CN116768706A - 咖啡果皮中降糖活性二萜成分及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供Caffpulpine A、Caffruenol B及其制备方法和降糖活性的应用。属于药物技术领域。本发明从咖啡果皮中提取具有降糖活性活性分子1（Caffpulpine A）系咖啡果壳中发现的尚未发表的一类新型二萜结构，为咖啡二萜结构中C环、D环开裂的二环二萜化合物，具有较强α‑葡萄糖苷酶抑制活性；活性活性分子2（Caffruenol B），系咖啡豆中发现的重排的新类型咖啡二萜，其α‑葡萄糖苷酶抑制活性很强，与一线临床药物阿卡波糖的活性接近。这两个活性结构能用于制备治疗糖尿病的药物，也是咖啡果壳的一个新功能。
Description
技术领域
本发明属于食品、医药技术领域，具体涉及咖啡果皮中降糖活性咖啡二萜及其制备方法与应用。
技术背景
咖啡是人们喜爱的一种饮品和食品，在世界上有独特影响。而作为咖啡产业的副产物，就是咖啡生豆加工过程中的咖啡鲜果壳，数量巨大。为了避免资源浪费和环境污染，有很多咖啡果壳干燥后作为生物质燃料烧掉，但也造成了活性分子资源的巨大浪费，为了充分利用咖啡果壳，各地出现了咖啡果皮茶的产品。咖啡果皮茶口感好，果酸舒适，色泽金黄或橘红清澈透亮，是一类崭新的特色产品。但咖啡果壳的功能物质成分处咖啡的主成分分析之外，鲜有深入研究。
本发明人一直在咖啡二萜的新型结构及其活性上深度挖掘，将已经发表的咖啡二萜化合物和类似化合物的13C NMR，组建咖啡二萜数据库；进行粗提物的13C NMR与数据库对比，快速分析粗提物中主要的二萜化合物，对粗提物选择性纯化，快速发现并分离鉴定新活性二萜化合物。利用这一技术，从云南咖啡中发现了100多个新咖啡二萜类化合物，包括氧化型二萜、重排型二萜、呋喃型二萜、内酰胺型二萜、内酯型二萜、Δ4,18型二萜、降解型二萜、维拉诺瓦型二萜和阿替生烷型二萜。最近将该技术应用于咖啡果皮中活性二萜成分的研究，发现咖啡果皮中的二萜除主要咖啡二萜成分之外，还有特征的一些二萜成分，目前鉴定了共分离鉴定了18个化合物，经过α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，发现咖啡果皮中潜在降糖活性最好的一个活性分子2是本发明人从咖啡豆发现的Caffruenol B(Wang Xia etal.，Fitoterpia,2019,132:7-11)，这是一个重排的咖啡二萜新结构类型，发表时进行了生源合成途径推定，但没有做过α-葡萄糖苷酶抑制活性。而其它新的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的活性分子也没有报道过。
发明内容
基于现有技术存在的上述不足之处，本发明旨在首次提供属Caffruenol B该类结构的降糖活性。此外，从咖啡果皮中提供具有降糖活性活性分子1(Caffpulpine A)，系咖啡果壳中发现的尚未发表的一类新型二萜结构，为咖啡二萜结构中C环、D环开裂的二环二萜化合物,命名为咖啡果壳素A(Caffpulpine A)。从咖啡果壳中发现的具有较强α-葡萄糖苷酶抑制活性的活性分子2(Caffruenol B)，系咖啡豆中发现的重排的新类型咖啡二萜，其化学结构在咖啡二萜中是十分特殊的。其α-葡萄糖苷酶抑制活性很强，与一线临床药物阿卡波糖的活性接近。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
如下结构式所示的化合物Caffpulpine A，
药物组合物，其由所述的化合物Caffpulpine A，和至少一种可药用载体所组成。
所述的化合物Caffpulpine A的制备方法，该方法包括下述步骤：取咖啡鲜果，脱壳后日晒干燥，将干燥咖啡果壳粉碎之后用3-5倍量甲醇浸泡提取二次，每次提取时间分别为24h，合并提取液，减压回收溶剂得到浓缩浸膏甲醇提取物，将浸膏分散在水相中，依次用石油醚，乙酸乙酯进行萃取，分别得到两个部分浸膏石油醚部位和乙酸乙酯部位；乙酸乙酯部位浸膏上正相硅胶柱，以二氯甲烷/甲醇为流动相50:1、20:1、10:1、2:1、1:1、0:1，v/v进行流份分段得到八个组分段Fr.A→Fr.H；对Fr.C部分利用C18反相色谱柱，以水/乙腈85:15→70:30,v/v进行柱层析分离得到Caffruenol B；对Fr.E部分利用C18反相色谱柱，以水/乙腈80:20→65:35,v/v进行柱层析分离得到Caffpulpine A。
所述的化合物Caffpulpine A在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
所述的药物组合物在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
药物组合物，其由如下结构式所述的化合物Caffruenol B，和至少一种可药用载体所组成，
如下结构式所示的化合物Caffruenol B在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用，
