CN116769784A

CN116769784A - 特异性识别庆大霉素的核酸适配体及其筛选方法与应用

Info

Publication number: CN116769784A
Application number: CN202310726791.5A
Authority: CN
Inventors: 王周平; 魏训娇; 马鹏飞
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2023-06-19
Filing date: 2023-06-19
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明涉及特异性识别庆大霉素的核酸适配体及其筛选方法与应用，属于食品安全生物技术领域。本发明具体的方法为：将一对茎结构序列引入到三段式文库的引物结合区域，以此设计的三段式文库作为筛选初始文库。利用流式细胞分选‑SELEX技术对庆大霉素进行筛选，经过三轮的反复筛选、亲和力和特异性试验的分析验证，获得能识别庆大霉素的核酸适配体且具有良好的亲和性和特异性。本发明筛选的核酸适配体在准确、快速、灵敏检测食品中庆大霉素方面具有广泛的应用前景。

Description

特异性识别庆大霉素的核酸适配体及其筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，尤其是指特异性识别庆大霉素的核酸适配体及其筛选方法与应用。

背景技术

庆大霉素是一种热稳定性强的光谱类抗生素，属于氨基糖苷类抗生素。其主要从放线菌科单孢子属发酵培养液中提取获得，可以对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性球菌引起的感染进行治疗。庆大霉素的抗菌原理是由于其具有大量带正电荷的氨基，可以结合在带负电的细胞膜上，在静电相互作用下渗透到细胞内部。当少量庆大霉素进入细胞后会破坏细胞膜的完整性，进而释放大量庆大霉素进入细胞。这会导致进入细胞的庆大霉素结合细菌核糖体30s亚基，从而干扰细菌中的蛋白质合成。庆大霉素因其易于获得、抗菌活性高而被广泛用于禽畜类疾病的治疗。抗生素的广泛使用也带来了其在奶牛体内残留并集聚的副作用。庆大霉素在奶牛养殖过程中在其体内聚集，并随着乳汁排出，造成奶源的污染。人长期食用被污染的奶源后会产生耐药性，严重的可能会导致耳毒性和肾毒性。

研究对庆大霉素的检测方法主要分为微生物法、理化分析法和免疫分析法三类。微生物法是最传统的检测方法，其存在检测周期长，操作繁琐的缺点。理化分析法有检测灵敏度高、重复性好、检测准确可靠的优势，但是其需要用到大型仪器，不能实现现场检测。免疫分析法特异性强，且检测时间短，但其方法建立难度大，识别分子抗体获取难度大。因此，需要一种能特异性结合庆大霉素的识别分子，以便于后续构建传感器实现食品中庆大霉素准确、快速、灵敏地检测，对于预防庆大霉素的传染、保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。

核酸适配体(Aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。核酸适配体类似于抗体，但是相比于抗体，核酸适配体具有体外合成周期短、耐高温、可重复利用和长期保存、价格低廉、易于合成和修饰等优点。这些独特优势使适配体在疾病治疗、药物开发、环境检测和食品安全检测等领域具有广阔的应用前景。流式细胞分选-SELEX(FACS-SELEX)可以针对每个粒子进行荧光识别与分析，并收集所需的高荧光强度磁珠。相比于其他分离方法，流式细胞分选使分离更加直观且不易出现达到饱和而导致分离不完全的现象。根据庆大霉素具有氨基官能团，可以将其固定在羧基磁珠上利用流式细胞进行高效分选。分离效率是影响适配体筛选效率的关键步骤。近年来，研究在关注分离步骤的效率的同时，也更多关注于文库复杂性对于适配体筛选效率的影响。核酸适配体的结构越复杂，它与靶标结合的亲和力就越高。研究认为对初始文库进行结构化设计可以增加复杂结构适配体出现的概率。

因此，基于结构化文库设计和分离技术相结合的适配体筛选已经成为当前的研究热点。如何获得一条与靶标高亲和性、高特异结合的适配体是现有技术亟需解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了特异性识别庆大霉素的寡合苷酸适配体及其筛选方法与应用。本发明利用结构化文库设计和流式细胞分选对庆大霉素适配体进行筛选。在文库设计方面，研究在三段式序列的引物结合区域插入一对茎结构序列。利用流式细胞分选仪收集高荧光强度的磁珠。最后用荧光偏振法对候选适配体进行亲和性和特异性测定。经筛选获得的能特异性识别庆大霉素的核酸适配体，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，将广泛应用于食品中庆大霉素的快速检测。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明第一个目的是提供特异性识别庆大霉素的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。

