CN116763921A

CN116763921A - 电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN116763921A
Application number: CN202210239332.XA
Authority: CN
Inventors: 陶杰; 胡寅钦; 汤乐乐; 朱宇丹; 王晓丽; 肖倩
Original assignee: SHANGHAI PUTUO DISTRICT CENTRAL HOSPITAL
Current assignee: SHANGHAI PUTUO DISTRICT CENTRAL HOSPITAL
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明提供了一种电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗和/或预防癫痫。本发明首次通过实验证实，基因敲除或PAP‑1药理学阻断Kv1.3均能显著改善其癫痫发作的严重程度，减弱神经炎症反应，同时揭示了Kv1.3的选择性抑制剂在用于开发治疗和/或预防癫痫的药物中的重要价值。

Description

电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地涉及电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂及其应用。

背景技术

癫痫(Epilepsy)是一种由多种病因引起的慢性脑部疾病，以脑神经元过度放电导致反复性、发作性和短暂性的中枢神经系统功能失常为特征。在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，但以儿童和老年人发病率较高。全世界有约5000万人患有癫痫，我国的癫痫患者约有900多万，每年的新发病人大于40万，目前癫痫的治疗仍以药物为主要手段，约75-80％患者使用以上抗癫痫药物得以控制，但仍有25-30％癫痫患者对药物不敏感，发展为难治性癫痫。这不仅给癫痫患者的身心健康带来严重的影响，也给家属带来了沉重的经济负担，并带来一系列心理社会问题。近年来，癫痫与炎症的关系是一直癫痫领域的热点问题，并且有大量研究发现癫痫与炎症关系十分密切。然而，癫痫发作的机制尚未完全阐明，因此，研究癫痫发病机制并寻找新的更加安全有效、低不良反应的抗癫痫药物显得尤为重要。

在对多种神经炎症脑功能异常病的研究发现，一类被称为Kv1.3的钾离子通道，在脑内小胶质细胞的表达量显著升高。电压门控钾离子通道亚型1.3(Voltage gatedpotassium channel 1.3，Kv1.3)最早是在一种非兴奋性T淋巴细胞被发现鉴定，广泛表达于巨噬细胞、小胶质细胞和T淋巴细胞，在调节免疫细胞膜电位，Ca²⁺信号传导，细胞因子的产生和增殖中起重要作用。Kv1.3(kcna3)是属于Shaker型(Kv1，kcna)子家族的电压门控K⁺通道。由4个α亚基和4个β亚基共表达构成。每个α亚基具有6次跨膜片段(S1-S6)，其中S5-S6及中间的loop(P环)形成孔道，S4区段富含正电荷，与S1-S3中的酸性氨基酸共同起电压感受器的作用。β亚基为Kv1.3的组织特异性辅助亚基，主要发现有Kvβ1-β3(基因KCNAB1-3)等。值得注意的是，Kv1.3通道在小胶质细胞主导的神经炎症反应中起着非常重要的作用。多项研究证实，小胶质细胞Kv1.3可显著促进阿尔茨海默氏病和帕金森病的病理生理过程，但其在癫痫中扮演的角色尚未被揭示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂在癫痫治疗中的应用。

本发明的第一方面，提供了一种电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗和/或预防癫痫。

在另一优选例中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂选自下组：小分子化合物、核酸药物、多肽或蛋白类药物或其组合。

在另一优选例中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂选自下组：5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(PAP-1)；靶向Kv1.3的sgRNA、siRNA、shRNA、micrRNA及其前体或表达载体；或其组合。

在另一优选例中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂为5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(PAP-1)。

在另一优选例中，所述癫痫包括KA诱导型癫痫。

在另一优选例中，所述癫痫具有以下特征：小胶质细胞的Kv1.3通道在海马组织中表达上调。

在另一优选例中，所述“治疗和/或预防癫痫”包括：

(i)改善受试者的异常脑电信号，包括降低脑电频率和波幅，降低δ、θ、α、β、γ5种节律的能量强度；

(ii)抑制受试者体内炎症因子的表达和分泌，减轻神经炎症反应，其中，所述炎症因子包括：TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6或其组合；

