CN116769477A - 一种双发射碳点及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双发射碳点及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双发射碳点及其制备方法和应用。双发射碳点采用荧光物质、色氨酸和有机溶剂，经一锅溶剂热法制得。本发明的双发射碳点的制备方法，包括以下步骤：将荧光物质和色氨酸分散到有机溶剂中，然后置于反应釜中，进行加热反应，冷却至室温，加入水，离心纯化，取上清液，通过透析膜进行透析，冷冻，干燥，获得粉末双发射碳点。本发明还提供双发射碳点在检测色氨酸和pH值中的应用。本发明的双发射碳点被用于高选择性地检测色氨酸，在pH值的传感中具有良好的抗干扰能力。

Description

一种双发射碳点及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种双发射碳点及其制备方法和应用。
背景技术
色氨酸(Trp)是人体蛋白质和多肽代谢必需的氨基酸，在人类饮食中对建立和维持氮平衡起着至关重要的作用。此外，Trp对情绪、睡眠和心理健康也有不可或缺的作用。不幸的是，Trp不能在人体内合成，必须每天通过食物摄入，如鸡蛋、牛奶和鱼等。根据世界卫生组织(WHO)的规定，在活人体内，Trp的日浓度必须被控制在4mg/kg左右。不正常的Trp水平会导致许多重大疾病，如帕金森综合症、阿尔茨海默氏病。而且内源性Trp是诊断肝细胞疾病的一个重要生物标志物。为此，开发一种简便、高选择性、高灵敏度的Trp分析方法对疾病预防和食品检测具有非常重要的意义。
到目前为止，已经报道许多检测Trp的方法。与传统的分析技术如毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC)、表面增强拉曼散射(SERS)、气相色谱法(GC)和电化学技术相比，荧光分析法因其具有高选择性、高灵敏度、可视化、操作简单和反应快速等优点，被广泛用于Trp的检测。但许多测定色氨酸的荧光探针都含有巨大的芳香族结构，例如甲基柱[5]炔、吡烯酮和基于铈的金属有机四面体荧光探针。然而，运用这些物质存在一些缺点，如复杂的合成程序、水溶性较差、毒性大和易被光漂白。因此，开发一种合成简单、高水溶性、低毒和优异光稳定性的荧光探针很有必要。
碳点(CDs)，一种新型的零维碳基纳米材料，因其制备过程简单、高水溶性、低毒性、优良的光学特性和良好的生物相容性等优点，已被广泛用于活体生物成像、药物运输、发光二极管等。且CDs作为荧光探针已经被广泛地应用于化学传感和环境分析领域，例如重金属离子和阴离子等。虽然已有许多基于CDs的荧光探针被用于氨基酸的定量分析，但大多数单信号荧光探针易受到背景干扰等因素影响，从而导致检测结果的准确性较低。
基于碳点的多功能传感研究引起了科研人员的巨大兴趣。如Chen等合成溶剂依赖性的单发射CDs，用于温度、pH和质子泵抑制剂的多功能传感。Li等通过电化学方法，从抗坏血酸水溶液中直接合成具有热传感、核仁成像和抗Gal活性的多功能单响应模式CDs。Liu等开发N,S-CDs，在细胞的pH感应、温度监测和RNA选择性成像方面具有多面性的应用。虽然上述碳点均展示多种传感效益，但是单信号的响应模式因受限于激发强度、探针浓度等干扰，一定程度上限制其分析应用。因此，开发基于双发射碳点的多种模式传感十分有意义。如Song等通过一锅的水热碳化法制备一种双传感功能的双发射碳点，其中pH传感范围为1.5-5.0。Chang等对中性红和尿素进行水热处理，合成手性荧光CDs，用于赖氨酸和2.0-8.0范围的pH传感。但是上述双发射CDs测定pH范围不够全面，而pH值在医学诊断、工业生产和环境保护等诸多方面发挥着重要作用。比如，长期饮用pH值低于6.5的水，会破坏人体酸碱平衡，降低酶活性，导致各种慢性疾病。因而，合成传感宽范围pH的多功能CDs具有重大价值和意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双发射碳点及其制备方法和应用，以为色氨酸和pH值的检测提供一种新选择。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种双发射碳点，所述双发射碳点采用荧光物质、色氨酸和有机溶剂，经一锅溶剂热法制得。
根据上述技术手段，通过采用荧光物质、色氨酸和有机溶剂为原料，并经过一锅溶剂热法制成的双发射碳点，经测定，该双发射碳点激发为280nm波长下，B,G-CDs表现出以碳核态为主要发光源的蓝色荧光和受表面态控制的绿色荧光的双发射，为双发射碳点的应用提供了前提条件。
优选的，所述荧光物质选自荧光素或钙黄绿素。
优选的，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和乙醇中的至少一种。
优选的，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺。
优选的，所述双发射碳点在280nm的激发光下具有以420nm和516nm为中心的双发射峰。
本发明还提供一种本发明所述的双发射碳点的制备方法，包括以下步骤：
将荧光物质和色氨酸分散到有机溶剂中，然后置于反应釜中，进行加热反应，冷却至室温，加入水，离心纯化，取上清液，通过透析膜进行透析，冷冻，干燥，获得粉末双发射碳点。
优选的，所述荧光物质和色氨酸的质量比为1:3～1:7。