其中，SEQ ID No.1的序列如下所示：

agcagcacagaggactgctggatagggtttgaagctgactacgagagcggatctcacgcccagcagtgtg ctaccgtgaa。

SEQ ID No.2的序列如下所示：

agcagcacagaggactgctgtttagaatgtctcacgtacagggacgagtcttatctctaccagcagtgtgcta ccgtgaa。

本发明第二个目的是提供筛选用于特异性识别黄曲霉毒素M1的适配体的单链DNA文库，所述单链DNA文库是将一对茎结构序列5’-ACTGCTG-3’和5’-CAGCAGT-3’引入到原始序列的引物结合区域，得到序列为5'-AGCAGCACAGAGGACTGCTG-N40-CAGCAGTGTGCTACCGTGAA-3'的初始文库；所述N40表示由40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。

本发明第三个目的是提供所述单链DNA文库在筛选特异性识别庆大霉素的核酸适配体中的应用。

本发明第四个目的是提供用于特异性识别庆大霉素的适配体的筛选方法，包括以下步骤：

(1)羧基磁珠与庆大霉素的偶联

向羧基磁珠溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺进行孵育，以进行羧基磁珠的活化，加入庆大霉素溶液，孵育，得到偶联有庆大霉素的磁珠；

(2)单链DNA文库与靶标孵育

向荧光基团标记的单链DNA文库中加入偶联有庆大霉素的磁珠，混合孵育，以使单链DNA文库与庆大霉素充分结合，获得与靶标结合的ssDNA；

(3)PCR扩增

将步骤(2)中所得ssDNA作为模板进行PCR扩增；

(4)制备单链

将步骤(3)的扩增产物制备成单链DNA，得到下一轮筛选文库；

(5)多轮筛选

将步骤(2)的随机单链DNA文库替换为步骤(4)中所述下一轮筛选文库，按照步骤(2)-(4)重复多轮筛选；

(6)高通量测序

筛选结束后，将步骤(4)中最后一轮筛选所得的筛选文库进行高通量测序分析，检测所得序列与庆大霉素的亲和力和特异性，得到用于特异性识别庆大霉素的核酸适配体。

在本发明的一个实施例中，步骤(5)中，所述多轮筛选是利用流式细胞分选-SELEX技术进行筛选，通过逐渐降低收集高荧光磁珠的范围来增加筛选压力。

本发明第五个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有权利要求1所述的核酸适配体。

本发明第六个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述的核酸适配体。

本发明第七个目的是提供所述的组合物、所述的试剂盒或所述的核酸适配体在检测庆大霉素中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述核酸适配体序列中的5’端或3’端连接功能性基团或分子。

在本发明的一个实施例中，所述功能性基团或分子选自荧光素、生物素、氨基、巯基、地高辛、放射性同位素、酶标记或纳米发光材料。

本发明在于提供一种针对氨基糖苷类抗生素等小分子靶标的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配体技术快速、准确检测庆大霉素的方法。特别涉及到利用分子生物学技术中的指数富集配体系统进化技术。

本发明方法利用插入结构化片段的三段式序列作为初始文库，用FACS-SELEX对庆大霉素进行筛选，最终获得两条与靶标高亲和性、高特异结合的适配体，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体转为检测探针，用于环境样品、食品中庆大霉素的检测，达到快速、准确诊断的目的。

本发明的机理：

本发明将靶标固定在羧基磁珠上，将固定好的靶标与荧光标记的文库相孵育，孵育后用结合缓冲液冲洗磁珠。将清洗后的溶液放入流式细胞分选仪的样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，磁珠被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。将这些液滴包裹的磁珠充以正、负不同的电荷，并在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中。在筛选过程中通过选择分选门来控制收集高荧光磁珠的比例，以减少非特异性吸附带来的影响。将经分选后的磁珠进行热变性，吸取上清液中的序列，用于后续的PCR扩增、纯化、酶切和单链制备等连续步骤的重复循环过程。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)与抗体相比，适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。

(2)本发明的筛选方法可以显著提高适配体的筛选率。通过插入结构化文库有助于帮助序列快速折叠，丰富文库池中序列结构的多样性，以获得识别性能良好的适配体序列。借助流式细胞分选的分离方法提高筛选过程中的分离效率，以期缩短筛选所需的周期。

(3)该序列是从结构显著、与庆大霉素结合具有不同亲和力的候选适配体序列中选取出的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异识别环境中、食品中存在的庆大霉素。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明基于结构化文库设计的FACS-SELEX技术筛选庆大霉素核酸适配体的原理图；