所述的药物组合物在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
本发明化合物Caffruenol B、Caffpulpine A用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体
所述的药用载体是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经多种形式(液体制剂、固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、复方制剂)给药。
附图说明
图1活性分子1和2的制备工艺流程图；
图2活性分子1(Caffpulpine A)的化学结构式；
图3活性分子1的X-ray单晶衍射分析结构。
图4活性分子2(Caffruenol B)的化学结构式。
具体实施方式
下面结构附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
活性分子1(Caffpulpine A)和2(Caffruenol B)的制备。
云南咖啡DR155品种，该品种为云南省农业科学研究所的咖啡品种(国家审定品种：德热3号)，取其咖啡鲜果脱壳后，将果壳日晒干燥。将干燥咖啡果壳12kg粉碎之后用3-5倍量甲醇浸泡提取二次，每次提取时间分别为24h，合并提取液，减压回收溶剂得到浓缩浸膏甲醇提取物2.1kg，将浸膏分散在水相中，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取。首先用石油醚进行萃取，每次6L，萃取2次，石油醚萃取液减压浓缩，得到石油醚部位(FPE)180g；之后用乙酸乙酯进行萃取，每次6L，萃取2次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到乙酸乙酯部位(FEA)220g。
乙酸乙酯部位(FEA)浸膏220g上正相硅胶柱，以二氯甲烷/甲醇为流动相(50:1、20:1、10:1、2:1、1:1、0:1，v/v)进行流份分段得到八个组分段(Fr.A→Fr.H)。对Fr.C(得率0.004％-0.008％)部分利用C18反相色谱柱，以水/乙腈(85:15→70:30,v/v)进行柱层析分离得到活性分子2(Caffruenol B)50mg。对Fr.E(得率0.008％-0.017％)部分利用C18反相色谱柱，以水/乙腈(80:20→65:35,v/v)进行柱层析分离得到活性分子1(Caffpulpine A)12mg。
制备工艺流程如图1。根据实验过程分析总结，目标活性分子1和2制备工艺流程归纳如图1。
目标活性分子1(Caffpulpine A)的结构表征。
1)活性分子1(Caffpulpine A)的化学结构(图2)
2)活性分子1(Caffpulpine A)的结构表征
Caffpulpine A：白色无定形粉末,分子式C20H36O4。[α]24 D-5.60(c 0.17,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε):203.5(3.84),274.5(2.69)；IR(KBr)vmax:3413,2962,2926,2853,1022cm-1；HRESIMS m/z 363.2500[M+Na]+,给出分子式C20H36O4Na(计算值：C20H36O4Na,363.2506)。
1H NMR(CD3OD,600MHz,J in Hz)δH:1.99(1H,m,H-1a),1.04(1H,m,H-1b),1.43(2H,m,H-2a),0.88(1H,brd,J＝3.5Hz,H-3a),1.90(1H,m,H-3b),1.33(1H,dd,J＝12.6,4.6Hz,H-5),1.21(2H,m,H-6),5.36(1H,m,H-7),1.59(1H,m,H-9),2.04(2H,m,H-11),1.74(1H,brd,J＝4.3Hz,H-12a),1.47(1H,brd,J＝4.3Hz,H-12b),3.45(1H,dd,J＝8.0,3.3Hz,H-14),3.54(2H,dd,J＝11.2,8.0Hz,H-15),1.12(3H,s,H-16),1.67(3H,s,H-17),0.92(3H,s,H-18),3.38(1H,d,J＝11.0,H-19a),3.80(1H,d,J＝11.0,H-19b),0.78(3H,s,H-20)。
13C NMR(CD3OD,150MHz)δC:40.50(CH2,C-1),19.58(CH2,C-2),36.61(CH2,C-3),39.22(C,C-4),52.83(CH,C-5),21.88(CH2,C-6),123.18(CH,C-7),136.89(C,C-8),57.24(CH,C-9),38.36(C,C-10),24.46(CH2,C-11),43.01(CH2,C-12),75.48(C,C-13),78.67(CH,C-14),64.20(CH2,C-15),22.19(CH3,C-16),22.74(CH3,C-17),27.61(CH3,C-18),64.77(CH2,C-19),15.25(CH3,C-20).
