CN116769612A - 一种少根根霉jhk31及其在金花葵黄酮辅助提取中的应用 - Google Patents

一种少根根霉jhk31及其在金花葵黄酮辅助提取中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种少根根霉JHK31及其在金花葵黄酮辅助提取中的应用，属于生物医药技术领域。该少根根霉JHK31的保藏编号为：CCTCCNO：M2023722，利用所述少根根霉JHK31发酵金花葵可提高金花葵黄酮的提取率。本发明通过对金花葵的生物发酵前处理，黄酮提取率可显著提高到3.65％，远高于同批次未发酵金花葵黄酮提取率2.61％，发酵后的黄酮提取率较发酵前黄酮提取率显著提高了39.85％，且发酵前处理可提高黄酮的抗氧化性能。经发酵后的金花葵黄酮提取时间更短、溶剂用量更少，提取条件更温和，提取效率更高，更有利于大规模生产。

Description

一种少根根霉JHK31及其在金花葵黄酮辅助提取中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种少根根霉JHK31及其在金花葵黄酮辅助提取中的应用。
背景技术
金花葵(Abelmoschus manihot，syn.:Hibiscus manihot)作为一种独特的山野菜和中药材，是锦葵科秋葵属一年生草本植物，曾经历了灭种，到2003年才再次被发现，关于金花葵植物的研究相对较少。金花葵富含黄酮类、微量元素、多糖和其他对人有益的生物活性成分和营养素，并凭借富含多种有益功效成分的优势及具有适用性广和稳定性佳的特性，能满足人们日益追求的健康需求。
黄酮类化合物作为广泛存在于自然界中的植物次级产物，一直都是广大学者研究的对象，因其具有抑菌抗炎、抗氧化、改善肥胖、预防心脑血管疾病等生理活性，使其在医药原料、人类健康事业中占有非常重要的地位，同时作为添加剂在食品、化妆品等领域的应用已成为发展新方向，具有广阔的市场空间。而金花葵属于黄酮含量最高的植物之一，超出黄酮生产用到的原料大豆、银杏等数倍之多，其中金花葵花的含量最高，黄酮种类最丰富，测得金花葵花中总黄酮含量可达228.19mg/g。
植物天然活性物质通常被细胞壁包裹，由于植物细胞壁结构坚韧、组分复杂、机械强度高，是活性物质的天然屏障，难以破碎，吸收利用率低，对活性物质和溶剂的传递造成严重阻碍。常用的机械粉碎，即便是超细粉碎技术对中药细胞壁的破碎率仅为15％，有效成分的释放率不超过40％，制约了行业的快速发展。此外关于黄酮类化合物的传统提取方法如热水回流提取法、溶剂浸提法、酸(碱)沉淀法等，这些方法溶剂用量大、提取温度高、反应时间长，不能满足绿色化、低温化的可持续行业发展需求；新型的提取方法如超声辅助提取法耗时短，但单位体积的能耗高，可能会改变活性成分的分子结构；微波辅助提取法省时高效、无污染，但设备要求高、规模化生产难以实现；超微粉碎技术辅助提取法对活性物质提取率的提升最为显著，但需要专用设备，提取成本高；酶辅助提取法对材料所需酶(酶种类、酶解温度、时间、pH值、浓度)的最佳工艺难以确定。因此，如何有效破碎中药细胞壁、提高有效成分的释放率，寻找更高效的金花葵黄酮的提取方法已经成为了推动中药产业快速发展的契机。
发明内容
本发明的目的是提供一种少根根霉JHK31及其在金花葵黄酮辅助提取中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过对金花葵的生物发酵前处理，显著提高黄酮提取率，并且经发酵后的金花葵黄酮提取时间更短、溶剂用量更少，提取条件更温和，提取效率更高，更有利于大规模生产。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种少根根霉(Rhizopus arrhizus)JHK31，于2023年05月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2023722。
本发明还提供一种提高金花葵黄酮提取率的方法，包括利用所述的少根根霉JHK31发酵金花葵的步骤。