优选的，所述荧光物质、色氨酸和有机溶剂按mg：mg：mL比计为4:20:1。
优选的，所述荧光物质和色氨酸的质量比为1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。
再优选的，所述荧光物质和色氨酸的质量比1:5。
优选的，所述加热温度为140℃～220℃，所述加热时间为4～12h。
优选的，所述加热温度为140℃、160℃、180℃、200℃和220℃。
再优选的，所述加热温度为180℃。
优选的，所述加热时间为4h、6h、8h、10h和12h。
再优选的，所述加热时间为8h。
本发明还提供一种如本发明所述的双发射碳点的应用，所述双发射碳点在检测色氨酸中的用途。
优选的，所述双发射碳点用于制备检测色氨酸的比率荧光探针。
其中，比率荧光探针能通过二个不同波长发射峰荧光强度的比值进行自我校准，弱化或消除体系背景的干扰。由分析物引起比率荧光探针产生不同的传感模式通常有两种策略：一种是一个信号(响应信号)对目标物敏感，另一个信号(参考信号)对同一目标物反应惰性；另一类是两个信号对目标物呈现相反的趋势，即一升一降。与单信号的传感策略相比，双信号的比率会产生更大的变化，背景被消除得更彻底。因此，基于双发射CDs的比率荧光探针用于Trp和pH的分析研究意义重大，特别是具有相反信号的响应模式传感。
优选的，所述比率荧光探针用于检测色氨酸的线性范围为0.40-150μmol/L，检测限为30.5nmol/L。
本发明还提供一种如本发明所述的双发射碳点的应用，所述双发射碳点在检测pH值中的用途。
优选的，所述双发射碳点用于制备检测pH值的比率荧光探针。
优选的，所述比率荧光探针用于检测pH值时，pH响应的线性范围为2.71-10.29。
本发明的有益效果：
本发明的双发射碳点，是一种具有pH识别功能，用于Trp传感的B,G-CDs，具有良好的水溶性，耐盐稳定性和优异的光学稳定性；
本发明的B,G-CDs的制备方法，采用荧光物质、色氨酸和有机溶剂，通过简单的一锅溶剂热法合成，具有制备方法简单、条件温和和适宜工业化应用的优点；
本发明的双发射碳点(B,G-CDs)在用于色氨酸和pH的检测过程中，双发射碳点(B,G-CDs)对Trp表现出优异的比率感应特性和高选择性，线性检测范围为0.40-150μmol/L，检测限低至30.5nmol/L；同时，B,G-CDs对2.71-10.29的pH范围呈现卓越的线性关系，B,G-CDs在定量检测实际样中的Trp和pH显示了优异的选择性和抗干扰性能，本发明的B,G-CDs为基于双发射碳点的多功能传感提供了潜在的应用价值。
附图说明
图1为不同极性溶剂合成CDs的三维(3D)荧光光谱；其中，(A)为石油醚；(B)为环己烷；(C)为二氯甲烷；(D)为乙醇；(E)为吡啶；(F)为DMF；(G)为二甲亚砜；(H)为甲酰胺；(I)水；
图2为不同混合溶剂下合成CDs的三维(3D)荧光光谱；其中，(A)为体积比4：1的DMF和水的混合溶剂；(B)为体积比1：4的DMF和水的混合溶剂；(C)为体积比4：1的DMF和乙醇的混合溶剂；(D)为体积比1：4的DMF和乙醇的混合溶剂；(E)为体积比4：1的DMF和二氯甲烷的混合溶剂；(F)为体积比1：4的DMF和二氯甲烷的混合溶剂；
图3为钙黄绿素在不同溶剂中合成CDs的3D荧光光谱图；其中，(G)为DMF；(H)为乙醇；
图4为合成双发射碳点条件的优化结果图，其中，(A)为荧光素和色氨酸的用量比；(B)为合成温度；(C)为合成时间；
图5为双发射碳点的表征结果图；其中，(A)为TEM图像(插图：左上为B,G-CDs的尺寸分布；右上为高分辨TEM图像)；(B)为XRD谱图；(C)为Raman光谱；(D)为热重和导数热重分析曲线；
图6为双发射碳点的表面组成表征结果图；其中，(A)为IR光谱；(B)为XPS全谱；(C)为高分辨C1s光谱；(D)为高分辨N1s光谱；(E)为高分辨O1s光谱；
图7为双发射碳点的光学性质结果图；其中，(A)为归一化的紫外-可见吸收光谱(插图：左右比色皿图片分别是激发波长为280nm和自然光下照射的照片；红色圈为400-500nm紫外-可见吸收的局部放大图)；(B)为240-320nm波长激发下的发射光谱；
图8为双发射碳点的光学性质结果图；其中，(A)为220-400nm下归一化的紫外-可见吸收光谱和420nm波长发射下的激发光谱；(B)为B,G-CDs溶解于不同溶剂的发射光谱；
图9为双发射碳点水溶液的荧光量子产率结果图；其中，(A)为蓝色发射；(B)为绿色发射；
图10为双发射碳点的TG/DTG曲线和发射光谱图；其中，(A)为处于150℃和280℃温度下，B,G-CDs的TG/DTG曲线；(B)为未经处理(25℃)、在150℃和280℃下的B,G-CDs的发射光谱(插图：280nm波长激发下的B,G-CDs的可视化图)；
图11为双发射碳点的发光机理图；
图12为双发射碳点传感色氨酸和pH的示意图；
图13为双发射碳点的稳定性分析结果；其中，(A)为耐盐性；(B)为光漂白；(C)为存放在4℃冰箱；
图14为pH传感的条件优化结果图；其中，(A)为孵育时间；(B)为检测温度；
图15为比率荧光传感pH检测结果图；其中，(A)为280nm波长激发下，不同B-R缓冲pH的发射光谱；(B)为F516/F420数值与2.41-10.29范围pH的拟合曲线；(C)为加入不同pH值的CIE图；
图16为双发射碳点传感pH的普遍性结果图；其中，(A)为Na2HPO4-CA缓冲；(B)为Na2HPO4-KH2PO4缓冲；(C)为KH2PO4-NaOH缓冲；