图2为本发明实施例1中庆大霉素的标准曲线；

图3为本发明实施例1中庆大霉素固定前后的的液相色谱图；其中，A为庆大霉素固定前的的液相色谱图；B为庆大霉素固定后的的液相色谱图；

图4为本发明实施例1中筛选庆大霉素的流式细胞分选图；其中，A为第一轮筛选的流式细胞分选图；B为第二轮筛选的流式细胞分选图；C为第三轮筛选的流式细胞分选图；

图5为本发明实施例1中流式细胞分选仪监测筛选过程；其中，A为空白筛选监控图；B为第二轮筛选监控图；C为第三轮筛选监控图；

图6为本发明实施例1中经过筛选和测序后前五十条候选适配体序列的进化树分析；

图7为本发明实施例1中庆大霉素候选适配体Qing 2(A)、Qing 20(B)、Qing 23(C)、Qing 31(D)和Qing 34(E)的二级结构图；

图8为本发明实施例2中庆大霉素候选适配体Qing 2(A)、Qing 20(B)、Qing 31(C)和Qing 34(D)的亲和力饱和结合曲线；

图9为本发明实施例3中庆大霉素的候选适配体Qing 20(A)和Qing 31(B)的特异性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下面是基于结构化文库设计的FACS-SELEX技术筛选高亲和性和高特异性的庆大霉素核酸适配体(如图1所示)及其筛选方法。

实施例1

1、合成随机单链DNA文库和引物(由上海生工生物工程有限公司合成)

随机ssDNA文库：

5'-FAM-AGCAGCACAGAGGACTGCTG-N40-CAGCAGTGTGCTACCGT GAA-3'，其中，N40表示由40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。

5'上游引物：5'-FAM-AGCAGCACAGAGGACTGCTG-3'

5'磷酸化下游引物：5'-P-TTCACGGTAGCACACTGCTG-3'

将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100μM贮存液存于4℃备用。

2、初始文库的设计

将一对茎结构序列(5’-ACTGCTG-3’、5’-CAGCAGT-3’)引入到原始序列(5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3')的引物结合区域，构成初始文库。

3、庆大霉素的固定

(1)高效液相色谱法检测庆大霉素

取一定量的庆大霉素溶液，将其用超纯水补至2mL，再依次加入2mL异丙醇和1mL的邻苯二甲醛衍生剂，将其混合均匀，于50℃下衍生20min。冷却到室温后取50μL样品过膜后，供高效液相色谱测定。高效液相色谱条件：流动相为含有0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液的甲醇-醋酸溶液(V/V，200/5)，色谱柱使用C18柱，进样体积为10μL，流速为1.0mL/min。配备检测器为荧光检测器，所用到的激发波长为340nm，发射波长为540nm。

将庆大霉素溶液稀释成一系列梯度浓度0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL的标准溶液，按照上述操作进行测定，每个浓度的标准液重复3次。以庆大霉素标准液的浓度为横坐标，以待测物色谱图中标记峰的峰面积为纵坐标绘制庆大霉素的标准曲线，该标准曲线用于羧基磁珠与庆大霉素偶联过程中对庆大霉素的定量分析。

图2所示为庆大霉素的标准曲线。当保留时间在7min～8min之间会出现一个明显的组分峰，且其峰面积会随着庆大霉素的浓度增加而增大。因此研究选择此峰为标记来确定庆大霉素的含量。庆大霉素浓度在25μg/mL～500μg/mL时，峰面积与庆大霉素浓度呈现良好的线性关系，相关系数(R²)为0.99901。

(2)羧基磁珠与庆大霉素的偶联

取100μL 10mg/mL的羧基磁珠原液于离心管中，磁分离后去除上清液，用MES缓冲液(将MES调pH至6，并用孔径0.2μm滤膜过滤得到)清洗羧基磁珠三次，以除去保护液。分散于200μL 2-(N-吗啉基)乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic acid，MES)缓冲液中。磁分离去除上清液，向体系中依次加入250μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和250μLN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，于37℃孵育30min以进行羧基磁珠的活化。用MES缓冲液清洗活化后的羧基磁珠以彻底清洗反应中过量的试剂。向磁珠中加入200μL 2g/L的庆大霉素溶液，于室温下孵育1h。反应结束后，磁分离收集上清液，用高效液相色谱法检测孵育前后上清液中庆大霉素的含量。

