CN116789747A - 一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到降血脂寡肽，具体指涉及一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽及其治疗高脂血症的用途。本发明以紫菜为原料，通过脉冲超声法破碎细胞、复合酶解，膜超滤、色谱分离纯化得到降血脂寡肽Lys‑His‑Gln‑Pro‑Met‑Trp(KHQPMW)，ESI‑MS测定分子量为825.98Da。本发明制备的紫菜蛋白降血脂寡肽KHQPMW能显著减少游离脂肪酸(油酸：棕榈酸＝2:1)诱导的HepG2细胞模型内的脂质含量，显著降低HepG2细胞模型中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量，而且对HepG2细胞活力无显著影响，显示出良好的降血脂活性，可以用于制备治疗或预防高脂血症药物。
Description
技术领域
本发明涉及到降血脂寡肽，具体指涉及一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽及其治疗高脂血症的用途。
背景技术
高脂血症是指血液之中总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低，超出合理范围值，现代医学也称为血脂异常。高脂血症包括高胆固醇血症和高甘油三酯血症，以及混合性的高脂血症。高脂血症的临床表现主要是脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤和脂质在血管内皮沉积所引起的动脉硬化，对人体健康构成威胁。而且随着高热量食物食用逐渐增多和日常活动量相对减少的情况日益频繁，高脂血症患者日趋增多且呈现年青化趋势。高脂血症的药物治疗见效快，但降血脂药物具有一定毒副作用。因此，研发治疗高脂血症的多肽药物非常必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽，其可以用于开发治疗或预防高脂血症的药物。本发明以紫菜为原料，利用酶解工艺和色谱纯化技术制备降血脂肽，该降血脂肽安全、无毒副作用。
一方面，本发明提供一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽，其氨基酸序列为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)，ESI-MS测定其分子量为825.98Da。
另一方面，本发明提供了上述源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1)紫菜的预处理和蛋白提取：将紫菜洗净、除杂、晒干，用粉碎机粉碎，过40目筛，将紫菜粉加入到Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，利用脉冲超声法对紫菜细胞进行破壁处理，过滤、离心，除去固体杂质，100Da超滤膜脱盐，冻干，得紫菜蛋白粗取物；
2)紫菜蛋白的酶解：取上述紫菜蛋白粗取物，加入到Tris-盐酸缓冲液中，调温至35～40℃，调节pH值至7.2～7.5，加入胰蛋白酶，水解2～3h，于95℃、15min灭酶活；样品降温至53～58℃，调节pH值至8.5～9.0；加入碱性蛋白酶，反应2～3h，于95℃、15min灭酶，冷却至常温，离心，收集上清液，即得紫菜蛋白酶解液；
3)紫菜蛋白降血脂寡肽的制备：将紫菜蛋白酶解液经截留分子量为1.0kDa、3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分(MW<1kDa、1kDa<MW<3.5kDa、3.5kDa<MW<5.0kDa和MW>5.0kDa)，检测4个组分对游离脂肪酸(FFAs)建立的HepG2细胞模型中脂质含量的降低能力，选择降脂效果最佳超滤组分依次经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到紫菜蛋白降血脂寡肽。
作为优选，所述步骤1)中的紫菜为坛紫菜(Porphyra haitanensis)。
作为优选，所述步骤1)中Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度为0.2mol/L，PH值7.2；所述紫菜粉与Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的料液比为1g:18～20mL。
作为优选，所述步骤1)的脉冲超声法对紫菜细胞进行破壁处理的工艺参数为：对应一个脉冲的超声发出时间2s和间隙时间2s、超声处理时间90～100min、超声功率500～600W、料液温度20～25℃。
作为优选，所述步骤2)中Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.05mol/L，PH7.2；所述紫菜蛋白粗取物与Tris-盐酸缓冲液的料液比为1g:10～12mL(g/v)。
作为优选，所述步骤2)中胰蛋白酶的添加量为紫菜蛋白粗取物重量的1.5～2.0％。
作为优选，所述步骤2)中碱性蛋白酶的添加量为紫菜蛋白粗取物重量的1.0～1.5％。
作为优选，所述步骤3)的羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
羟丙基葡聚糖凝胶柱层析：将上述降脂效果最佳超滤组分溶于双蒸水配成浓度为60～75mg/mL的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(2.0×100cm)分离，用双蒸水进行洗脱，流速1.0～1.2mL/min，根据220nm下的凝胶层析色谱图，收集各色谱峰组分，测定各色谱峰组分降低HepG2细胞模型中脂质含量的能力，选择降低脂质含量能力最强的色谱峰组分，冻干，得紫菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物。
RP-HPLC纯化：将上述紫菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物用双蒸水配成50～60μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据制备多肽的降血脂活性获得1个具有高降血脂活性寡肽Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)，ESI-MS测定分子量为825.98Da。
