制备的硫酸吲哚酚工作液(250mg/L)，将其置于-80℃的环境下保存，分别在制备后的第0小时、第1天、第2天、第3天、第1周、第1个月、第1.5个月、第2个月、第3个月按照标准曲线配制方法进行进样分析(内标溶液为现配现用)，随行测定3份正常人血清，通过判断正常人血清中硫酸吲哚酚含量是否在正常人血清基质质控范围来判断硫酸吲哚酚工作液的稳定性。

第3组检测数据及分析：正常人血清基质质控范围和酸吲哚酚工作液的稳定性参数，如表5、表6所示：

表5.正常人血清基质(硫酸吲哚酚)质控范围

结论：最终确定正常人血清基质(硫酸吲哚酚)质控范围为0.35-0.55mg/L。

表6.硫酸吲哚酚工作液稳定性参数

结论：根据表5得出的质控范围为0.35-0.55mg/L，在观察表5中记载的随行质控范围，其均在表4得出的范围内，再进一步结合标准曲线和相关系数能够得到，硫酸吲哚酚工作液放置在-80℃的环境下保存3个月后的稳定性仍保持良好。

第4组：取肾病患者血清(该血清经赋值后的质控范围为7.82-9.18mg/L)，平行处理6份肾病患者血清，分别为样品1-6，分别在常温光照下放置0h、3h和5h后按照检测一记载的检测方法测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清)常温光照5h后的稳定性。

第4组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)常温光照5h的稳定性参数如表7所示：

表7.基质(肾脏病患者血清)5h的稳定性参数

结论：测定结果在质控范围内(7.82-9.18mg/L)，根据测定结果基质(肾脏病患者血清)常温光照5h后的稳定性仍保持良好。

第5组：取肾病患者血清，平行处理6份肾脏病患者血清，分别为样品1-6，分别在常温下放置0h、24h、48h和72h后按照检测一记载的方法测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清)常温放置72h后的稳定性。

第5组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)常温光照72h后的稳定性参数如表8所示：

表8.基质(肾脏病患者血清)72h稳定性参数

结论：测定结果在质控范围内(7.82-9.18mg/L)，因此基质(肾脏病患者血清)常温下放置72h后的稳定性仍保持良好。

第6组：取肾病患者血清，平行处理6份肾病患者血清，分别为样品1-6，分别在4℃的环境下放置0h、24h、48h、72h后按照检测一记载的方法测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清)在4℃的环境下放置72h后的稳定性；

第6组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)在4℃的环境下放置72h的稳定性参数如表9所示：

表9.基质(肾脏病患者血清)在4℃环境下放置72h的稳定性参数

结论：测定结果在质控范围内(7.82-9.18mg/L)，因此基质在4℃的环境下放置72h后的稳定性仍保持良好。

第7组：取肾病患者血清，平行操作6份肾病患者血清，分别为样品1-6，将样品1-6放置在-80℃冰箱中保存，分别在冻融1次、3次、5次、7次和10次后按照检测一记载的方法测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清)冻融10次后的稳定性；

第7组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)冻融10次的稳定性参数如表10所示：

表10.基质(肾脏病患者血清)冻融10次的稳定性参数

结论：测定结果在质控范围(7.82-9.18mg/L)内，表明基质冻融10次后仍然保持稳定。

第8组：取肾病患者血清，按照制备1制备待测液的方法制得样品1-6，将样品1-6放置常温下储存，分别在储存0h、24h、48h、72h后按照检测一的检测方法进样测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清)处置后常温放置72h的稳定性；

第8组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)处置后常温放置72h的稳定性参数如表11所示：

表11.基质(肾脏病患者血清)处置后常温放置72h的稳定性参数

结论：测定结果在质控范围(7.82-9.18mg/L)内，因此基质(肾脏病患者血清)处置后常温放置72h后的稳定性仍保持良好。

第9组：取肾病患者血清，按照制备1制备待测液的方法制得样品1-6，将样品1-6放置4℃的环境下储存，分别在储存0h、24h、48h、72h后按照检测一的检测方法进样测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清)处置后在4℃的环境中放置72h后的稳定性；第9组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)处置后在4℃的环境下放置72h后的稳定性参数如表12所示：