(iii)逆转受试者体内被抑制的小胶质细胞迁移；

(iv)降低受试者癫痫发作等级、发作次数和强直痉挛发作持续总时长；

(v)改善受试者的学习记忆能力和认知障碍。

在另一优选例中，所述受试者患有或疑似患有癫痫。

在另一优选例中，所述受试者为人类或非人类哺乳动物(例如小鼠、大鼠)。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，和(a)电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂。

在另一优选例中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、口服剂型或外用药物剂型。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂或冻干制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂或组合物可单独使用，或联合使用。

在另一优选例中，所述的联合使用包括：与治疗和/或预防癫痫的其它药物联合使用。

在另一优选例中，所述治疗和/或预防癫痫的其它药物选自下组：

卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、口服或颅内方式给药。

在另一优选例中，所述药物组合物通过口服给药。

在另一优选例中，所述药物组合物通过微量输液泵(microinfusion pumps)进行施用。

在另一优选例中，所述药物组合物通过颅内给药进行施用，较佳地通过侧脑室注射(intracerebroventricular(ICV)delivery)施用于受试者体内。

在另一优选例中，所述受试者包括：哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。

本发明的第二方面，提供了一种组合物产品，所述组合物产品包括：

(Z1)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有第一活性成分(a)电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂，和药学上可接受的载体；以及

(Z2)第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有第二活性成分(b)治疗和/或预防癫痫的其它药物，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是不同的组合物。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是同一组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物产品含有：

(a)第一活性成分，所述第一活性成分为电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂；

(b)第二活性成分，所述第二活性成分为治疗和/或预防癫痫的其它药物；和

(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂如前所述。

本发明的第三方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：

(C1)第一容器，以及位于所述第一容器中第一药物组合物，所述第一药物组合物含有第一活性成分(a)电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂，和药学上可接受的载体；以及

(C2)第二容器，以及位于所述第二容器中第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有第二活性成分(b)治疗和/或预防癫痫的其它治疗药物，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药盒还包括(C3)说明书。

在另一优选例中，所述活性成分(a)如前所述。

在另一优选例中，所述活性成分(b)包括：卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其治疗和/或预防癫痫的其它药物的单方制剂。

在另一优选例中，所述说明书中记载了给予活性成分(a)和任选地活性成分(b)从而治疗和/或预防癫痫的说明。

在另一优选例中，所述说明书中记载了所述第一药物组合物和任选地第二药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述注射剂通过侧脑室注射(ICV)施用于受试者体内。

本发明的第四方面，提供了一种治疗癫痫的方法，所述方法包括：向受试者施用电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂，或本发明第二方面所述的组合物产品。

在另一优选例中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂为PAP-1。

在另一优选例中，所述受试者患有或疑似患有癫。

在另一优选例中，所述癫痫包括KA诱导型癫痫。

在另一优选例中，所述受试者包括：哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为Kv1.3在KA诱导的癫痫小鼠海马中的表达情况图。

图2为Kv1.3在同个癫痫病人海马组织的边缘区和核心区的表达及定位图。

图3为KA诱导的癫痫小鼠海马组织中TNF-α、IL-6和IL-10表达水平的WesternBlot检测结果图。

图4为KA诱导的癫痫小鼠海马中促炎因子TNF-α和IL-1β表达及定位的免疫荧光结果图。

图5为KA诱导的癫痫小鼠海马中抗炎因子IL-10表达及定位的免疫荧光结果图。

图6为KA诱导的癫痫小鼠海马中LC3B、LAMP1与IBA-1表达及定位的免疫荧光结果图。

图7为Kcna3基因敲除小鼠基因型鉴定结果图。

图8为Kv1.3 KO小鼠6h内癫痫发作等级和发作次数以及强直痉挛发作持续时长统计图。

图9为对小鼠进行Morris水迷宫定位航行实验的结果图。

图10为对小鼠进行Y迷宫空间探索实验的结果图。

图11为对小鼠进行在体多通道脑电记录的结果图。

图12为PAP-1治疗组小鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β表达水平的Western Blot检测结果图。

图13为PAP-1治疗组小鼠海马组织中Kv1.3表达水平的Western Blot检测结果图。

图14为PAP-1对KA诱导Bv2小胶质细胞迁移影响的划痕实验结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现电压门控钾离子通道Kv1.3及其选择性抑制剂在癫痫发生发展中发挥重要作用。本发明人通过实验证实，基因敲除或PAP-1药理学阻断Kv1.3均能显著改善其癫痫发作的严重程度，减弱神经炎症反应，意味着Kv1.3在癫痫的发病机制中起着关键性作用，同时揭示了Kv1.3的选择性抑制剂(例如PAP-1)在用于开发治疗和/或预防癫痫的药物中的重要价值。

