CN116790717A - 一种高特异性通用探针检测系统和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高特异性通用探针检测系统和应用，属于生物医学领域。本发明所述的通用探针检测系统包括：针对核酸靶标设计的特异性介导探针、辅助靶标和通用探针。该系统不需要特殊设计的荧光发卡探针，使用最容易获得的Taqman发光探针作为通用探针便可以实现高效的核酸特异性检测。针对不同靶标，只需要设计和合成对应的无特殊标记的特异性介导探针和辅助靶标，而昂贵的发光探针具有通用性，因此检测成本较低，并且具有较高的灵敏度，10拷贝的DNA便可被成功检测到。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种高特异性通用探针检测系统和应用。
背景技术
核酸扩增是临床诊断领域不可缺少的检测工具，包括对基因型的区分和患者标本中病原体的准确定量。基于聚合酶链反应(PCR)的技术为微量初始目标序列的扩增提供了强有力的工具。该方法已经从基于凝胶分析的低通量的普通PCR，发展到基于荧光技术的实时定量PCR，以及使用数千个微反应器的数字PCR。现有的扩增技术通常采用非选择性的DNA染料或目标特异性荧光探针。DNA染料适合于低成本的核酸检测和定量，但在多重性和非特异性扩增方面受到限制。相比之下，荧光标记的靶向特异性寡核苷酸(如水解探针或分子信标)基于荧光基团和猝灭基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，并与目标序列直接相互作用，将目标特异性探针序列标记上不同的荧光基团，就能够在反应中高特异性地检测多个目标。但是荧光基团标记会增加分析成本，而且成本的增加与检测目标数量的增加成正比。因此，迫切需要一种高特异性且低成本的qPCR检测系统。
BerndFaltin等人报道了一种介导探针和荧光发卡探针的检测方法(mediatorprobePCR)。使用无化学修饰的序列特异性探针(介导探针)，每个探针包括一个目标特异性序列和一个和发卡探针互补特异性序列，在退火后被聚合酶的5’核酸酶活性裂解为介导引物。释放的介导引物通过与发卡探针的杂交并延伸，裂解或展开荧光发卡探针，最终释放荧光信号。但是这种特殊的发卡探针仍需专门设计和合成，并且中间化学修饰的费用高昂。此外，荧光发卡探针的灵活性也受到限制，根据现有文献记载，介导探针的酶切位点可以是和模板结合序列第一个和第二个核苷酸，这意味着释放的介导引物也具有模板特异性。也就是说，不同的检测模板产生不同的介导引物，这就极大降低了荧光发卡探针的通用型和灵活性。因此，如何提供一种不需要特殊设计的荧光发卡探针，使用通用的Taqman探针以实现低成本的核酸特异性检测的介导探针系统，是本领域亟待解决的技术问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高特异性通用探针检测系统，不需要特殊设计的荧光发卡探针，可以实现高效、通用、更低成本的核酸特异性检测。
本发明的目的还在于提供一种qPCR反应体系，具有优异的检测性能，10拷贝的DNA可以被成功检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种高特异性通用探针检测系统，包括针对核酸靶标设计的特异性介导探针、辅助靶标和通用探针；
所述特异性介导探针由5’端至3’端依次为：突出序列、互补序列和短序列；所述互补序列与靶标核酸互补；所述突出序列和短序列为人工改造序列，不与靶标核酸的任何序列互补；
所述辅助靶标由5’端至3’端依次为：通用探针互补配对序列、随机间隔序列和介导引物互补配对序列；所述介导引物由互补序列5’末端的1～2个碱基和突出序列组成。
优选的，所述特异性介导探针的互补序列为15～35个碱基，突出序列为5～25个碱基，短序列为3～4个碱基。
优选的，所述辅助靶标的介导引物互补配对序列为6-27个碱基，通用探针互补配对序列为15～30个碱基。
优选的，所述特异性介导探针的短序列替换为磷酸基团修饰、MGB修饰、invertedDNAnucleotide修饰或C3-spacer修饰，所述修饰位点为互补序列3’末端。
优选的，所述通用探针包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物中的一种或几种。
本发明还提供了上述通用探针检测系统在qPCR中的应用。
本发明还提供了一种qPCR反应体系，包括上述通用探针检测系统、模板、特异性引物和PCR反应原料。
优选的，所述通用探针检测系统为一组或多组。
优选的，所述反应体系中，特异性介导探针浓度为0.01～3μM、辅助靶标浓度为0.01～1μM、通用探针浓度为0.01～1μM、特异性引物浓度为0.03～1μM。