表12.基质(肾脏病患者血清)处置后4℃放置72h的稳定性参数

结论：测定结果在质控范围内(7.82-9.18mg/L)，因此基质(肾脏病患者血清)处置后在4℃的环境下放置72h后的稳定性仍保持良好。

第10组：取肾病患者血清，分装成6组，分别为样品1-6，将样品1-6置于-80℃的冰箱中保存，按照检测一记载的检测方法分别在保存第0小时、第1天、第2天、第3天、第1周、第1个月、第1.5个月、第2个月、第3个月测定硫酸吲哚酚含量，考察基质(肾病患者血清在)-80℃的环境下长期放置时的稳定性。

第10组检测数据及分析：基质(肾脏病患者血清)在-80℃的环境下长期放置的稳定性参数如表13所示：

表13.基质(肾脏病患者血清)-80℃长期放置的稳定性参数

结论：测定结果在质控范围(7.82-9.18mg/L)内，因此基质置于-80℃的环境下保存3个月后的仍然保持稳定性良好。

综上所述：从以上稳定性数据可以得出以下结论：硫酸吲哚酚母液在-80℃的环境下放置3个月后稳定性仍保持良好，吲哚-3-甲酸母液在-80℃的环境下放置3个月后稳定性仍保持良好，硫酸吲哚酚工作液在-80℃的环境下放置3个月后稳定性仍保持良好，基质(正常人血清以及肾病患者的血清)常温光照5h、常温放置72h、在4℃的环境下放置72h后稳定性仍保持良好，基质(正常人血清以及肾病患者的血清)放置在-80℃冰箱中保存，经过10次冻融后仍能保持良好的稳定性。

因此经过稳定性的验证后能够得出三种结论：(1)采用制备例一制备待测液、再用检测一的方法检测待测液中的硫酸吲哚酚含量，其硫酸吲哚酚含量的检测结果准确性高；(2)本申请的检测方法可靠性高、精密度高；(3)本申请的检测方法更适用于人体血清中硫酸吲哚酚浓度含量，专属性更强。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：检测方法包括：

对待测血清进行前处理时加入内标物，制得待测液；

对所述待测液进行HPLC色谱检测；

通过内标法，建立标准工作曲线，根据所述待测液中的硫酸吲哚酚的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，计算所述待测液中硫酸吲哚酚的浓度含量；

所述HPLC色谱检测条件包括：

柱温：22-28℃；

色谱柱：C18；

流动相：A相为甲醇溶液、B相为含有甲酸的水溶液；

流速：0.5-1.0mL/min，进样量：0.5-1.2μL；

检测器：荧光检测器，激发光波长：250-300nm，发射波长：360-400nm。

2.根据权利要求1所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于，所述HPLC色谱检测的洗脱程序为：

0min时，A相的体积为35%，B相的体积为65%；

0-3.8min，A相的体积由35%变为65%，B相的体积由65%变为35%；

8-3.9min，A相的体积由65%变为95%，B相的体积由35%变为5%；

9-6.0min，A相的体积稳定在95%，B相的体积稳定在5%；

0-6.1min，A相的体积由95%变为35%，B相的体积由5%变为65%；

1-8.0min，A相的体积稳定在35%，B相的体积稳定在65%。

3.根据权利要求1所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：所述内标物选自吲哚-3-甲酸、甲氧基苯甲酸和4-氰基吡啶中的一种。

4.根据权利要求3所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：所述内标物为吲哚-3-甲酸。

5.根据权利要求1所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于，对待测血清进行前处理的步骤包括：

取85-95μL血清，将5-15μL吲哚-3-甲酸溶液加入所述血清中，在所述血清中分批加入第一沉淀剂，混合后离心分离，制得悬浊液；

取150-250μL所述悬浊液中的上层液，加入第二沉淀剂，混合后离心分离，取上清液制得待测液。

6.根据权利要求5所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：所述第一沉淀剂为甲醇溶液或苯酚，所述第二沉淀剂为无水乙醇或丙酮。

7.根据权利要求5所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：所述离心分离的转速均为10000-13000r/min；

加入第一沉淀剂后的离心分离时间为5-15min，加入第二沉淀剂后的离心分离时间为3-7min。

8.根据权利要求6所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：在所述血清中分批加入第一沉淀剂的步骤包括：

所述第一沉淀剂为甲醇溶液；

取85-95μL血清，将5-15μL吲哚-3-甲酸溶液和5-15μL甲醇溶液加入所述血清中混合，制得预制液；

再将150-250μL甲醇溶液加入所述预制液中，混合后离心分离5-15min，制得所述悬浊液。

9.根据权利要求8所述的人体血清中硫酸吲哚酚含量的检测方法，其特征在于：所述甲醇溶液的浓度为45-55%。