图17为双发射碳点传感pH的抗干扰能力结果图；其中，(A)为酸性(pH5.0)；(B)为中性(pH7.0)；(C)为碱性(pH9.0)；
图18为PH传感的可逆性和耐盐性结果图；其中，(A)为PH传感的可逆循环；(B)pH传感体系的耐盐性；
图19为Trp传感的实验条件优化结果图；其中，(A)为pH数值；(B)为pH种类；(C)为响应时间；(D)为孵育温度；(E)为离子强度；
图20为双发射碳点传感Trp检测结果图；其中，(A)为280nm波长激发下，B,G-CDs和0.40-150μmol/LTrp的发射光谱；(B)为F420/F516值和0.40-150μmol/LTrp线性曲线图；(C)为280nm波长激发下含有0.40-150μmol/LTrp的B,G-CDs的可视化图；(D)为不同浓度Trp的CIE坐标；
图21为Trp的传感机制分析结果图；其中，(A)为归一化B,G-CDs的激发光谱(516nm波长发射)和Trp的吸收光谱；(B)为280nm波长激发下，加入Trp前后B,G-CDs的绿色发射的荧光寿命衰减曲线；(C)为420nm发射下，Trp、B,G-CDs和含Trp的B,G-CDs的激发光谱；(D)为B,G-CDs和有Trp的B,G-CDs的IR光谱；
图22为双发射碳点传感Trp的选择性及实际样检测分析结果图；其中，(A)为B,G-CDs传感Trp的选择性发射光谱；(B-C)为F420/F516值和不同物质的关系图(B和C中插图：在280nm波长紫外灯激发下，B,G-CDs的可视化图片)；(D)为B,G-CDs传感Trp的抗干扰发射光谱；(E-F)为F420/F516值和各种含有Trp物质的关系图。
具体实施方式
以下将参照附图和优选实施例来说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书中所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
一、试剂和设备
试剂：荧光素，从阿拉丁生化科技股份有限公司(上海，中国)购买。色氨酸，从麦克林生化科技有限公司(上海，中国)购买。N,N-二甲基甲酰胺，从重庆钛新化工有限公司获得。其他试剂均来源于阿拉丁生化科技股份(上海，中国)有限公司。所需的超纯水(18.2MΩ·cm)是通过Milli-QIntegral水净化系统获得。试剂均为分析纯。除非特殊说明，试剂和溶剂不经纯化直接被使用。
设备：装有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜在DHG-9036A型电热恒温鼓风干燥箱(精宏，上海)中加热。所有荧光检测都是在室温下，用日立F-2700荧光分光光度计(东京，日本)完成。其中，色氨酸传感的激发和发射狭缝宽度分别为5nm和10nm，电压400V；pH分析的激发和发射狭缝宽度均为10nm，电压为400V。紫外-可见吸收光谱是用岛津UV-2600分光光度计(东京，日本)获得。同时，TalosF200X透射电子显微镜(赛默飞，捷克)、MSALXD3X射线粉末衍射仪(北京，中国)和inVia10400激光显微拉曼光谱仪(雷尼绍，英国)用于测定碳点的微观形貌和结构。利用ESCALAB250XiX射线光电子能谱仪(XPS)(赛默飞，美国)和珀金埃尔默红外光谱仪(上海，中国)测定碳点的官能团组成。通过珀金埃尔默热重分析仪(上海，中国)获得碳点的热重分析曲线。时间分辨荧光光谱是在EIFLS980荧光光谱仪(爱丁堡，英国)上扫描。QL-901旋涡混合器(海南，中国)用于涡旋振荡溶液。WFH-204B手提式紫外分析仪(齐威，杭州)作为可视化图片的一个工具。FE20/EL20型pH计测定和配置缓冲体系的pH(上海，中国)。
实施例1
一种双发射碳点的制备方法，包括以下步骤：
S1、将20mg荧光素和100mg色氨酸分散到5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并超声处理直到完全分散在DMF溶剂中，得到均匀的溶液；
S2、将均匀的溶液转移到25mL的装有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，旋紧之后在电热恒温鼓风干燥箱中以180℃的恒温加热8h，得到粗品；
S3、将粗品冷却至室温后，加入超纯水，在转速为10000rpm的条件下离心10min，过滤得到上清液，即中间产物；
S4、将中间产物在500Da(截留分子量)纤维素酯膜中透析24h，每间隔一小时，更换一次用于透析CDs的超纯水，将透析后的中间产物经过冷冻、干燥后，获得粉末双发射碳点(B,G-CDs)。离心纯化后的上清液和双发射碳点(B,G-CDs)均储存在4℃冰箱以备进一步应用。
实施例2
本实施例中，为了得到优异荧光性质的碳点，对制备双发射碳点的溶剂种类进行了优化，即只改变溶剂的种类，其他制备条件与实施例1相同，获得不同溶剂下合成的碳点如表1和图1所示。
从表1和图1中的结果显示，选取极性适中的极性溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇和吡啶，制备得到了单一激发下的双发射CDs；而选取极性较大的极性溶剂如水或极性较小的溶剂如二氯甲烷，制备获得的CDs均是单发射性质。因此，证明了极性较大或较小的溶剂体系，均不利于制备双发射碳点，而极性适中的极性溶剂体系有利于双发射CDs的制备。