优选的，所述模板包括含有稀有突变或野生型基因的样本DNA、逆转录得到的cDNA、合成的质粒DNA、单链DNA。
本发明的有益效果：
本发明所述高特异性通用探针检测系统，不需要特殊设计的荧光发卡探针，可以实现高效、通用、更低成本的核酸特异性检测。并且具有优异的检测性能，PCR的线性出色，PCR效率高，灵敏度高，10拷贝的DNA便可以被成功检测到。
附图说明
图1：通用探针检测系统检测核酸的原理示意图；
图2：通用探针系统检测基因组ACTB序列的结果；
图3：通用探针系统检测基因组ACTB序列的检测性能；
图4：通用探针系统检测基因组EGFR序列的检测性能；
图5：使用相同的通用探针检测不同靶标；
图6：通用探针系统组成多重检测系统的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种高特异性通用探针检测系统，包括针对核酸靶标设计的特异性介导探针、辅助靶标和通用探针。本发明所述高特异性通用探针检测系统检测核酸的原理示意图见图1。
本发明所述特异性介导探针由5’端至3’端依次为：突出序列、互补序列和短序列；所述互补序列与靶标核酸互补；所述突出序列和短序列为人工改造序列，不与靶标核酸的任何序列互补；其中，突出序列为5～25个碱基，优选为15～22个碱基，是不与靶标核酸的任何序列互补的人工改造序列，在扩增反应中会被Taq聚合酶降解并释放到反应体系中，生成与辅助靶标结合的介导引物；互补序列为15～35个碱基，优选为20～30个碱基，需要针对靶标核酸设计；短序列为3～4个碱基，位于3’末端，阻止序列被延伸；在本发明中，所述短序列可被替换为磷酸基团修饰、MGB修饰、invertedDNA nucleotide修饰或C3-spacer修饰，所述修饰位点为互补序列3’末端。
本发明所述辅助靶标由5’端至3’端依次为：通用探针互补配对序列、随机间隔序列和介导引物互补配对序列；所述介导引物由互补序列5’末端的1～2个碱基和突出序列组成，是由Taq酶降解特异性介导探针得到的，除了完整的突出序列外，其3’端包含1个或2个互补序列的碱基。其中，介导引物互补配对序列是一段与介导引物互补配对的序列，为10～25个碱基，优选为15～22个碱基；通用探针互补配对序列是一段与通用探针互补配对的序列，为15～30个碱基，优选为20～30个碱基；随机序列为介导引物互补配对序列和通用探针互补配对序列中间包含的若干随机碱基组成的间隔序列，优选为2～6个碱基。更优选的，所述辅助靶标两端添加2～6个附加碱基，起到一定的稳定杂交和抑制可能的非特异性延伸的作用。
本发明所述通用探针是合成的单链DNA或是经过修饰的改变杂交亲和力的DNA，包括锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或DNA小沟结合物(MGB)中的一种或几种。所述通用探针的序列长度为15～30个碱基，两端或中间位置分别被发光基团和猝灭基团修饰，在Taq酶的作用下裂解，释放荧光信号，所述发光基团包括但不限于FAM，ROX，CY5，JOE，VIC，HEX，NED，TAMRA；淬灭基团包括但不限于BHQ1，BHQ2，BHQ3，TAMRA，MGB。荧光基团和猝灭基团修饰在通用探针的两端或某个基团修饰在5’端，另外基团修饰在探针中间的任意位置。
本发明还提供了上述通用探针检测系统在qPCR中的应用。
本发明还提供了一种qPCR反应体系，包括上述通用探针检测系统、模板、特异性引物和PCR反应原料。本发明所述通用探针检测系统可以为一组或多组，即在同一反应体系中使用单个或多个探针检测系统检测单一或多靶标。
在本发明所述qPCR反应体系中(一组或多组)，特异性介导探针浓度为0.01～3μM，优选为0.3～2.5μM，更优选为0.5～2μM；辅助靶标浓度为0.01～1μM，优选为0.02～0.9μM，更优选为0.03～0.5μM；通用探针浓度为0.01～1μM，优选为0.05～0.9μM，更优选为0.3～0.5μM；特异性引物浓度为0.03～1μM，优选为0.05～0.9μM，更优选为0.2～0.5μM。本发明所述模板浓度不做规定。
本发明所述反应体系中PCR反应原料包括热启动聚合酶，聚合酶buffer、dNTPs、MgCl2；PCR反应原料采用常规浓度即可；本发明所述反应体系还包括可以使qPCR进行的合适反应程序。
本发明所述模板包括含有稀有突变或野生型基因的样本DNA、逆转录得到的cDNA、合成的质粒DNA、单链DNA。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
采用通用探针检测系统检测ACTB靶标：
(1)基于ACTB靶标，上游引物、下游引物、特异性探针、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示，所述核苷酸序列从5’端至3’端具体如下：