作为进一步优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20μL；色谱柱Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(30:5:65)；洗脱速度0.8～1.2mL/min；紫外检测波长220nm。
再一方面，本发明提供上述紫菜蛋白的降血脂寡肽在制备治疗或预防高脂血症药物中的应用。
本发明紫菜蛋白降血脂寡肽Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)可显著降低HepG2细胞脂质堆积模型中的脂质含量，显著降低甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，且对HepG2细胞无毒副作用，显示良好的降脂活性；本发明Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可以用于制备治疗或预防高脂血症药物；本发明制备方法安全，制备工艺简单，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明的紫菜蛋白酶解液(ZCH)及其超滤组分(ZCH-1、ZCH-2、ZCH-3和ZCH-4)在3.0mg/mL浓度下对HepG2细胞脂质堆积模型中脂质含量的影响。
图2为本发明的紫菜蛋白酶解液超滤组分(ZCH-1)的羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)层析图。
图3为本发明的羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)制备酶解物组分(ZCH-1a、ZCH-1b和ZCH-1c)在3.0mg/mL浓度下对HepG2细胞脂质堆积模型中脂质含量的影响。
图4为本发明的羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)制备酶解物(ZCH-1b)的RP-HPLC分析图。
图5为本发明的RP-HPLC分离组分(ZCP1～ZCP10)在1.0mg/mL浓度下对HepG2细胞脂质堆积模型中脂质含量的影响。
图6为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)的质谱图。
图7为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)的结构。
图8为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)对HepG2细胞脂质堆积模型内甘油三酯(TG)含量的影响。
图9为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)对HepG2细胞脂质堆积模型内总胆固醇(TC)含量的影响。
图10为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)对HepG2细胞活力的影响。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细描述。
一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽，其制备工艺流程如下：紫菜→预处理→复合酶解→酶解物→超滤→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→降血脂寡肽→功能评价。
具体步骤为：
1)紫菜的预处理和蛋白提取：将坛紫菜洗净、除杂、晒干，用粉碎机粉碎，过40目筛，按照料液比1g:18mL将紫菜粉加入到Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2mol/L)中，调节PH值至7.2，利用脉冲超声法对紫菜细胞进行破壁处理90min(对应一个脉冲的超声发出时间2s和间隙时间2s、超声功率550W、料液温度23℃)，最后过滤、离心，除去固体杂质，100Da超滤膜脱盐，冻干，得紫菜蛋白粗取物(ZCP)。
2)紫菜蛋白的酶解：取上述紫菜蛋白粗取物(ZCP)，按照料液比1g:11mL(g/v)加入到Tris-盐酸缓冲液(0.05mol/L，PH7.2)，调温至37℃，调节pH值至7.2，加入紫菜蛋白粗取物重量1.6％的胰蛋白酶，水解2.5h，于95℃、15min灭酶活；样品降温至56℃时，调节pH值至9.0，加紫菜蛋白粗取物重量1.2％的碱性蛋白酶，反应2.5h，于95℃、15min灭酶，冷却至常温，9000rmp离心15min，收集上清液，即紫菜蛋白酶解液(ZCH)。
3)紫菜蛋白降血脂寡肽的制备：将紫菜蛋白酶解液(ZCH)经截留分子量为1.0kDa、3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分ZCH-1(MW<1kDa)、ZCH-2(1kDa<MW<3.5kDa)、ZCH-3(3.5kDa<MW<5.0kDa)和ZCH-4(MW>5.0kDa)，检测4个组分对HepG2细胞模型中脂质含量的降低能力(见图1)，选择降脂效果最佳超滤组分(ZCH-1)依次经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到紫菜蛋白降血脂寡肽。具体过程为：
①凝胶柱层析：将上述降脂效果最佳超滤组分(ZCH-1)溶于双蒸水配成浓度为70mg/mL的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(2.0×100cm)分离，用双蒸水进行洗脱，流速1.0mL/min，根据220nm下的色谱图(见图2)，收集各色谱峰组分(ZCH-1a、ZCH-1b和ZCH-1c)，测定各色谱峰组分对HepG2细胞模型中脂质含量的降低能力(见图3)，选择降低脂质含量效果最好的色谱峰组分ZCH-1b，冻干，得紫菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物(ZCH-1b)。
②RP-HPLC纯化：将上述紫菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物(ZCH-1b)用双蒸水配成50～60μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(进样量18μL；色谱柱Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(30:5:65)；洗脱速度1.1mL/min；紫外检测波长220nm)，根据220nm色谱图(见图4)，制备11个寡肽组分(ZCP1～ZCP10)；根据制备寡肽组分的降血脂能力(见图5)得1个高活性寡肽(ZCP9)。