表1不同溶剂合成的CDs
运用混合溶剂调节合成环境的极性来研究极性对双发射碳点形成的影响。
具体而言：采用极性适中的极性溶剂分别与极性较大(极性值在7.2～10.2之间)、适中(极性在4.3～6.4之间)、较小(极性在0～3.4之间)的极性溶剂混合，包括DMF和水、DMF和乙醇、以及DMF和二氯甲烷，将混合后的混合溶剂用于制备CDs，除了溶剂改变之外，其余制备条件与实施例1相同，获得不同混合溶剂下合成的碳点如表2和图2所示。
表2不同混合溶剂下合成CDs的发射中心
从表2及图2中分析可知，含较大体积比的极性适中的混合溶剂中，合成CDs均是单一激发下双发射性质；相反，在含有较多体积的极性较大或较小的混合溶剂环境下，一锅溶剂热法制得的CDs均是单发射。从而证明了，无论是混合溶剂，还是单一溶剂，极性适中的体系有利于双发射碳点的形成。
实施例3
本实施例中，为了验证荧光物质的影响，把荧光素替换成钙黄绿素制备CDs，并采用极性适中的溶剂，包括DMF和乙醇，且其他制备条件与实施例1相同，通过一锅溶剂热法制备CDs。结果如图3所示。
从图3中分析可知，得到的CDs均含有单一激发下的双发射中心，从而证明了可将荧光素替换成钙黄绿素。
实施例4
由于碳点(CDs)组成和结构会影响发光性能，因此，本实施例中研究了荧光素和色氨酸的用量比、一锅溶剂热法的合成温度和时间对合成CDs组成和结构的影响，并以荧光发射峰的相对强度和半半峰宽为指标，对荧光素和色氨酸的用量比、合成温度及时间进行优化，结果如图4所示。
图4A中，荧光素和色氨酸的质量比分别为1：3、1：4、1：5、1：6和1：7；图4B中，合成温度分别为140℃、160℃、180℃、200℃和220℃；图4C中，合成时间分别为4h、6h、8h、10h和12h。从图4中可知，当荧光素和色氨酸的质量比为1：5(20mg：100mg)，合成温度为180℃，合成时间为8h时，获得的双发射CDs的荧光性质最佳。
检测分析
1、双发射碳点(B,G-CDs)的表征分析
将实施例1中制得的双发射碳点(B,G-CDs)进行透射电子显微镜(TEM)、XRD、Raman光谱和热重和导数热重分析。结果如图5所示。
从图5中分析可知，球形的B,G-CDs没有任何明显的聚集(图5A)，分散良好，尺寸分布为1.19-4.87nm(图5A左上插图)，平均直径约为3.12nm。高分辨率TEM(HR-TEM)图像(图5A右上插图)显示B,G-CDs的高结晶度，其晶格间距为0.28nm，与石墨烯(020)的面内晶格间距相一致。B,G-CDs的XRD图显示在以2θ＝21°有一个宽的衍射峰(图5B)，被指定为0.42nm的石墨层间距。在拉曼光谱(图5C)中，B,G-CDs没有明显的D和G波段，可能是由于在拉曼表征过程中B,G-CDs的高荧光引起的干扰。如图5D所示，TG和衍生热重分析(DTG)被用来分析B,G-CDs的化学结构。TGA和DTGA曲线显示，B,G-CDs有四个降解过程。在110℃之前，最初的成分损失来自于B,G-CDs中结合水的蒸发。在160-360℃的第二阶段，质量迅速下降，与CDs表面的官能团(如羧基、羰基、氨基)的分解有关。第三阶段从360-550℃，B,G-CDs质量的下降是由碳核中sp3碳的热解引起的。在550℃之后，B,G-CDs的石墨碳分解引起它们的质量损失。可以观察到的是，第四阶段的质量分解率没有第三阶段那么快，从而证明了B,G-CDs内部有丰富的sp3缺陷位点。
2、双发射碳点(B,G-CDs)的表面组成的表征分析
对实施例1中制得的双发射碳点(B,G-CDs)的表面化学基团进行表征，结果如图6所示。
通过红外(IR)光谱鉴定B,G-CDs表面化学基团的结果如图6A所示，从图6A中可知，在3460-3130cm-1出现的宽IR吸收归属于O-H和N-H的特征伸缩振动。亲水基团的存在表明B,G-CDs具有优异的水溶性。而出现在1595cm-1、1385cm-1和1108cm-1的吸收峰分别归属于C＝O键、C-N键及C-O键的伸缩振动。
通过X射线光电子能谱(XPS)做更深入地探究B,G-CDs元素分布和基团组成，结果如图6B和表3所示，从图6B的XPS谱图中可知，出现以284.80eV、400.11eV和532.44eV为主的结合能吸收峰，分别归属于C1s、N1s和O1s。C、N和O元素的百分含量分别为78.98％、7.10％和13.92％(表3)。高分辨C1s光谱被拟合为位于283.9eV、285.6eV、287.4eV和290.4eV的四个峰，分别对应于C-C/C＝C、C-N、C-O和-COOH(图6C)。高分辨N1s光谱被拟合为两个峰值，分别为399.1eV的C-N键和400.0eV的N-H键(图6D)。在图6E所示的O1s高分辨光谱中，分别在531.0eV和532.60eV处检测到C＝O和C-O的峰。由上可知，XPS的结果与FT-IR的结果一致，从而证明了B,G-CDs表面存在大量的官能团。
表3碳点表面各组成元素及比例
3、双发射碳点(B,G-CDs)的光学性质及其荧光起源分析