3)活性分子1(Caffpulpine A)的晶体结构
活性分子1(Caffpulpine A)的X-ray单晶衍射(Cu Kα)分析结果，证实了波谱分析表征的化学结构(图3)。
目标活性分子2(Caffruenol B)的结构表征。
1)活性分子2(Caffruenol B)的化学结构(图4)
2)活性分子2(Caffruenol B)的结构表征。
Caffruenol B：白色无定形粉末,分子式C20H32O3。[α]24 D-24.1(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε):204(3.14),303(1.87)；IR(KBr)vmax:3415,3030,2933,1667,1430,1210,1150,1020,830cm-1；HRESIMS m/z 343.2243[M+Na]+给出分子式C20H32O3Na(计算值：C20H32O3Na,343.2244)。
1H NMR(CD3OD,600MHz,J in Hz)δH:1.54(1H,m,H-1a),1.60(1H,m,H-1b),1.54(1H,m,H-2a),1.63(1H,m,H-2b),2.65(1H,m,H-3a),1.65(1H,m,H-3b),1.70(1H,m,H-5),1.64(1H,m,H-6a),1.54(1H,m,H-6b),1.85(1H,m,H-7a),0.99(1H,m,H-7b),1.16(1H,d,J＝6.2Hz,H-9),1.51(1H,m,H-11a),1.62(1H,m,H-11b),1.64(1H,m,H-12a),1.49(1H,m,H-12b),2.02(1H,brd,H-13),1.92(1H,m,H-14a),1.64(1H,m,H-14b),1.56(1H,m,H-15a),1.40(1H,m,H-15b),3.71(1H,d,J＝11.3Hz,H-17a),3.61(1H,d,J＝11.3Hz,H-17b),5.13(1H,t,J＝6.9Hz,H-18),4.11(2H,m,H-19),0.84(3H,s,H-20)。
13C NMR(CD3OD,150MHz)δC:41.6(CH2,C-1),23.8(CH2,C-2),30.4(CH2,C-3),144.9(C,C-4),54.0(CH,C-5),24.1(CH2,C-6),41.2(CH2,C-7),45.6(C,C-8),55.7(CH,C-9),42.5(C,C-10),19.9(CH2,C-11),27.0(CH2,C-12),46.2(CH,C-13),38.2(CH2,C-14),53.7(CH,C-15),82.9(CH,C-16),66.8(CH2,C-17),120.2(CH,C-18),59.0(CH2,C-19),15.7(CH3,C-20).
实施例2
活性分子1(Caffpulpine A)和2(Caffruenol B)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
1)实验原理
α-葡萄糖苷酶能催化α-1,4-糖苷键水解，使小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解。抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可使葡萄糖的生成及吸收减缓，降低餐后血糖峰值，调整血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为近年来药物化学的研究热点。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)是α-葡萄糖苷酶的特异性底物，PNPG能被α-葡萄糖苷酶水解产生对硝基苯酚(黄色)，该产物在405nm有特征吸收。通过对比化合物加入前后体系中对硝基苯酚的生成量，即可测定化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。实验选用阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照。
2)实验方法
i)溶液配制
a)磷酸盐缓冲液PBS(pH＝6.86):混合磷酸盐粉末加入500mL容量瓶中，加入无CO2蒸馏水至刻度，溶解摇匀后4℃保存备用。
b)底物溶液PNPG(2.5mM):精密称取PNPG共37.6mg，用上述PBS定容到50mL，溶解摇匀后4℃保存备用。
c)α-葡萄糖苷酶溶液(1U/mL):精密称取2.3mg(26U/mg)葡萄糖苷酶粉末，用上述PBS溶解配制到10U/mL,10U/mL管分装，于-20℃下保存备用。每次使用时再用PBS稀释10倍。
d)Na2CO3溶液(0.2M):称取无水Na2CO3粉末2.12g置于100mL容量瓶中，用上述PPBS定容到100mL，溶解摇匀后4℃保存备用。
e)样品溶液:单体化合物母液配制浓度20μmol/mL，阳性药母液配制浓度20μmol/mL。测定时将母液稀释到相应的倍数。
ii)α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定。