具体地，本发明的技术方案如下：

1.以kcna3基因敲除(Kv1.3 KO)小鼠和C57BL/6野生型小鼠为对象，通过腹腔注射相应剂量的KA(30mg/kg)诱导癫痫模型；

2.对造模后的小鼠随机进行PAP-1药物干预；

3.通过免疫印迹和免疫荧光，小胶质细胞Kv1.3通道在KA诱导癫痫小鼠模型和癫痫患者海马组织中表达上调；

4.通过免疫印迹和免疫荧光，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10在KA诱导癫痫模型小鼠海马组织中表达上调；

5.通过行为学观察，Kv1.3的敲除和药理学阻断降低了KA诱导癫痫小鼠的癫痫发作等级、发作次数和强直痉挛发作持续总时长；

6.通过Morris水迷宫和Y迷宫，Kv1.3的敲除和药理学阻断改善了KA诱导癫痫小鼠的学习记忆能力和认知障碍；

7.通过在体多通道脑电，Kv1.3的敲除和药理学阻断降低了KA诱导癫痫小鼠的脑电频率和波幅，降低了δ、θ、α、β、γ5种节律的能量强度，改善了癫痫小鼠的异常脑电信号；

8.通过免疫印迹，PAP-1降低了KA诱导癫痫小鼠海马组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10的表达水平，而没有引起海马组织中Kv1.3通道表达水平的变化；

9.通过Bv2细胞划痕实验，PAP-1处理抑制了KA诱导的细胞迁移。

在此基础上，完成了本发明。

Kv1.3通道

电压门控钾离子通道亚型1.3(Voltage gated potassium channel 1.3，Kv1.3)广泛表达于巨噬细胞、小胶质细胞和T淋巴细胞，在调节免疫细胞膜电位，Ca 2+信号传导，细胞因子的产生和增殖中起重要作用。Kv1.3(kcna3)是属于Shaker型(Kv1，kcna)子家族的电压门控K⁺通道，在一种非兴奋性T淋巴细胞被发现鉴定。它由4个α亚基组成，其NH₂-和COOH-末端结构域均位于细胞内，每个α亚基具有6次跨膜螺旋(S1-S6)，S5和S6螺旋及其连接物形成高度保守的K+选择性孔区，S4螺旋富含正电荷，与S1-S3中的酸性氨基酸共同发挥着电压感受器的作用。

5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(5-(4-phenoxybutoxy)psoralen,PAP-1)

PAP-1是一种新型高效的特异性小分子Kv1.3通道阻滞剂，其化学式为：C₂₁H₁₈O₅，EC50为2nM，对Kv1.3的选择性是Kv1.5的23倍，是其他Kv1家族通道选择性的33到125倍，是Kv2.1，Kv3.1，Kv3.2，Kv4的500到7500倍。PAP-1能够穿过血脑屏障，可口服，被有效地应用于动物研究且未见明显细胞毒性作用。大鼠腹膜注射或口服PAP-1可有效抑制CD4+TEM细胞介导的迟发型超敏反应；在多种PD动物模型中，PAP-1的给药可以显著抑制神经变性和神经炎症；在AD小鼠模型中应用PAP-1口服治疗，减少了神经炎症和淀粉样蛋白沉积，并改善了行为缺陷；PAP-1给药可抑制CD8+T细胞的浸润并减少炎性细胞因子IFN-γ，IL-2和IL-17的产生，有效抑制变应性接触性皮炎；PAP-1因其高选择性、分子量小、无毒副作用等特点，显示了开发成为多种疾病治疗药物的价值。

小胶质细胞

小胶质细胞是中枢神经系统中胶质细胞的一种，在成年人大脑中约占胶质细胞总数的15％-20％。其作为中枢神经系统内的重要免疫细胞，在维持正常的大脑功能中发挥着重要作用。同样，小胶质细胞的活化在触发和维持神经炎症中扮演着重要角色。在正常的生理条件下，处于静息状态的小胶质细胞胞体较小，呈高度分支状态，其突起的伸长或收缩是检测衡量中枢神经系统微环境，吞噬凋亡坏死的神经元和外来病原体，保护神经稳态的形态指标；一旦受到外部刺激或在病理损伤情况下，小胶质细胞会被激活，发生形态表型的改变，胞体增大，分支减少缩短，呈阿米巴样，产生细胞因子以及包括IL-1β，IL-6和TNF-α等炎症介质，与免疫细胞相互作用协调免疫反应，介导神经炎症。在各种神经退行性和自身免疫疾病的病变周围能发现大量活化的小胶质细胞，例如阿尔兹海默症(Alzheimer’sdisease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)等。