通过测定实施例1中制得的B,G-CDs水溶液(即离心纯化后的上清液)的紫外-可见吸收和荧光光谱，以研究其光学性质，结果如图7所示。图7A显示，吸收峰中心位于280nm处，可能来自芳香共轭体系中的π-π*跃迁，并表示为伴随最高能级的核心态。而在410-500nm之间，出现较低的能量吸收带，可能源于B,G-CDs表面状态官能团C＝O的n-π*跃迁。图7A中的插图中，左右比色皿的照片分别为激发波长280nm和白光下的可视化图，颜色分别为黄色和绿色。图7B表明，B,G-CDs在单波长激发下显示出双发射行为。每隔10nm调节激发波长扫描，得到的发射光谱显示，蓝色和绿色发射是激发独立，可能与B,G-CDs本身内在因素有关。在280nm波长激发时，B,G-CDs显示最佳荧光强度的蓝色峰(420nm)和适宜荧光强度的绿色峰(516nm)，与B,G-CDs的3D荧光光谱(图1F)结果相同。因此，选择280nm作为B,G-CDs的最佳激发波长。
通过测定实施例1中制得的B,G-CDs水溶液(即离心纯化后的上清液)的紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、荧光量子产率、TG曲线，以研究双发射碳点发光中心的来源。
其中，B,G-CDs水溶液的荧光量子产率(QYs)是通过参考标准来测量的。硫酸奎宁(在0.10mol/LH2SO4中，QYs＝54％)和荧光素(在0.10mol/LNaOH中，QYs＝95％)分别被选作B,G-CDs水溶液的蓝色和绿色发射的参考标准。经过以下公式计算B,G-CDs水溶液的荧光QYs：
式Ⅰ中，Grad表示荧光积分强度与吸光度呈现的线性斜率；η表示溶剂的折射率；ST表示参考标准；X表示B,G-CDs；Φ表示荧光QYs。
首先，测定B,G-CDs水溶液的激发光谱和紫外-可见吸收光谱，结果如图8A。从图8A中分析可知，蓝色发光中心的激发光谱显示230-320nm的主要激发波段，与245nm-315nm的吸收带大部分重叠，且吸收带最大吸收峰位置(280nm)和最大激发峰位置(284nm)相差不大。从而证明了B,G-CDs的蓝色发光中心可能与sp2域相关的碳核态有关。
同时，将B,G-CDs溶解在不同极性溶剂中，如图8B所示，从图8B中分析可知，相比于绿色发射中心在一定程度上的红移或蓝移，位于420nm处的蓝色峰只有荧光强度的变化，而没有峰位置的移动。结果表明，溶剂的极性对B,G-CDs的蓝色发光中心没有明显的影响。以硫酸奎宁为标准，测定B,G-CDs水溶液的蓝色荧光量子产率，结果如图9A所示，从图9A中可知，B,G-CDs水溶液的蓝色荧光量子产率为0.67％。从而证明了，蓝色荧光的发射激发独立，量子产率低，且不易受到溶剂等外部化学环境的影响，这与碳核态发光的特征一致。因此，将420nm处的蓝色发光中心归因于碳核态。
而以516nm为中心的绿色发射易受到溶剂等外界因素的影响(如图8B)。一般来说，以分子态或表面态主导的发光中心都易受到外界因素的影响，但是分子态发光控制的荧光赋予CDs高量子产率。如图9B，测得B,G-CDs在水中的绿色荧光量子产率为9.80％。这可初步判断绿色发射来源于碳主链相连的官能团(表面态)。
在不同温度(150℃和280℃)恒温加热40min后B,G-CDs的TG/DTG曲线如图10
A所示，从图10A中可知，B,G-CDs在150℃条件下，由于其主要化学结构在150℃时未被破坏，引起其重量稍微下降至不变，但在280℃时由于其表面官能团被分解，导致其重量急剧下降。如图10B，三种温度条件下浓度相同的B,G-CDs水溶液的荧光光谱显示，150℃处理的B,G-CDs绿色发射峰的荧光强度接近于未处理(25℃)的B,G-CDs，而在280℃处理的B,G-CDs的荧光强度由于B,G-CDs表面官能团的降解而急剧下降。图10B右上角插图显示，B,G-CDs在不同温度，激发为280nm紫外光下，恒温150℃处理后B,G-CDs颜色和未处理(25℃)的基本一致，但都与280℃处理之后的完全不同。这可能是由于控制绿色发射表面态的官能团处于较高温度之下被分解。上述结果表明，B,G-CDs的绿色发射中心来源于表面态。
由上所述可知，如图11所示，以420nm为蓝色发光中心来源于碳核态发光，而516nm的绿色发光中心归属于表面态发光。
4、B,G-CDs传感色氨酸和pH的分析
将实施例1中制得的B,G-CDs在280nm波长下进行激发，并制成比率荧光探针用于色氨酸和pH的检测，结果如图12所示。
从图12中可知，在激发为280nm波长下，B,G-CDs表现出以碳核态为主要发光源的蓝色荧光和受表面态控制的绿色荧光的双发射。基于B,G-CDs的比率荧光探针实现了对Trp相反信号的传感，即检测信号为一升一降，检测限(LOD)低至30.5nmol/L，线性范围为0.40-150μmol/L。在280nm波长的紫外灯照射下，加入的Trp使得B,G-CDs水溶液荧光颜色从绿变化为浅蓝。同时，B,G-CDs还表现出强烈的pH敏感性，响应的线性范围为2.71-10.29，即达到酸中碱的宽范围pH传感。
5、稳定性分析
稳定性是B,G-CDs能够用于制备比率纳米探针的重要基础。为此，评估离子强度、强光照射和存储在4℃冰箱等外部环境条件下B,G-CDs双峰的荧光强度。
首先，研究离子强度对实施例1中制得的B,G-CDs的荧光强度的影响如图13A所示。从图13A中可知，随着NaCl溶液浓度逐渐增加，B,G-CDs的420nm峰强度几乎保持不变，516nm峰强度变化较小，表明B,G-CDs基本不受离子强度的影响，具有良好的稳定性。且证明了B,G-CDs在高盐度样品基质的生化环境中应用非常有利。
然后，研究强光照射对实施例1中制得的B,G-CDs的光稳定性的影响，结果如图13B所示。从图13B中可知，在280nm波长激发下连续光照30min，以420nm和516nm为中心双发射峰的荧光强度仍保持相对稳定，表明了B,G-CDs具有显著的抗光漂白性质。