样品组:96孔板中依次添加40μL PBS缓冲液，10μL样品溶液，10μLα-葡萄糖苷酶溶液，于37℃预孵育10min，后加入50μL PNPG溶液，于37℃孵育60min，最后加入80μL Na2CO3溶液。
背景组:96孔板中依次添加50μL PBS缓冲液，10μL样品溶液，于37℃预孵育10min，后加入40μL PNPG溶液，于37℃孵育60min，最后加入80μL Na2CO3溶液。
对照组:96孔板中依次添加40μL PBS缓冲液，10μL阿卡泼糖溶液，于37℃预孵育10min，后加入40μL PNPG溶液，于37℃孵育60min，最后加入80μL Na2CO3溶液。
每组实验平行做三次，在酶标仪中检测405nm处的吸光度，根据以下公式计算出样品的酶抑制率:α-葡萄糖苷酶抑制率％＝(OD背景-OD样品)/OD背景×100％。
表1活性分子1和2对α-葡萄糖苷酶抑制活性及其IC50
实验结果表明：活性分子1对α-葡萄糖苷酶抑制活性接近一线临床α-葡萄糖苷酶抑制药物Acarbose。活性分子2也表现出一定活性。
制剂实施例1-7
1.取活性分子1或/和2，按其与赋形剂重量比1:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
2.取活性分子1或/和2，按其与赋形剂重量比1:2的比例加入赋形剂，制粒压片。
3.取活性分子1或/和2，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
4.取活性分子1或/和2，再按下述方法制成片剂：
5.胶囊剂：活性分子1或/和2 100mg，淀粉适量，硬脂酸模适量，制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
制备方法：搅拌下于适当体积的重蒸榴水中每次加入一种成分，直至完全溶解，然后再加入另一种成分。加水至2mL后，将该溶液在无菌过滤器上过滤，装入瓶中并按照适当的剂量分隔。
7.滴丸：取活性分子1或/和2 1g，聚乙二醇6000 9g。制法：按上述处方量称取活性分子1或/和2，加入适量无水乙醇，微热溶解后，加入处方量的聚乙二醇熔融液中(60℃水浴保温)，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽为止，静置于60℃水浴中保温30分钟，待气泡除尽，将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内，在80～85℃保温条件下，控制滴速，逐滴滴入冷凝液中，待冷凝完全，倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去丸上的冷凝液，放置硅胶干燥器中或自然干燥即可。
需要说明的是，在本发明的基础上，对活性分子1或/和2提取工艺以及结合α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法，证明活性分子1或/和2具有明显的降糖活性的方法等进行改进和若干修饰等皆属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.如下结构式所示的化合物Caffpulpine A，
2.药物组合物，其由权利要求1所述的化合物Caffpulpine A，和至少一种可药用载体所组成。
3.权利要求1所述的化合物Caffpulpine A的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：取咖啡鲜果，脱壳后日晒干燥，将干燥咖啡果壳粉碎之后用3-5倍量甲醇浸泡提取二次，每次提取时间分别为24h，合并提取液，减压回收溶剂得到浓缩浸膏甲醇提取物，将浸膏分散在水相中，依次用石油醚，乙酸乙酯进行萃取，分别得到两个部分浸膏石油醚部位和乙酸乙酯部位；乙酸乙酯部位浸膏上正相硅胶柱，以二氯甲烷/甲醇为流动相50:1、20:1、10:1、2:1、1:1、0:1，v/v进行流份分段得到八个组分段Fr.A→Fr.H；对Fr.C部分利用C18反相色谱柱，以水/乙腈85:15→70:30,v/v进行柱层析分离得到Caffruenol B；对Fr.E部分利用C18反相色谱柱，以水/乙腈80:20→65:35,v/v进行柱层析分离得到Caffpulpine A。
4.权利要求1所述的化合物Caffpulpine A在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
5.权利要求1所述的化合物Caffpulpine A在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
6.权利要求2所述的药物组合物在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
7.药物组合物，其由如下结构式所述的化合物Caffruenol B，和至少一种可药用载体所组成，
8.如下结构式所示的化合物Caffruenol B在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
9.权利要求7所述的药物组合物在制备降糖药物中，在制备治疗糖尿病的药物中，在制备α-葡萄糖苷酶抑制药物中的应用。
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