进一步地，具体包括以下步骤：
向干燥、粉碎后的金花葵粉末中加水，至含水量为30-80％，再加入硫酸铵和葡萄糖，得发酵培养基，之后向发酵培养基中接种所述少根根霉JHK31进行发酵，获得发酵金花葵；最后采用药典法的提取方法进行提取即可。
进一步地，所述硫酸铵和葡萄糖的加入量分别为0.2wt％和2wt％；所述含水量为50wt％。
进一步地，所述少根根霉JHK31的接种量为7wt％；所述发酵的条件为发酵温度28℃、发酵初始pH 6和发酵时间60h。
进一步地，所述提取采用醇提法，提取条件包括：提取时间为2h、提取温度为70℃、乙醇浓度为60％和料液比为1g：40mL。
本发明还提供一种所述的少根根霉JHK31在金花葵黄酮辅助提取中的应用。
本发明还提供所述的少根根霉JHK31在提高金花葵黄酮提取物的抗氧化性能中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
a.本发明通过压力筛选法筛选得到高性能菌株，构建发酵菌种库，根据不同中药的特性搭配不同菌株发酵，同时在发酵过程中进行发酵优化，实现发酵过程的水气温耦合控制，最后得到的发酵金花葵遇水即溶，有效成分可以充分释出。
b.本发明使用的少根根酶JHK31，金花葵发酵的专用菌种，其保藏号为CCTCC NO：M2023722。少根根酶JHK31固态发酵金花葵，利用少根根霉在生长过程中产生的酶降解细胞壁中的大分子，如纤维素、半纤维素和果胶等，可特异性促进黄酮从细胞中溶出，在黄酮的提取过程中不仅克服了细胞的抗降解屏障，还克服了细胞壁及细胞间质的传质阻力。
c.通过对金花葵的生物发酵前处理，黄酮提取率可显著提高到3.65％，远高于同批次未发酵金花葵黄酮提取率2.61％，发酵后的黄酮提取率较发酵前黄酮提取率显著提高了39.85％。同时发现，发酵后的黄酮较发酵前黄酮发挥更好的抗氧化性能。
d.经发酵后的金花葵黄酮提取时间更短、溶剂用量更少，提取条件更温和，提取效率更高，更有利于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为少根根酶JHK31的菌落形态与显微形态；
图2为少根根酶JHK31发酵金花葵期间菌丝生长状况；
图3为不同菌株发酵金花葵对黄酮提取率的影响；
图4为不同发酵时间对金花葵黄酮提取率的影响；
图5为不同发酵初始pH对金花葵黄酮提取率的影响；
图6为不同发酵含水量对金花葵黄酮提取率的影响；
图7为不同发酵温度对金花葵黄酮提取率的影响；
图8为不同接菌量对金花葵黄酮提取率的影响；
图9为不同氮源(硫酸铵)添加量对金花葵黄酮提取率的影响；
图10为不同碳源(葡萄糖)添加量对金花葵黄酮提取率的影响；
图11为提取时间对金花葵发酵前后黄酮含量影响；
图12为提取温度对金花葵发酵前后黄酮含量影响；
图13为乙醇浓度对金花葵发酵前后黄酮含量影响；
图14为料液比对金花葵发酵前后黄酮含量影响；
图15为纯化得到单菌株A1、A2、A3、A4的菌体形态；
图16为金花葵醇提取物黄酮体外DPPH自由基清除能力的测定；
图17为金花葵醇提取物黄酮体外羟自由基清除能力的测定；
图18为金花葵醇提取物黄酮体外ABTS自由基清除能力的测定；
图19为金花葵醇提取物黄酮体外总还原能力的测定；
图20为金花葵醇提取物黄酮对秀丽隐杆线虫体内抗氧化寿命的测定。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1菌种筛选
1.菌种初筛
将购置的金花葵花(购买自玉林信邦药业)65℃烘干至恒重，粉碎，过筛(40目)，无需灭菌，取10g加入无菌发酵罐，再加入事先准备好的无菌水，至含水量达50％，构成发酵培养基，密封，置恒温培养箱(28℃)条件下进行发酵培养4-12d，期间不停的观察菌落长势。
在无菌条件下，经培养后，挑取不同形态的单菌落到事先制备好的PDA培养基中，用灭菌的封口膜将其密封，在28℃条件下进行进一步培养，时间4～12d，观察并记录菌株生长状况。
2.菌种纯化