最后，研究外部环境条件对实施例1中制得的B,G-CDs的双峰的荧光强度的影响，结果如图13C所示。从图13C中可知，B,G-CDs在4℃冰箱长期储存后，双发射峰荧光强度几乎没有受到影响。
由上可知，B,G-CDs具有优异的耐盐性、低光漂白和存储稳定性，有助于扩大其在复杂样品分析中的应用。
6、比率荧光传感pH分析
改进比率荧光传感pH的实验条件，包括温度和时间，使得基于实施例1中制得的B,G-CDs荧光探针和pH的响应情况达到最好。整个传感条件过程中，以F516/F420为优化基准，用B-R缓冲液调整pH数值，结果如图14A所示。从图14A中可知，F516/F420数值在8min后，在30min内基本保持不变。由此确定其孵育时间为8min。
同时，评估温度对于pH传感的影响，结果如图14B所示，由图14B可知，随着实验温度的增加，F516/F420值也随之变大。这可能是由于在pH传感过程中，B,G-CDs表面不同官能团的质子化-去质子化和电荷转移过程受到温度影响。考虑到实验的快速操作和简便性，选择25℃作为pH检测的实验温度。因此，以8min的孵育时间和25℃的反应温度为标准进行后续的pH传感实验。
在优化实验条件下，将该探针用于pH的比率荧光传感，具体操作为：在2mL离心管中加入200μLB,G-CDs。接着将不同数值pH的Britton-Robinson(B-R)缓冲液100μL加入B,G-CDs中。然后用去离子水将容量调至1mL，剧烈涡旋一段时间，在室温下培养一段时间，扫描其发射光谱，结果如图15所示。从图15A中可知，当pH值从2.41增加到10.29时，420nm峰的荧光强度基本保持不变，516nm峰的荧光强度逐渐增强。且从图15B中可知，荧光强度比(F516/F420)和pH值在2.41-10.29范围内，呈现优异的Doseresp函数关系(相关系数(R2)＝0.9996)。从而证明了B,G-CDs可用作检测pH的灵敏探针。图15C中表明，加入不同pH值B-R缓冲液，体系的荧光从浅绿变成深绿，证明了B,G-CDs具有实现可视化分析pH的潜力。另外，由表4可知，与其他基于CDs测定pH荧光探针相比，此探针传感pH是宽范围的。
表4已报道基于碳点测定pH的荧光分析参数。
为了判断此荧光探针传感pH的普适性，我们做了磷酸氢二钠-柠檬酸(Na2HPO4-CA)缓冲、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾(Na2HPO4-KH2PO4)缓冲和磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)缓冲的pH分析实验，结果如图16所示。
从图16中可知，F516/F420数值分别和pH值为4.00-7.62范围的Na2HPO4-CA缓冲，pH值为5.50-7.50范围的Na2HPO4-KH2PO4缓冲，pH值为5.50-7.60的KH2PO4-NaOH缓冲均呈现良好的Doseresp函数关系(R2分别为0.9987，0.9910，0.9998)。这些结果表明该荧光探针传感pH，只与其数值大小有关，与其缓冲种类无关。
同时，还考察pH传感体系的抗干扰能力。选择常见的金属阳离子(包括Zn2+、Mn2+、Mg2+、Cr3+、Mo2+、Cu2+、Pb2+、Ba2+、Ni2+、Co2+、Ce3+、Ce4+)、阴离子(包括SCN-、NO3 -、F-、BrO3 -、SO4 2-、CH3COO-、H2PO4 2-、CO3 2-)及有机小分子(包括葡萄糖、甘氨酸、半胱氨酸、桑色素、卡普托利、丙烯酰胺、抗坏血酸、谷胱甘肽、乙酸、赖氨酸)作为干扰因素探讨体系的抗干扰能力。所有干扰物的最终浓度均为50μmol/L。在室温下，选用不同pH的B-R缓冲液，将体系调控至pH为5.0、7.0和9.0，并向其中加入不同的干扰因素，结果如图17所示。
从图17中可知，在三种不同pH的缓冲体系中，含有干扰物质的发射光谱的曲线和空白组曲线趋势基本一致，从而证明了，基于B,G-CDs传感pH的体系具有卓越的抗干扰能力。因此，B,G-CDs是传感pH的优良比率荧光探针。
为保证此探针的实用性，进一步研究了pH传感的可逆循环行为。用0.10mol/LNaOH或0.10mol/LHCl调节体系的pH到3.5或10，结果如图18A所示。
从图18A中可知，F516/F420数值在可逆循环12次内，在pH为3.5或10时基本没有发生变化。
此外，还研究了不同pH值(5.0和9.0)B-R缓冲的离子强度稳定性。在0-1mol/LNaCl存在的条件下，F516/F420数值维持不变(图18B)。
由上可知，此探针传感pH，表现出了卓越的荧光可逆性和耐盐性。因此，进一步证明了B,G-CDs可以用做pH测量的优良比率荧光探针。
基于上述结果可知，该探针传感pH具有优异的实用性。为此，通过直接测定当地超市中电解质水、苏打水等实际样的pH，评估此荧光探针所建立的比率荧光法的实用性，结果如表5所示。
从表5中分析可知，测定结果的相对标准偏差(RSD)不超过0.39％，证明此探针传感pH的比率荧光分析法的准确度极高。此外，测定pH的计算结果和梅特勒FE20pH计所测结果相差不大，证明了建立pH的分析方法的可靠性。
表5超市销售饮料pH的测定
pH1是由本研究建立pH分析方法计算得；pH2是由梅特勒FE20pH计测得。
7、基于相反信号的B,G-CDs传感Trp分析