SEQ ID NO.1：AGGCATCCTCACCCTGAAG；
SEQ ID NO.2：CATTGTAGAAGGTGTGGTGCC；
SEQ ID NO.3：GCATCGTCACCAACTGGGACG；
SEQ ID NO.4：GGACTATGTCCGGGAACACAAAGA；
SEQ ID NO.5：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)
SEQ ID NO.6：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列，两端的附加碱基起到一定的稳定杂交的作用)
(2)qPCR反应体系：
特异性探针组：反应体积为30μL，含有3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，上游、下游引物0.3μM，特异性荧光探针0.15μM，0.03U/μL热启动聚合酶；10ng/μL细胞系293T基因组DNA模板10μL。
通用探针组：反应体积为30μL，含有3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，上游、下游引物0.3μM，通用探针0.3μM，特异性介导探针0.5μM，辅助靶标0.03μM，0.03U/μL热启动聚合酶；10ng/μL细胞系293T基因组DNA模板10μL。
(3)进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸30s，50个循环。
(4)使用ABIQuantStudioTest系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图2所示。图A为探针检测系统检测核酸的原理，图B为通用探针组和特异性探针组检测基因组ACTB序列的对比。由图2可知，通用探针系统和特异性探针相似，都能够有效检测目标核酸。
实施例2
采用通用探针检测系统检测ACTB靶标：
(1)基于ACTB靶标，上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；
(2)qPCR反应体系：反应体积为30μL，含有3mMMgCl2，0.2mM dNTPs，上游、下游引物0.3μM，通用型荧光探针0.3μM，介导探针0.5μM，辅助靶标0.03μM，0.03U/μL热启动聚合酶，DNA模板10μL；模板DNA为配置的不同浓度293T细胞系基因组DNA，浓度分别为：10拷贝、102拷贝、103拷贝、3.3×103拷贝、104拷贝、105拷贝。不同浓度的模板在进行qPCR扩增时，各自独立成管。
(3)进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸30s，55个循环。
(4)使用ABIQuantStudioTest系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图3所示。图A为qPCR检测的灵敏度，图B为qPCR的线性结果。由图3可知，通用探针系统有着优异的检测性能。PCR的线性出色，PCR效率经计算为92％，灵敏度高，10拷贝的DNA可以被成功检测。
实施例3
采用通用探针检测系统检测EGFR靶标：
(1)基于EGFR靶标，上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.11所示；
SEQ ID NO.7：CCTGGCAGCCAGGAACGTACT；
SEQ ID NO.8：TTGCCTCCTTCTGCATGGT；
SEQ ID NO.9：TATTGCTTCCCCCATTCAGGACTTG；
SEQ ID NO.10：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)
SEQ ID NO.11：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列)
(2)反应体积为30μL，含有3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，上游下游引物0.3μM，通用探针0.3μM，特异性介导探针0.3μM，辅助靶标0.02μM，0.03U/μL热启动聚合酶，模板10μL。模板DNA为配置的不同浓度293T细胞系基因组DNA，浓度分别为：10拷贝、102拷贝、103拷贝、3.3×103拷贝、104拷贝、105拷贝。不同浓度的模板在进行qPCR扩增时，各自独立成管。
(3)进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸30s，55个循环。