在无菌条件下，将初筛选得到的不同形态的菌株再经过平板划线接种到新的PDA培养基中，在28℃条件下培养4～12d，观察、记录生长情况，不断循环此步骤，至纯化得到单菌落为止，观察菌落形态和菌体形态，选择具有代表性的菌株进行生理生化鉴定试验，在无菌环境保存以备进一步鉴定。分离纯化得到4株菌种，如图15，命名为A1、A2、A3、A4。
3.菌种选择
将菌株A1、A2、A3、A4(菌液浓度108cfu/ml)按金花葵质量的7％分别接种至含金花葵花的发酵培养基上进行发酵培养，以黄酮的提取率为响应值，每隔12h进行取样，于65℃烘箱干燥至恒重，得到发酵金花葵。参照药典方法对发酵金花葵样品进行提取，将烘干后的发酵金花葵粉末过40目筛，准确称取发酵金花葵粉末1g，加60％乙醇40ml，加热回流2h，放冷，过滤置50ml容量瓶中，残渣用60％乙醇洗涤，洗液并入同一容量瓶中，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，检测样品中总黄酮含量。实验结果如图3和表1所示，得出A4菌株在28℃、含水量为60％、发酵60h的条件下，发酵金花葵的黄酮含量最高，黄酮提取率为3.24％。因此以菌株A4作为金花葵生物定向破壁的专用菌株。图2为菌株A4发酵金花葵菌丝生长的状况。
表1各菌株对发酵金花葵的黄酮含量的影响
菌种 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
A1 2.45 2.48 2.54 2.68 2.88 2.74 2.78 2.76
A2 2.37 2.33 2.66 2.79 3.12 3.07 2.94 2.85
A3 2.51 2.54 2.68 2.72 2.95 2.98 3.04 3.05
A4 2.48 2.62 2.84 3.02 3.24 3.23 3.22 3.08
4.A4菌种鉴定
a.形态、菌落与菌丝形态观察
采用点接法对PDA平板上的菌株A4菌落形态进行观察，将分离纯化的菌株在温度为28℃恒温培养箱内用PDA培养基培养，观察菌落生长过程中形态颜色变化特征；使用插片培养法在显微镜下观察菌丝形态特征并拍照记录。
菌落形态观察：菌苔较稠密，前期为白色，由匍匐菌丝向四周蔓延生长，菌丝分布疏松，生长迅速，48h作用几乎长满整个平板，菌丝呈灰白色且菌丝顶端开始出现白色孢子，第3d菌丝体呈灰褐色甚至黑色，孢囊老熟后变为黑色。
显微镜形态观察：显微镜下观察菌丝发达，细长，菌丝不分隔，分生孢子椭成丛状生长，顶端膨大，外有孢子囊，孢子囊圆形，囊轴圆形，孢囊梗有分枝，襄内有密集孢子囊孢子，孢囊孢子椭圆形，近圆形；假根根状，发达；菌丝体有厚垣孢子。图1为菌株A4的的菌落形态与显微形态。根据以上结果并参照真菌鉴定手册和真菌分类学将初步鉴定为根霉(Rhizopus)。
5.菌种保藏
经鉴定，该菌种为少根根霉(Rhizopus arrhizus)JHK31，菌种保藏号为：CCTCCNO：M 2023722，于2023年05月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学。
实施例2金花葵发酵工艺优化
1.在实施例1的发酵培养基基础上，进行发酵条件的优化，以黄酮提取率为响应值。通过单因素实验分别优化发酵时间、初始pH值、培养温度、接种量、含水量、碳源添加量、氮源添加量。
以同产地、同批次的金花葵花为实验材料，以金花葵花为唯一培养基质，灭菌后，取金花葵粉碎末10g，加入无菌水，混合均匀后得到含水金花葵培养基，再添加硫酸铵和葡萄糖，加入金花葵高效破壁菌株JHK31(菌液浓度108cfu/ml)，混合均匀，在恒温培养箱里静置发酵，发酵结束后，取样平摊于不锈钢盘上，烘箱65℃干燥，得到发酵金花葵。参照药典方法进行提取，将烘干后的发酵金花葵粉末过40目筛，准确称取发酵金花葵粉末1g，加60％乙醇40ml，加热回流1h，放冷，过滤置50ml容量瓶中，残渣用60％乙醇洗涤，洗液并入同一容量瓶中，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，检测样品中总黄酮含量。检测发酵金花葵样品中总黄酮含量，每隔6h进行取样检测样品中总黄酮含量。