IL-1β、IL-6、IL-10和TNFα

IL-1β(由单核一巨噬细胞分泌的细胞调节因子)属于是白介素-1家族。IL-1β及其受体广泛分布于大脑中，尤以海马中密度最高。它的异常表达和分泌过量通常被认为与一些常见的自身免疫性疾病的发生密切相关。IL-1β在癫痫患者和大鼠模型海马中的表达水平很高，且其作为免疫和炎症反应的关键调节因子被认为在癫痫发作中起着重要作用，其含量可以判断癫痫患者神经元的受损程度。此外，高浓度IL-1β显著降低了颞叶癫痫患者海马和皮质标本中的γ-氨基丁酸电流振幅，通过减少γ-氨基丁酸介导的神经传导促进癫痫发作。因此IL-1β是临床上评估癫痫患者预后的一个重要指标。

IL-6是一26KD的多肽，生物效应极为广泛，主要包括：①调节B细胞的生长和分化。②增强CTL、NK细胞的杀伤效应。③刺激造血干细胞的增生分化。④促进肝细胞合成急性相蛋白等，人体各个系统都有IL-6分泌细胞，因此，IL-6在维持机体生理平衡中具有十分重要的地位。已有大量实验资料表明，体内IL-6的异常与多种疾病有关。

白细胞介素10(IL-10)，也称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，是一种多效性细胞因子，可以在多种类型细胞中发挥免疫抑制或免疫刺激的作用。在人类，某些CD4+和CD8+T淋巴细胞、活化单核细胞、外周血T细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、星形胶质细胞、支气管上皮细胞、表皮细胞和某些肿瘤细胞均可产生IL-10；在某些因素刺激下，一些正常生理状态下不表达IL-10的细胞也可以生成IL-10。例如，动脉粥样硬化斑块中的血管平滑肌细胞在进行IL-10免疫组化染色时，其胞浆呈阳性反应。IL-10启动子含有数个转录因子反应元件，在受到相应的刺激后，可以启始IL-10基因的转录。巨噬细胞在受到几种内源和外源因子如内毒素、TNF-α、儿茶酚胺类等药物作用后，生成大量IL-10。此外，一些促炎因子可以反馈性地诱导IL-10的生成。

TNF-α是由单核巨噬细胞和淋巴细胞产生的一种具有多种生物学效应的细胞调节因子，有增强兴奋性神经介质谷氨酸的兴奋毒性作用。它在中枢神经系统内对海马CA3锥体细胞产生兴奋性影响，并能减弱抑制性突触后电位活动，最终导致癫痫样放电。TNF-α可诱导T、B淋巴细胞活化介导脑组织局部的炎症反应,还可增强IL-1对脑组织内皮细胞的损伤并破坏血脑屏障。因此，TNF-α主要是通过参与中枢神经系统的免疫性炎症反应介导癫痫的发生。

红藻氨酸(kainic acid,KA)

红藻氨酸(亦名海人藻酸)是从海人草中提取的一种兴奋神经毒性氨基酸类似物，科研者向大鼠杏仁核内注射红藻氨酸来研究海马的损害过程和癫痫的诱发机制。红藻氨酸的化学式是C₁₀H₁₅NO₄，分子量是213.23。红藻氨酸是兴奋性谷氨酸类似物，它具有确切的神经兴奋和神经毒性。红藻氨酸通过激活谷氨酸受体密集的海马，诱发边缘叶癫痫。腹腔注射红藻氨酸可诱发癫痫持续状态，与人类颞叶癫痫相似，伴有特异性的海马损害。

电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂

本发明的一个方面，提供了一种电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防癫痫的制剂或组合物的用途。其中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂包括(但不限于)小分子化合物、核苷酸、蛋白质或其组合。