如图3中的A所示，在保留时间为7.55min时，峰对应的面积为2.11×10⁷。经计算，偶联前上清液中的庆大霉素的浓度为459.20μg/mL。图3中的B是偶联后上清液中庆大霉素的色谱图。当保留时间为7.89min时，该组分峰面积为1.99×10⁷。计算后得到偶联后上清液中的庆大霉素浓度为431.50μg/mL。庆大霉素溶液的体积为2mL，其固定在1mg磁珠上的量为55.40μg。

4、庆大霉素适配体的体外筛选

(1)ssDNA文库与靶标孵育：第一轮筛选中，首先将文库进行95℃热变性处理5min，冰浴冷却10min。接着向靶标固定的磁珠中加入500nmol预处理后的ssDNA，于37℃下孵育2h，使ssDNA文库与庆大霉素充分结合。

(2)流式细胞分选筛选庆大霉素：研究在第一轮筛选中添加500pmol的带有荧光基团的文库，利用流式细胞分选的具体筛选图如图4中的A所示。相较于空白，第一轮的磁珠分出两个峰，且两个峰整体都发生偏移，这可能是由于第一轮加入的文库量过多，磁珠吸附多余的序列，导致整体的峰都向高荧光强度的区域偏移。在第一轮筛选中研究收集荧光强度前20％的磁珠，以最大限度减少非特异性结合磁珠对于筛选结果的影响。第二轮筛选过程中加入200pmol的次级文库，收集荧光强度前5％的磁珠(图4中的B)。第三轮筛选中收集荧光强度前2％的磁珠(图4中的C)。

(3)PCR扩增：收集获得分选区高荧光的磁珠，对其进行加热，使序列从靶标上脱落。经过磁分离，吸取筛选获得的上清液为模板进行PCR扩增。PCR的体系为4μL模板，浓度为5μM的上下游引物各1μL，浓度为5mM的含Mg²⁺的dNTP 1μL，10×PCRbuffer 5μL，Taq酶0.5μL，用无菌超纯水补足至50μL。PCR扩增先经过94℃变性5min，接着94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，以PCR优化的最佳循环轮数循环后72℃延伸2min，最后4℃冷却。

(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳验证：PCR产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。酶切后的产物采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)进行电泳，使用凝胶成像仪成像，观察电泳条带是否单一明亮，条带是否处在80bp的位置。

(5)PCR产物的纯化及酶切：将获得的PCR产物采用纯化试剂盒进行纯化处理，以除去PCR反应体系中的其他物质。用NanoDrop-2000微量紫外可见分光光度计测定纯化好的核酸浓度，以确定酶切所需的大致时间。取纯化后的产物，加入1/10体积的酶切缓冲液和适量核酸外切酶混合均匀，于37℃下反应直至酶切完全。酶切完成后于75℃下灭酶10min以停止酶切反应。

(6)酶切产物的纯化：向酶切产物中加入1/10体积3mol/L的NaAC并混匀，再加入2倍体积无水乙醇混匀，放置于-20℃冰箱中沉淀过夜。沉淀后的溶液在4℃下于14000rpm离心15min。弃去上清液后，向体系加入200μL 70％乙醇，混合均匀后在4℃下于14000rpm离心15min，弃去上清。将其放置于50℃烘箱中进行干燥处理，加入50μL 1×TE缓冲液溶解作为下一轮筛选的文库。

随着筛选轮数的增加，逐渐增加筛选压力以获得亲和力和特异性均良好的适配体序列。除第一轮筛选的文库添加量为500nmol，从第二轮筛选开始，文库的添加量减少至200pmol。

5、筛选过程中文库富集情况的监控

在筛选过程中利用流式细胞分选仪监控文库的富集程度，如图5所示。利用流式分选仪处理空白组，研究发现磁珠主要分布在Q1区域。当筛选到第二轮时发现有70％以上的磁珠偏移至Q2区域，这表明经过两轮筛选后大部分荧光修饰的序列可以与固定靶标的磁珠结合。当筛选到第三轮时有90％以上的磁珠带有荧光。因此，将第三轮的PCR纯化产物用于高通量测序。

6、克隆与测序

将第三轮筛选得到的PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行高通量测序，获得约100000条适配体序列。采用MEGA11软件分析前五十条序列的同源性信息(图6所示)，利用M-fold在线网站对候选适配体序列进行二级结构模拟(图7所示)。结合序列出现频次、家族同源性、二级结构、碱基数和吉布斯自由能ΔG选出五条结构稳定，自由能较低的序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端标记FAM的适配体，用于亲和力和特异性分析。