根据以下参数依次进行试验：
(1)以发酵时间(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)为单一研究参数，发酵温度28℃，接菌量7％，含水量60％，初始pH 5，硫酸铵0.1％，葡萄糖2％，测定不同发酵时间对黄酮提取率的影响。实验结果如图4。
(2)以0.1mol/L磷酸二氢钠和0.1mol/L磷酸氢二钠调节发酵的初始pH(3、4、5、6、7、8)为单一研究参数，发酵时间60h，发酵温度28℃，接菌量7％，含水量60％，硫酸铵0.1％，葡萄糖2％，测定发酵的不同初始pH对黄酮提取率的影响。实验结果如图5。
(3)以含水量(30％、40％、50％、60％、70％、80％)为单一研究参数，发酵时间60h，发酵温度28℃，接菌量7％，初始pH 5，硫酸铵0.1％，葡萄糖2％，测定不同含水量对黄酮提取率的影响。实验结果如图6。
(4)以发酵温度(20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃)为单一研究参数，发酵时间60h，接菌量7％，含水量60％，初始pH 5，硫酸铵0.1％，葡萄糖2％，测定不同发酵温度对黄酮提取率的影响。实验结果如图7。
(5)以接种量(3％、5％、7％、10％、15％、20％)为单一研究参数，发酵时间60h，发酵温度28℃，含水量60％，初始pH 5，硫酸铵0.1％，葡萄糖2％，测定不同接菌量对黄酮提取率的影响。实验结果如图8。
(6)以氮源(硫酸铵)的添加量(0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)为单一研究参数，发酵时间60h，发酵温度28℃，接菌量7％，含水量60％，初始pH 5，葡萄糖2％，测定硫酸铵的添加量对黄酮提取率的影响。实验结果如图9。
(7)以碳源(葡萄糖)的添加量(0.5％、1％、2％、3％、4％、5％)为单一研究参数，发酵时间60h，发酵温度28℃，接菌量7％，含水量60％，初始pH 5，硫酸铵0.1％，测定葡萄糖的添加量对黄酮提取率的影响。实验结果如图10。
综合上述实验得出，JHK31菌株在28℃、接菌量7wt％，发酵初始pH 6，硫酸铵0.2wt％，葡萄糖2wt％，含水量为50wt％的条件下发酵60h为最适发酵条件，此时黄酮提取率最高。
实施例3不同提取条件下金花葵发酵前后黄酮含量对比
1.发酵金花葵制备：取灭菌后金花葵粉碎末10g，以菌株JHK31进行发酵。发酵条件：28℃、接菌量7％，发酵初始pH 6，硫酸铵0.2％，葡萄糖2％，含水量50％，发酵60h。发酵结束取样平摊于不锈钢盘上，烘箱65℃干燥，得到发酵金花葵。
2.提取条件：以黄酮提取率为响应值，对药典法的提取条件稍作调整，选择料液比、提取时间、乙醇体积分数、浸提温度4个因素，在1：40、2h、60％、80℃、提取1次的基础条件下，测定金花葵发酵前后的黄酮含量变化。
(1)分别取发酵与未发酵的金花葵粉末1g，以提取时间(1h、1.5h、2h、2.5h、3h)为单一变量，料液比1:40、乙醇浓度60％、提取温度80℃，测定发酵前后黄酮含量变化。实验结果如图11。
(2)分别取发酵与未发酵的金花葵粉末1g，以提取温度(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)为单一变量，提取时间2h、料液比1:40、乙醇浓度60％，测定发酵前后黄酮含量变化。实验结果如图12。
(3)分别取发酵与未发酵的金花葵粉末1g，以乙醇浓度(40％、50％、60％、70％、80％)为单一变量，提取时间2h、料液比1:40、提取温度80℃，测定发酵前后黄酮含量变化。实验结果如图13。
(4)分别取发酵与未发酵的金花葵粉末1g，以料液比(1：30、1：35、1：40、1：45、1：50(g/ml))为单一变量，提取时间2h、乙醇浓度60％、提取温度80℃，测定发酵前后黄酮含量变化。实验结果如图14。