如本文所用，术语“电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂”、“Kv1.3的选择性抑制剂”、“Kv1.3的阻滞剂”可互换使用，均指能够选择性地抑制Kv1.3活性，尤其是小胶质细胞高表达的Kv1.3活性的小分子化合物、核酸药物、多肽或蛋白类药物或其组合。在另一优选例中，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂选自下组：5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(PAP-1)；靶向Kv1.3的sgRNA、siRNA、shRNA、micrRNA及其前体或表达载体；或其组合。在另一优选例中，所述选择性抑制剂为PAP-1。

如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA，siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。

本文所用的术语“表达盒”是指包含本发明RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的RNAi前体。本文所用的术语“RNAi前体”是指可以在哺乳动物细胞中加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer、Ago2或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。

本文所用的术语“shRNA”是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由细胞内源的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer和Ago2等蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。

本文所用的术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。

如本文所用，术语“表达载体”指的是能将感兴趣的多聚核苷酸序列转移到目标细胞的载体。此类载体能自我复制或结合进宿主细胞染色体(宿主细胞有，例如原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体、和植物个体等)，并可在适合本发明多聚核苷酸转录的位点含有启动子。表达载体可包含结构基因和调控其表达的启动子，此外，还有能在宿主细胞中起作用的各种调控元件。本领域熟知，生物活体(如动物)的表达载体类型及所用调控元件的种类可根据所用宿主细胞的类型而改变。

可用于本发明的病毒载体没有特别限制，可以是任何能够利用病毒具有传送其基因组的特点，将遗传物质带入其他细胞，进行感染的病毒载体。可发生于完整活体或是细胞培养中。包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体。在本发明中，一种优选的表达载体是慢病毒载体。

药物组合物及其施用方法

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂和治疗和/或预防癫痫的其它药物活性成分。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明所提供的第一活性活性成分(a)电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂，可与第二活性成分(b)治疗和/或预防癫痫的其它药物联用。其中所述的第二活性成分(b)为现有技术中已经可用的抗癫痫药物，其包括但不限于：卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。

本发明所述的药物组合物的给药方式没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：静脉注射、皮下注射、肌肉注射、颅内注射、口服等。

治疗性应用

本发明还提供了一种治疗和/或癫痫的方法，包括向受试者施用电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂，或本发明第二方面所述的组合物产品。其中，所述癫痫优选为KA诱导型癫痫，例如KA诱导的小鼠癫痫。

在本发明的一个优选实施方式中，所述方法包括向受试者施用电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂PAP-1，从而药理性阻断Kv1.3，所述PAP-1的给药方式为口服给药。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明公开了Kv1.3在癫痫的发病机制中的关键性作用；

(2)本发明证实了基因敲除Kv1.3或用PAP-1药理性阻断Kv1.3对癫痫反复发作造成的神经功能缺损具有改善作用；同时可以减轻癫痫反复发作期间引起的神经炎症反应；

(3)本发明为利用Kv1.3的选择性抑制剂(例如PAP-1)作为治疗癫痫的一种新型药物提供了依据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

实验材料与方法

实验动物

成年健康雄性C57BL/6小鼠，6-8周，购于上海斯莱克实验有限公司。Kcna3 KO杂合子小鼠购于上海南方模式生物科技股份有限公司，采用CRISPR/Cas9技术，利用非同源重组修复引入突变的方式，造成kcna3基因蛋白读码框移码，功能缺失。基因敲除杂合子小鼠(kcna3+/-)交配鉴定获得纯合子小鼠(kcna3-/-)。实验环境保持12h白昼/12h黑夜交替循环，温度维持在22-24℃，小鼠可自由摄取饲料和水。所有动物实验已获得上海大学伦理委员会的批准，并严格依照动物伦理相关要求开展。

实验试剂

实验方法

实验一：Kcna3 KO小鼠的基因型鉴定

1.DNA的提取

(1)剪鼠尾5mm和脚趾(标号)至1.5mL EP管，对应做好标记。每管加入600μL鼠尾裂解液和20μL蛋白酶K(100μg/mL),摇匀，56℃烘箱过夜，直至组织完全溶解。