实施例2适配体亲和力分析

五条候选适配体序列用TE缓冲液配制成100μM的溶液，将其贮存在-20℃下备用。一系列浓度梯度带有荧光基团的适配体溶液(25nM，50nM，100nM，150nM，200nM)与2μM庆大霉素于37℃下孵育1h。然后加入最佳体积的氧化石墨烯溶液(1mg/mL)，在37℃下孵育30min，混合均匀，将混合液转移至黑色酶标板中测定荧光偏振值，记为FP₁。以不加靶标的混合体系为空白对照，记录其荧光偏振值为FP₀。重复试验三次，利用GraphPad Prism 8.0软件计算Kd，并以适配体浓度为横坐标，ΔFP(ΔFP＝FP₀-FP₁)为纵坐标，绘制其饱和结合曲线(图8所示)。Qing 2、Qing 20、Qing 31、Qing 34与庆大霉素结合的Kd分别为310.3±7.08nmol/L、53.70±3.25nmol/L、125.20±2.87nmol/L、473.60±4.56nmol/L。将Qing 23与庆大霉素结合数据进行非线性拟合处理，其没有Kd，这说明Qing 23不与庆大霉素相结合。根据Kd值与亲和力的关系，Qing 20与庆大霉素结合的Kd最低，亲和效果最好。

实施例3适配体特异性分析

选取与庆大霉素结合亲和力较好即Kd值较小的候选适配体Qing 20和Qing 31进行特异性分析。50nM带有荧光基团的候选适配体溶液分别与庆大霉素、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、四环素(Tetracyclines，TC)、氯霉素(Chloroamphenicol，CAP)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)混合，在37℃下孵育1h，然后向体系中加入适量体积的GO溶液(1mg/mL)，涡旋混合均匀，将其放入黑色酶标板中测定荧光偏振值，记为FP₂。以不加靶标的混合体系为空白对照，记录其荧光偏振值为FP₀。重复试验三次，以不同候选适配体为横坐标，以相对荧光偏振(ΔFP/ΔFP_m)为纵坐标绘制候选适配体的特异性曲线(图9所示)，其中ΔFP是正筛靶标、反筛物质与空白组所测定的荧光偏振差值，ΔFP_m是正筛靶标中与空白组的荧光偏振值差值最大的数值。

研究选择亲和效果较好的两条序列Qing 20和Qing 31进行进一步的特异性分析。以OTC、TC、CAP和Amp为特异性检测的干扰靶标，探究两条适配体对于庆大霉素的结合特性情况。两条适配体对于庆大霉素的结合率均在80％以上，而对于干扰物质的结合率均在25％以下，这表明Qing 20和Qing 31均具有一定的特异性。

适配体Qing 20的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

agcagcacagaggactgctggatagggtttgaagctgactacgagagcggatctcacgcccagcagtgtg ctaccgtgaa

适配体Qing 20的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

agcagcacagaggactgctgtttagaatgtctcacgtacagggacgagtcttatctctaccagcagtgtgcta ccgtgaa

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.特异性识别庆大霉素的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。

2.筛选用于特异性识别黄曲霉毒素M1的适配体的单链DNA文库，其特征在于，所述单链DNA文库是将一对茎结构序列5’-ACTGCTG-3’和5’-CAGCAGT-3’引入到原始序列的引物结合区域，得到序列为5'-AGCAGCACAGAGGACTGCTG-N40-CAGCAGTGTGCTACCGTGAA-3'的初始文库；所述N40表示由40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。

3.权利要求2所述单链DNA文库在筛选特异性识别庆大霉素的核酸适配体中的应用。

4.用于特异性识别庆大霉素的适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)羧基磁珠与庆大霉素的偶联

(2)单链DNA文库与靶标孵育

(3)PCR扩增

将步骤(2)中所得ssDNA作为模板进行PCR扩增；

(4)制备单链

将步骤(3)的扩增产物制备成单链DNA，得到下一轮筛选文库；

(5)多轮筛选

(6)高通量测序

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)中，所述多轮筛选是利用流式细胞分选-SELEX技术进行筛选，通过逐渐降低收集高荧光磁珠的范围来增加筛选压力。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的核酸适配体。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的核酸适配体。

8.如权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的试剂盒或权利要求1所述的核酸适配体在检测庆大霉素中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸适配体序列中的5’端或3’端连接功能性基团或分子。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述功能性基团或分子选自荧光素、生物素、氨基、巯基、地高辛、放射性同位素、酶标记或纳米发光材料。