CN116789770A - 一种抗生物膜肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗生物膜肽及其应用。抗生物膜肽P21，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中的抗生物膜肽P21具有分子量小、人工合成简单、具有抗耐药菌生物膜形成活性的优点，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗生物膜肽及其在抑制细菌生物膜中的应用。
背景技术
随着新抗生素短缺，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等多重耐药病原菌不断出现和扩散，给公共卫生和食品工业等领域带来严重影响，是目前全球面临的严峻问题。生物膜是细菌与其分泌的胞外多糖、蛋白质、eDNA等物质共同形成的复杂群落结构，作为天然屏障保护菌体在不利环境下生存，抵御药物和宿主免疫系统的攻击。生物膜内的持留菌对药物和宿主免疫的耐受性比浮游菌大大提高，也是引起人畜持续性感染、医疗器械和食品等污染的主要原因。同时，生物膜促进内部菌株间抗性基因的转移，导致更多耐药菌株的出现。因此，生物膜是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等病原菌在群体水平超强耐药的主要机制之一，迫切需要开发有效的生物膜防治策略。
发明内容：
本发明旨在提供一种抗生物膜肽P21及其在抑制细菌生物膜中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提出一种抗生物膜肽P21，所述抗生物膜肽P21有21个氨基酸残基组成，分子量2306.55Da，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Val-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Gly-Ile-Ala-Trp-Ala-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Val-Pro。
本发明进一步提出了上述抗生物膜肽P21的制备方法，其特征在于，根据SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
更近一步地，本发明提出了上述抗生物膜肽P21在抑制细菌药物中的应用。
优选，所述的细菌是金黄色葡萄球菌。
进一步优选，所述的细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明中的抗生物膜肽P21具有分子量小、人工合成简单、具有抗耐药菌生物膜形成活性的优点，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：抗生物膜肽P21的质谱检测结果。
图2：抗生物膜肽P21的抑制生物膜形成活性。
图3：抗生物膜肽P21与万古霉素协同抑菌作用。其中，CK为空白对照组；P21为P21处理组；Van为万古霉素处理组；Van+P21为P21与万古霉素协同处理组。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：抗生物膜肽P21的制备
所述抗生物膜肽有21个氨基酸残基组成，分子量2306.55Da，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：Val-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Gly-Ile-Ala-Trp-Ala-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Val-Pro，命名为抗生物膜肽P21。根据氨基酸序列，基于固相合成法利用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。利用高效液相色谱方法鉴定其纯度，利用液质联用仪测定其分子量，利用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列。
由图1可知，合成的多肽符合预测的分子量。
实施例2：抗生物膜肽P21的抗生物膜活性
在LB培养基中过夜培养的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300，按1:100比例用新鲜的M63培养基(3g/L KH2PO4，7g/L K2HPO4，2g/L(NH4)2SO4，1mM MgSO4，0.2％葡萄糖，0.5％酪氨酸，0.4％精氨酸)稀释。取稀释的菌液至96孔板中，每孔100uL，实验组中加入一系列不同浓度的P21(0.018mg/mL，0.037mg/mL，0.075mg/mL，0.15mg/mL，0.3mg/mL)，对照组不加P21，各组分别设置8个平行，在37℃培养箱中培养48h。
培养结束后，弃掉培养液及悬浮细胞，用无菌水轻柔地洗涤培养板两次，并控干水。每孔加入125μL浓度为0.1％的结晶紫染色液，室温静置10-15min。用无菌水轻柔地洗涤培养板3-4次，晾干。每孔加入125μL 30％的冰醋酸，室温静置10-15min。用分光光度计检测550nm吸光度，以30％的冰醋酸为空白对照。
结果如图2所示，在0.037-0.3mg/mL浓度下，P21可以抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300生物膜形成。
实施例3：抗生物膜肽P21与其他抗菌药物的协同抗菌活性
在LB培养基中过夜培养的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300按1％接种量接种到0.8mL新鲜的LB培养基中。P21处理组加入终浓度为0.2mg/mL的P21，万古霉素处理组加入终浓度为1.5mg/L的万古霉素，P21和万古霉素协同处理组同时加入终浓度为0.2mg/mL的P21和终浓度为1.5mg/L的万古霉素，对照组加入相应体积的LB培养基，各组分别设置三个平行，置于37℃恒温金属浴800rpm培养15h后测定OD600。
结果如图3所示，P21具有与万古霉素协同抑菌的作用。
Claims (5)
1.一种抗生物膜肽P21，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的抗生物膜肽P21的制备方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
3.权利要求1所述的抗生物膜肽P21在抑制细菌药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细菌是金黄色葡萄球菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
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