为使基于实施例1中制得的B,G-CDs荧光探针和Trp的响应情况达到最佳，我们优化了pH数值大小、pH种类、孵育时间、温度和离子强度等实验条件。优化过程中，Trp的浓度始终为70μmol/L，结果如图19A所示。从图19A中可知，使用pH为2.82-12.00范围的B-R缓冲液优化pH值，在pH值为11.0时，F’/F(F’和F代表分别在B,G-CDs水溶液中加入和不加入Trp的F420/F516比值)达到最大值。F’/F值从2.82-12.00先增加，后基本稳定，可能是由于B,G-CDs的pH依赖性。
接着，使用pH数值位于11.00的B-R、Na2HPO4-NaOH、NaHCO3-NaOH、Na2CO3-NaHCO3四种缓冲液优化pH类别，结果如图19B所示。从图19B中显示，在B-R缓冲液中，F’/F达到最大值。
此外，研究了B,G-CDs和Trp的响应时间，结果如图19C所示。从图19C中可知，在18min后，F’/F值在30分钟内保持不变。另外，还研究了该传感体系的温度(图19D)和离子强度(图19E)，结果如图19D和图19E所示。从图19D中可知，F’/F值在体系温度5-25℃达到稳定，30℃之后逐渐减小。这可能是由于温度过高，分子热运动加快。从图19E中可知，F’/F值在0-0.7mol/L范围内的NaCl中变化不大，但在0mol/LNaCl中数值最大。
由上可知，Trp检测的实验条件为pH值为11.00的B-R缓冲液，18min的孵育时间，不引入NaCl和25℃的响应温度。后续的Trp传感体系，均使用此条件进行。
基于以上优化条件下，确定Trp浓度和基于B,G-CDs荧光探针的响应关系，具体操作为：在2mL离心管中加入200μL实施例1中的B,G-CDs水溶液(即离心纯化后的上清液)，和100μLBritton-Robinson(B-R)缓冲液(pH为11.0)。然后在上述混合溶液中加入不同浓度的Trp，并用去离子水将容量调至1mL，维持其最终浓度为0-150μmol/L。混合后的溶液剧烈涡旋一些时间后，在室温下放置一段时间，记录280nm波长激发下的荧光光谱，结果如图20A所示。图20A中表明，随着Trp的浓度逐渐增大，420nm荧光强度逐渐增强，然而516nm处的荧光强度逐渐减弱。但发现，如图20B所示，F420/F516数值和0.40-150μmol/LTrp呈现优异的一次函数关系(线性方程为Y＝0.02386X+0.1281，Y是F420/F516数值，X是Trp浓度，线性相关系数(R2)为0.9992)。根据检测限(LOD)公式3σ/k(其中3是信噪比，σ是空白样品的标准偏差(n＝9)，k是低浓度线性斜率)，计算得到LOD为30.5nmol/L。此外，如图20C所示，随着Trp浓度逐渐增加，B,G-CDs水溶液在激发为280nm波长的紫外灯下，荧光颜色发生转化。具体而言，荧光颜色从深绿变化到浅绿，再到蓝绿，最后变化到浅蓝。图20D中的CIE坐标也验证，随着Trp的加入，荧光从绿变化浅绿，再到青，最后到浅蓝。由表6可知，基于B,G-CDs构建的相反信号比率荧光探针用于Trp传感是极其稀少的。此外，与其他检测色氨酸的荧光分析法比较，本发明分析方法有如下优点：灵敏度比之前大多数高，线性范围宽，可视化效果较好，材料制备简单。
表6基于荧光分析法测定色氨酸的比较。
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8、Trp的传感机制分析
通过测定紫外-可见吸收光谱、荧光寿命、荧光光谱、红外光谱等实验研究实施例1中制得的B,G-CDs和Trp的相互作用机制。
首先，研究了B,G-CDs绿色发射被Trp猝灭的原因。测定了Trp的吸收曲线和B,G-CDs的激发光谱，结果如图21A所示。从图21A中可知，Trp在280nm处有一个大吸收带，与B,G-CDs的516nm发射下的激发带重叠，表明Trp可能通过内部过滤效应(IFE)使得B,G-CDs的绿色荧光减弱。发生IFE过程时，因为Trp会竞争吸收激发B,G-CDs电子跃迁的能量，不会影响激发态电子的光物理过程，所以B,G-CDs的荧光寿命在响应前后基本不变。测定了加入Trp前后B,G-CDs的516nm峰的荧光寿命，结果如图21B所示。图21B中，根据单指数函数拟合结果可知，B,G-CDs的平均荧光寿命在引入Trp前后，分别为4.183ns和4.229ns。基本保持不变的寿命，进一步说明B,G-CDs的绿色荧光被猝灭的机制为IFE。
其次，研究了传感过程中蓝色荧光被增强的原因。测定了420nm发射下Trp溶液和加入同浓度Trp前后B,G-CDs的激发光谱，结果如图21C所示。从图21C中，可以观察到，含Trp的B,G-CDs和Trp的最大激发峰强度相差不大，且两者强度都比B,G-CDs大许多。Trp中存在羧基、氨基和较大的π电子共轭体系。B,G-CDs的XPS和IR光谱表明其存在氨基、羧基和羟基等官能团。当两者组成同一体系时，B,G-CDs和Trp的多种基团互相发生缩合等化学反应，形成稳定的结构。这样就会扩展B,G-CDs的π共轭体系，使得高能量的激发态电子被稳定，增加蓝色荧光的辐射跃迁概率，减小非蓝色荧光辐射跃迁的几率。此机制在加入Trp前后的B,G-CDs的傅里叶红外光谱中也得到了证实。如图21D，相对于加入Trp之前，加入Trp之后的B,G-CDs红外吸收增强，特别是3050cm-1的＝C-H键和1655cm-1的C＝C键。这些结果更进一步的证明了此前蓝色荧光被增强的机制。
由上可知，加入Trp使得B,G-CDs的π共轭体系扩展而导致蓝色荧光增强，同时通过IFE使得绿色荧光减弱。