(4)使用ABIQuantStudioTest系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图4所示。图A为qPCR检测的灵敏度，图B为qPCR的线性结果。由图4可知，通用探针系统有着优异的检测性能。PCR的线性出色，PCR效率为105％，灵敏度高，10拷贝的DNA可以被成功检测。
实施例4
使用相同的通用探针在不同反应中检测多个不同靶标：
(1)所有反应使用相同的通用探针，其序列如SEQ ID NO.4所示；所有特异性介导探针具有相同的突出序列(突出序列同实施例1～3中记载)；基于BRAF靶标，上游引物、下游引物、特异性介导探针、辅助靶标的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示；基于NRAS靶标，上游引物、下游引物、特异性介导探针、辅助靶标的核苷酸序列分别如SEQID NO.16～SEQ ID NO.19所示；基于PIK3CA靶标，上游引物、下游引物、特异性介导探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.22所示，辅助靶标的核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示；
SEQ ID NO.12：TTCTTCATGAAGACCTCACAG；
SEQ ID NO.13：CTGTTCAAACTGATGGGACC；
SEQ ID NO.14：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)
SEQ ID NO.15：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列)
SEQ ID NO.16：ACAGAAAACAAGTGGTTATAGA；
SEQ ID NO.17：ATGGCACTGTACTCTTCTT；
SEQ ID NO.18：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)
SEQ ID NO.19：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列)
SEQ ID NO.20：GGAATCCAGAGTGAGCTTTC；
SEQ ID NO.21：ATGAAACAAATGAATGATGCAC；
SEQ ID NO.22：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)
(2)反应体积为30μL，含有3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，上游下游引物0.3μM，通用探针0.2μM，特异性介导探针0.3μM，辅助靶标0.15μM，0.03U/μL热启动聚合酶，模板10μL。模板DNA为配置293T细胞系基因组DNA，浓度为：3.3×104拷贝。不同靶标进行qPCR扩增时，各自独立成管。
(3)进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸15s，72℃信号采集20s，50个循环。
(4)使用ABIQuantStudioTest系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图5所示。图A为反应示意图，多个靶标均使用相同通用探针、特异性介导探针的突出序列相同。图B为三个靶标的qPCR的扩增图。由图5可知，通用探针系统能够基于相同的探针检测多个不同的靶标，具有通用、经济的显著优势。
实施例5
使用不同的通用探针在一个反应中检测多个不同靶标：
(1)基于ACTB靶标，上游引物、下游引物、特异性介导探针、辅助靶标、通用探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.24，SEQ IDNO.9所示；基于HPV16靶标，上游引物、下游引物、特异性介导探针、辅助靶标、通用探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.29所示；基于HPV18靶标，上游引物、下游引物、特异性介导探针、辅助靶标、通用探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.30～SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.23：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)。