结果表明，在不同提取条件下，发酵后的黄酮含量普遍高于未发酵黄酮含量，证明了该实验的可行性。采用优化后的提取条件，黄酮提取率可显著提高到3.65％，远高于同批次未发酵金花葵黄酮提取率2.61％，发酵后的黄酮提取率较发酵前黄酮提取率显著提高了39.85％(见表2)。
表2
次数 1 2 3 平均提取率
发酵前 2.66％ 2.51％ 2.66％ 2.61％
发酵后 3.71％ 3.54％ 3.70％ 3.65％
实施例4金花葵醇提取物黄酮体外抗氧化活性测定
将实施例3以优选条件提取的未发酵金花葵提取物命名为UEE(UnfermentedEthanol Extract)，发酵金花葵醇提取命名为FEE(Fermented Ethanol Extract)。下述实验以VC为阳性对照。
1DPPH自由基清除能力的测定
分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml浓度的样品溶液2.5ml于试管中，加入DPPH溶液2.5ml，混合均匀后室温避光孵育30min，于517nm处测定溶液吸光度。DPPH自由基的清除率公式为：
；
式中A2为样品实验组吸光度；A1为用蒸馏水替代DPPH溶液的对照组吸光度；A0为用蒸馏水和DPPH溶液混合的空白组吸光度。
实验结果如图16所示，从图中可以看出，当金花葵黄酮提取液浓度从0.2mg/ml增加到1.0mg/ml时，发酵金花葵黄酮对DPPH自由基的清除率从25.12％增加到88.43％，并呈线性增加，当浓度增加到1.0mg/ml时，其抗氧化作用达到最大是抗坏血酸的0.93倍。且同一黄酮质量浓度下，发酵金花葵黄酮的DPPH自由基清除率高于未发酵发酵金花葵黄酮，说明发酵后能有效增加黄酮的抗氧化性。
2羟自由基清除能力的测定
分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml浓度的样品溶液2.5ml于试管中，依次加入6mmol/L的FeSO4溶液和H2O2溶液各2.5mL，摇匀后静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸2.5mL，摇匀后室温避光静置30min，在510nm处测定吸光度。羟基自由基的清除率公式为：
；
式中A2为样品实验组吸光度；A1为用蒸馏水替代水杨酸的对照组吸光度；A0为用蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。
实验结果如图17所示，从图中可以看出，如图所示，金花葵黄酮提取液对羟自由基都有一定清除能力，且随着浓度的增加，对羟自由基的清除率成一定线性关系，在不同浓度下，发酵金花葵黄酮对羟自由基清除率始终大于未发酵金花葵黄酮，当浓度为1.0mg/ml时，发酵金花葵及未发酵金花葵黄酮对羟自由基清除率达到最大值，分别为57％、52％。
3ABTS自由基清除能力的测定
取等体积7mmoL/L的ABTS溶液和14mmoL/L过硫酸溶液混合均匀，避光24h，使用时用蒸馏水调节吸光度值为0.7土0.02即可获得工作液。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml浓度的样品溶液2.5ml于试管中，加入ABTS工作液2.5ml，混合均匀后室温避光孵育15min，于734nm处测定溶液吸光度。
；
式中A2为样品实验组吸光度；A1为用蒸馏水替代ABTS工作液的对照组吸光度；A0为用蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。
实验结果如图18所示，从图中可以看出，金花葵黄酮对ABTS+自由基清除率与质量浓度呈正相关，且同一浓度下发酵金花葵黄酮的清除率大于未发酵金花葵黄酮清除率，当金花葵黄酮质量浓度为1mg/ml时，发酵金花葵黄酮对ABTS+自由基清除率达到最大值92％。
4总还原能力测定