9、选择性及实际样检测分析
基于实施例1中制得的B,G-CDs相反信号的比率荧光探针的选择性是在复杂样品中感应Trp的一个关键参数。为此，研究了B,G-CDs对Trp的选择性。具体为：选用19种天然氨基酸(包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val))和16种常见的离子(分别为Zn2+、Cr3+、Mg2+、Mo2+、Fe3+、Ca2+、Ba2+、SCN-、ClO-、BrO3-、SO4 2-、HPO4 2-、HPO4 -、MnO4 -、F-、HCO3 -、CO3 2-)作为干扰物。其中，Trp、Tyr和ClO-的浓度均为100μmol/L，Cr3+、Mo2+和Fe3+的浓度均为50μmol/L，而其余干扰物的浓度为500μmol/L。准备了两组碳点和干扰物的溶液。第一组中的空白为纯碳点溶液，实验组为碳点和各干扰物的混合溶液；第二组中的空白为碳点纯溶液，实验组为干扰物、Trp和碳点的混合溶液。
第一组的检测结果如图22A所示，除开含Trp的B,G-CDs溶液外，干扰物混合溶液的发射光谱与纯碳点溶液的荧光发射几乎相同。且从图22B和图22C中可知，只含有Trp的B,G-CDs处理的F420/F516数值最大，其余数值基本一致。图22B和图22C的插图也显示，在280nm波长的紫外灯下，只含有Trp溶液荧光颜色变为浅蓝色。上述结果均证明了B,G-CDs对Trp具有优秀的选择性。
第二组的检测结果如图22D所示，与纯碳点溶液相比，所有溶液的荧光光谱发生相似的变化。且从图22E和图22F中显示，实验组F420/F516数值差别不大，均与空白组相差很大，从而证明了B,G-CDs传感Trp时具有良好的抗干扰能力。
由上所述，B,G-CDs对Trp的选择性很高，可以抵御多种干扰物的影响。证明了B,G-CDs在测定含Trp的实际样中具有巨大的潜在应用价值。
为了评估相反信号的比率荧光探针在实际应用中的潜力，进行了实际样品检测的实验。具体为：选择嘉陵江江水、实验室得到的自来水和当地超市购买的牛奶等实际样品进行标准添加回收实验，结果如表7所示。
从表7中可知，在上述这些真实样品中，Trp的加标回收率为92.96％-115.41％，证明了具有良好的回收性能。从表7中还可知，相对标准误差(RSD)不超过4.59％(n＝5)。从而证明了，基于B,G-CDs信号相反的荧光探针在水、尿液和牛奶中测定Trp的比率法是可靠的。
表7不同种类实际样中Trp的加标回收
综上所述，本发明的一种具有pH识别功能，用于Trp传感的B,G-CDs，具有良好的稳定性和优异的光学性质。本发明的B,G-CDs的制备方法，通过简单的一锅溶剂热法合成，具有制备方法简单、条件温和和适宜工业化应用的优点。本发明的B,G-CDs经实验证明，蓝色发射受碳核态控制，绿色发射受限于表面态。20种天然氨基酸和多种离子的加入，只有Trp经由内滤效应和扩展B,G-CDs的π共轭体系使B,G-CDs呈现相反信号的变化，即合成的B,G-CDs对Trp具有优异的比率感应特性和高选择性，线性检测范围为0.40-150μmol/L，检测限低至30.5nmol/L。此外，B,G-CDs还和2.71-10.29的pH范围呈现卓越的曲线变化(相关系数R2＝0.9998)。而且B,G-CDs在定量检测实际样中的Trp和pH显示了优异的抗干扰性能。本发明的B,G-CDs为基于双发射碳点的多功能传感提供了潜在的应用价值。
以上实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双发射碳点，其特征在于，所述双发射碳点采用荧光物质、色氨酸和有机溶剂，经一锅溶剂热法制得。
2.根据权利要求1所述的双发射碳点，其特征在于，所述荧光物质选自荧光素或钙黄绿素。
3.根据权利要求1所述的双发射碳点，其特征在于，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和乙醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的双发射碳点，其特征在于，所述双发射碳点在280nm的激发光下具有以420nm和516nm为中心的双发射峰。
5.一种如权利要求1至权利要求4所述的双发射碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将荧光物质和色氨酸分散到有机溶剂中，然后置于反应釜中，进行加热反应，冷却至室温，加入水，离心纯化，取上清液，通过透析膜进行透析，冷冻，干燥，获得粉末双发射碳点。
6.根据权利要求5所述的双发射碳点的制备方法，其特征在于，所述荧光物质和色氨酸的质量比为1:3~1:7。
7.根据权利要求5所述的双发射碳点的制备方法，其特征在于，所述加热温度为140℃~220℃，所述加热时间为4~12h。
8.一种如权利要求1至权利要求4所述的双发射碳点的应用，其特征在于，所述双发射碳点在检测色氨酸和pH值中的用途。
9.根据权利要求8所述的双发射碳点的应用，其特征在于，所述双发射碳点用于制备检测色氨酸的比率荧光探针，检测的线性范围为0.40-150 μmol/L，检测限为30.5 nmol/L。
10.根据权利要求8所述的双发射碳点的应用，其特征在于，所述双发射碳点用于制备检测pH值的比率荧光探针，pH响应的线性范围为2.71-10.29。
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