③结构检测：收集降血脂活性最高的ZCP9，经RP-HPLC检测达到测序要求，ESI-MS测定分子量为825.98Da(见图6)。利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)(见图7)。
④功能评价：参照文献[程静,刘莹,刘垚杰,赵江,吉洋琳,刘东,王浩.鼠尾草酸通过激活AMPK降低游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪积累[J].食品科学,2020,41(11):171-178]，游离脂肪酸(FFAs)按照油酸：棕榈酸(浓度比2∶1))配比配制，使用1mmol/L的FFAs溶液处理HepG2细胞24h，建立高脂损伤细胞模型，评价紫菜蛋白降血脂寡肽Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)对该模型的降血脂效果，其中空白组是指HepG2细胞，模型组是指高脂损伤细胞模型；结果表明：在10.0μM浓度下，KHQPMW能显著减少细胞模型内的脂质含量，显著降低甘油三酯(TG)(见图8)和总胆固醇(TC)含量(见图9)。因此，Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)具有显著的降血脂活性，且对HepG2细胞的活力无显著影响(见图10)。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽，其特征在于所述寡肽的氨基酸序列为Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)，ESI-MS测定其分子量为825.98Da。
2.一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
1)紫菜的预处理和蛋白提取：将紫菜洗净、除杂、晒干，用粉碎机粉碎，过40目筛，将紫菜粉加入到Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，利用脉冲超声法对紫菜细胞进行破壁处理，过滤、离心，除去固体杂质，100Da超滤膜脱盐，冻干，得紫菜蛋白粗取物；
2)紫菜蛋白的酶解：取上述紫菜蛋白粗取物，加入到Tris-盐酸缓冲液中，调温至35～40℃，调节pH值至7.2～7.5，加入胰蛋白酶，水解2～3h，于95℃、15min灭酶活；样品降温至53～58℃，调节pH值至8.5～9.0；加入碱性蛋白酶，反应2～3h，于95℃、15min灭酶，冷却至常温，离心，收集上清液，即得紫菜蛋白酶解液；
3)紫菜蛋白降血脂寡肽的制备：将紫菜蛋白酶解液经截留分子量为1.0kDa、3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分(MW<1kDa、1kDa<MW<3.5kDa、3.5kDa<MW<5.0kDa和MW>5.0kDa)，检测4个组分对游离脂肪酸(FFAs)建立的HepG2细胞模型中脂质含量的降低能力，选择降脂效果最佳超滤组分依次经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到紫菜蛋白降血脂寡肽。
3.如权利要求2所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的紫菜为坛紫菜(Porphyra haitanensis)。
4.如权利要求2所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度为0.2mol/L，PH7.2；所述紫菜粉与Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的料液比为1g:18～20mL。
5.如权利要求2所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的脉冲超声法对紫菜细胞进行破壁处理的工艺参数为：对应一个脉冲的超声发出时间2s和间隙时间2s、超声处理时间90～100min、超声功率500～600W、料液温度20～25℃。
6.如权利要求2所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.05mol/L，PH7.2；所述紫菜蛋白粗取物与Tris-盐酸缓冲液的料液比为1g:10～12mL(g/v)。
7.如权利要求2所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中胰蛋白酶的添加量为紫菜蛋白粗取物重量的1.5～2.0％；所述步骤2)中碱性蛋白酶的添加量为紫菜蛋白粗取物重量的1.0～1.5％。
8.如权利要求2所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：
羟丙基葡聚糖凝胶柱层析：将上述降脂效果最佳超滤组分溶于双蒸水配成浓度为60～75mg/mL的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(2.0×100cm)分离，用双蒸水进行洗脱，流速1.0～1.2mL/min，根据220nm下的凝胶层析色谱图，收集各色谱峰组分，测定各色谱峰组分降低HepG2细胞模型中脂质含量的能力，选择降低脂质含量能力最强的色谱峰组分，冻干，得紫菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物。
RP-HPLC纯化：将上述紫菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物用双蒸水配成50～60μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据制备多肽的降血脂活性获得1个具有高降血脂活性寡肽Lys-His-Gln-Pro-Met-Trp(KHQPMW)，ESI-MS测定分子量为825.98Da。
9.如权利要求8所述的一种源于紫菜蛋白的降血脂寡肽的制备方法，其特征在于，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20μL；色谱柱Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(30:5:65)；洗脱速度0.8～1.2mL/min；紫外检测波长220nm。
10.如权利要求1所述的源于紫菜蛋白的降血脂寡肽在制备治疗或预防高脂血症药物中的应用。
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