(2)次日，充分摇匀后12000rpm，4℃离心10min。

(3)取500μL上清液至新的EP管中，加入350μL异丙醇，上下颠倒混匀至出现白色絮状沉淀，静置2min。

(4)放入低温高速离心机，12000rpm，4℃离心10min。

(5)弃上清，加入1mL 75％乙醇，1000rpm，4℃离心3min。

(6)去掉上清，重复上一步操作。

(7)弃上清，离心管倒扣在吸水纸上控干，室温放置30min。

(8)向EP管中加入100μL dd H2O，充分溶解沉淀并混匀，于-20℃保存。

2.PCR扩增

(1)Kcna3 KO鉴定引物序列：

(2)PCR反应体系：

(3)PCR反应条件：

(4)琼脂糖凝胶电泳

①称取0.3g琼脂糖放入30mL TAE(1×)溶液的烧杯中，制备1％的凝胶；

②放置于微波炉中加热90s，至琼脂糖完全溶解；

③待融化的凝胶稍冷却后，加入核酸染料(Gel-green)8μL混匀；

④将溶液倒入插有样品梳的凝胶灌制平台中冷却30min；

⑤待琼脂糖凝胶凝固后，拔出梳子，放入TAE电泳缓冲液的电泳装置中；

⑥将制备好的PCR样品和DNA maker加入电泳孔道中；

⑦接通电源，在120V交流电压，电泳30min后，用天能凝胶成像系统进行拍照。

实验二：KA诱导小鼠癫痫模型的建立

根据小鼠体重通过腹腔注射相应剂量的KA(30mg/kg)，置于透明观察笼内，观察小鼠发作症状的变化。按照Racine评分标准，达到4级或以上发作持续1h，视为造模成功。对于注射KA后1h仍无发作或发作未达到4级的小鼠，每间隔20min追加注射KA(30mg/kg)，最多追加3次，仍未达到发作标准的小鼠或在实验过程中死亡者视为造模失败。Racine评分标准：0级：无惊厥发作；1级：面部阵挛抽动，如点头、眨眼、动须等；2级：单侧前肢阵挛；3级：双侧前肢阵挛伴后肢站立；4级：全身强直阵挛伴有失衡或跌倒；5级：全身强直阵挛发作，仰卧位跌倒。

实验三：动物行为学观察

行为学观察包括三部分：录像观察各组小鼠的癫痫发作等级、发作次数和强直痉挛持续总时长，小鼠Y迷宫实验和Morris水迷宫实验。

1.癫痫发作行为

根据Racine分级标准，通过视频监控观察并记录各组小鼠造模21d后12个小时内的癫痫发作行为学表现，包括癫痫发作等级、发作次数和强直痉挛(4级以上发作)持续总时长，评估及记录方式如下表。

2.Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验是一种强制性要求实验动物游泳的实验，以学习寻求水中的隐藏站台为实验目标，可以测试实验动物对空间定位的感知，包括位置感和方向感，已广泛用于学习记忆、老年痴呆、海马损伤等多个领域，是学习与记忆行为学研究的经典实验。

Morris水迷宫是一个圆形水池，其直径为120cm、高为60cm，水池内加入清水，水位35cm，水温保持在22～24℃，在水中加入钛白粉使之变为不透明的白色，以提高实验动物和背景的对比度，保持室内光照恒定。将水池等分为I(东北)、II(西北)、III(西南)、IV(东南)四个象限。在第IV象限正中，放一直径为10cm的圆形站台，用白色纱布包裹站台表面，站台平面在水下1.5cm处。同时注意在训练期和测试期各参照物和象限划分保持恒定不变。

小鼠水迷宫实验分为两个阶段：训练阶段和实验阶段，共进行5天，每天训练1次。每天开始时将实验动物从四个象限按照I→II→III→IV的顺序放入水中，为防止实验动物记忆参照信息和水中平台位置，每只老鼠必须按上述象限顺序，同时背对水池壁进行实验。水中站台放置于IV象限(东南象限)。规定实验动物在60s内寻找隐藏的站台，若在60s内成功地找到站台，将其放在站台上休息15s；如果60s内未能找到站台，则由实验人员将其牵引并置于水中站台上，同样休息15s。若实验动物休息时间未到15s而再次跳入水中，则需要实验人员将其重新牵引并置于水中站台重新计时。整个实验过程使用视频跟踪系统记录小鼠运动情况。每只小鼠每次训练完后用干毛巾将鼠擦干以防止体温过低出现应激反应，实验过程中需要保持周围环境安静，站台位置、迷宫外的摆设以及光线始终不变，避免对小鼠记忆产生干扰。实验于各组小鼠造模完成后21d进行测试，前四天为训练期，不计入成绩，最终记录第五天的耗时作为其有效成绩。统计小鼠在规定时间内穿台次数和站台所在目标象限的游泳时长。