分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml浓度的样品溶液1.0m于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和1％铁氰化钾溶液各2.5ml，混合均匀后于50℃水浴20分钟后，分别加入10％三氯乙酸2.5ml，混匀之后以3000r/min离心10min，取2.5ml上清液置于试管中，加入0.5ml的0.1％三氯化铁溶液和2.5ml蒸馏水，摇匀后静置10min，取适量于700nm处测定吸光值，VC作为阳性对照。总还原能力公式：
总还原能力＝A2-A1；
式中A2为样品实验组吸光度；A1为用蒸馏水替代样品溶液的空白组吸光度。
实验结果如图19所示，从图中可以看出，随着金花葵黄酮提取液质量浓度的增加，两种金花葵总抗氧化能力呈上升趋势，在黄酮质量浓度为1mg/ml时，两者总抗氧化能力都达到最大，且发酵金花葵黄酮的总抗氧化能力高于未发酵金花葵黄酮。
5金花葵醇提取物黄酮对秀丽隐杆线虫体内抗氧化寿命测定
线虫寿命实验
对线虫同期化处理，将裂解后的虫卵经过夜孵化后均匀加入至各组平板上，20℃培养箱中培养48h得同期化后生长至L4期线虫。试验分为空白组和实验组，空白组以不含样品提取物的OP50菌液涂布培养基，实验组给药途径：浓度为1.0mg/mL未发酵金花葵醇提物(UEE)和发酵金花葵醇提物(FEE)过滤除菌，与大肠杆菌OP50菌液(OD600＝1)等体积混合，吸取100μL涂布于NGM平板上喂养线虫(培养基均加入0.25mg/mL Fudr)。每组30条线虫，此时计为0d，每24h转移线虫至对应的实验组新平板中，记录每天线虫的存活与死亡数，直至所有线虫死亡。记录每板培养基中死亡线虫和丢失线虫数量，其中线虫因爬壁或操作失误损伤等原因致非正常死亡，可视为失踪。将实验反复进行三次，最后统计数据计算平均寿命绘制生存曲线。
如图20所示，与对照组相比，采用未发酵及发酵金花葵黄酮提取物饲喂秀丽线虫，均能使秀丽线虫寿命曲线像右移，且平均寿命分别延长了14.87％、20.55％，说明一定质量浓度的金花葵黄酮提取物能够有效的延缓线虫的衰老。发酵后的金花葵黄酮提取物(FEE)能更有效的延长秀丽线虫的寿命，比未发酵金花葵黄酮提取物(UEE)多4.93％。空白组、未发酵组、发酵组线虫最高寿命可达19d、22d，24d，与空白组相比，未发酵组和发酵组线虫最高寿命分别延长了15.79％和26.32％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种少根根霉(Rhizopusarrhizus)JHK31，其特征在于，于2023年05月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2023722。
2.一种提高金花葵黄酮提取率的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的少根根霉JHK31发酵金花葵的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
向干燥、粉碎后的金花葵粉末中加水，至含水量为30-80％，再加入硫酸铵和葡萄糖，得发酵培养基，之后向发酵培养基中接种所述少根根霉JHK31进行发酵，获得发酵金花葵；最后进行提取即可。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵和葡萄糖的加入量分别为0.2wt％和2wt％；所述含水量为50wt％。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述少根根霉JHK31的接种量为7wt％；所述发酵的条件为发酵温度28℃、发酵初始pH6和发酵时间60h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取采用醇提法，提取条件包括：提取时间为2h、提取温度为70℃、乙醇浓度为60％和料液比为1g：40mL。
7.一种如权利要求1所述的少根根霉JHK31在金花葵黄酮辅助提取中的应用。
8.一种如权利要求1所述的少根根霉JHK31在提高金花葵黄酮提取物的抗氧化性能中的应用。
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