SEQ ID NO.24：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列)。
SEQ ID NO.25：AATGACAGCTCAGAGGAGGAG；
SEQ ID NO.26：GCACAACCGAAGCGTAGA；
SEQ ID NO.27：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)。
SEQ ID NO.28：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列)。
SEQ ID NO.29：CTGGCAGCCAGGAACGTACTGGT；
SEQ ID NO.30：AGGAACATTTTGTGAACAGGCA；
SEQ ID NO.31：ACATGCAACACTTGTGCATC；
SEQ ID NO.32：
(加粗为突出序列，下划线为靶标特异性互补序列，小写为3’端短序列)。
SEQ ID NO.33：
(下划线为通用探针互补序列，加粗为与介导引物互补的序列，小写为末端附加序列或间隔序列)
(2)反应体积为30μL，含有3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，0.4U/μL热启动聚合酶，ACTB上游下游引物0.3μM，特异性介导探针0.6μM，通用探针0.25μM；HPV16上游下游引物0.3μM，特异性介导探针0.4μM，通用探针0.2μM，辅助靶标0.15μM；HPV18上游下游引物0.3μM，特异性介导探针0.4μM，通用探针0.15μM，辅助靶标0.12μM，模板10μL。模板DNA为配置1500拷贝/μL或15拷贝/μL的HPV16和HPV18质粒DNA，背景模板使用3×103拷贝/μL的293T基因组DNA，进行qPCR扩增时，混合为一管多重反应。
(3)进行qPCR扩增，具体程序为：经95℃酶激活3min；再95℃变性10s，56℃退火延伸15s，72℃信号采集20s，50个循环。
(4)使用ABIQuantStudioTest系统进行qPCR扩增以及信号采集，结果如图6所示。图6A，B为高浓度和低浓度HPV16、HPV18的qPCR的扩增图。由图6可知，通用探针系统能够组成多重检测系统，提高检测效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高特异性通用探针检测系统，其特征在于，包括针对核酸靶标设计的特异性介导探针、辅助靶标和通用探针；
所述特异性介导探针由5’端至3’端依次为：突出序列、互补序列和短序列；所述互补序列与靶标核酸互补；所述突出序列和短序列为人工改造序列，不与靶标核酸的任何序列互补；
所述辅助靶标由5’端至3’端依次为：通用探针互补配对序列、随机间隔序列和介导引物互补配对序列；所述介导引物由互补序列5’末端的1～2个碱基和突出序列组成。
2.根据权利要求1所述的通用探针检测系统，其特征在于，所述特异性介导探针的互补序列为15～35个碱基，突出序列为5～25个碱基，短序列为3～4个碱基。
3.根据权利要求1所述的通用探针检测系统，其特征在于，所述辅助靶标的介导引物互补配对序列为6～27个碱基，通用探针互补配对序列为15～30个碱基。
4.根据权利要求1所述的通用探针检测系统，其特征在于，所述特异性介导探针的短序列替换为磷酸基团修饰、MGB修饰、inverted DNA nucleotide修饰或C3-spacer修饰，所述修饰位点为互补序列3’末端。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的通用探针检测系统，其特征在于，所述通用探针包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物中的一种或几种。
6.权利要求1～5任意一项所述的通用探针检测系统在qPCR中的应用。
7.一种qPCR反应体系，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述的通用探针检测系统、模板、特异性引物和PCR反应原料。
8.根据权利要求7所述的qPCR反应体系，其特征在于，所述通用探针检测系统为一组或多组。
9.根据权利要求7所述的qPCR反应体系，其特征在于，所述反应体系中，特异性介导探针浓度为0.01～3μM、辅助靶标浓度为0.01～1μM、通用探针浓度为0.01～1μM、特异性引物浓度为0.03～1μM。
10.根据权利要求7所述的qPCR反应体系，其特征在于，所述模板包括含有稀有突变或野生型基因的样本DNA、逆转录得到的cDNA、合成的质粒DNA、单链DNA。
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