3.Y迷宫实验

Y迷宫主要应用于动物的识别性学习，用于测试动物的工作记忆和空间记忆能力。Y迷宫装置共3个臂，各臂之间夹角为120°。迷宫上方安装有红外线摄像追踪系统，通过配套软件进行操作记录。实验时将小鼠面向Y迷宫中心从其中一个臂的末端放入，让其自由探索10min。在自发性交替反应中，小鼠身体完全进入臂内记为一次标准的进入，动物连续进入3个不同的臂内定义为一次成功的探索，交替正确率(％)＝正确进入次数/(进臂总次数–2)×100％。实验于各组小鼠造模完成21d后进行测试。

实验四：脑电的采集与分析

从Control组、KA组、KA+PAP-1组和Kv1.3 KO+KA组中随机取3只造模21天的小鼠，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，等小鼠麻醉完全后，将其俯卧位固定在小鼠脑立体定位仪上，保持颅骨表面水平状态。剃除头部毛发，用医用酒精棉球消毒头部皮肤后，沿头部正中沿矢状缝切开头皮，暴露出颅骨，用30％过氧化氢轻擦颅骨表面，充分暴露小鼠颅骨的正中线和前囟(Bregma，矢状面与冠状面缝合的交点)、后囟(Lambda，矢状面与人字缝的交点)和目标位置。根据小鼠脑图谱，以前囟为坐标原点，按照海马所在位置坐标用0.5mm直径钻头在颅骨上钻孔(具体坐标为：正中矢状缝旁开±1.5mm；前囟后2mm；硬脑膜下深度1.5mm)。为了防止硬脑膜或脑组织的损伤，调节螺钉的旋转度，以确保螺钉没有插入过深。电极固定好后，在不暴露金属部件的情况下，用牙科水泥将电极固定在颅骨上，待等牙科水泥凝固后，将小鼠从立体定位仪上取下。术后注意保温直至小鼠醒来，让其自由进食和饮水，待小鼠完全恢复后进行脑电记录。

脑电数据通过在体多通道记录系统采集，前置放大器放大1000倍，波幅范围为-2～+2V，滤波范围为1.6-100Hz，局部场电位记录频率为1000Hz，单次记录时间不少于30min。局部场电位以.pl2格式导出，使用Offline Sorter V4软件进行可视化预览，脑电数据经MATLAB软件导出。脑电波分解得到五种不同频率的生理节律，分别为δ波(0.4-4Hz)，θ波(4-8Hz)，α波(8-15Hz)，β波(15-30Hz)，γ波(30Hz以上)；采用Welch法、汉明窗(Hammingwindow)和快速傅里叶变换法计算功率谱分析局部场电位的频域信息。局部场电位功率谱密度(PSD)计算公式如下：

实验五：海马组织与完整脑组织的提取

小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉。一部分小鼠立即断头取脑，冰上迅速剥离出海马组织，装入标记好的冻存管中并放入-80℃冰箱保存，用于蛋白质免疫印迹实验(每组n＝5)；另一部分小鼠麻醉后固定于灌流专用操作台上，自剑突下打开胸腔并找到心脏(同时要注意使用血管钳夹住心包及周围的软组织)，将针头从心尖部位刺入主动脉根部，剪开右心耳，依次缓慢灌注生理盐水溶液和4％多聚甲醛溶液。灌注完成后断头取出完整的脑组织，放入含有4％多聚甲醛固定液的15mL离心管中，摇床固定24h，后依次用20％、30％蔗糖溶液置于摇床脱水24h，待脑组织完全沉到底部后，放入-80℃冰箱保存。后续用冷冻切片机进行切片，切片厚度为20μm，用于免疫荧光实验(每组n＝5)。

实验六：免疫印迹实验

(1)蛋白样品的制备：将样品组织放到冰盒上，解冻后转移至1.5mL离心管中，加入1.5mL预冷的PBS洗涤，短暂振荡，吸去上清，加入适量RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂，先用剪刀将组织块剪成小块，后用匀浆机将组织块研磨至彻底粉碎，冰上静置30min，12000rpm，4℃离心20min，取上清。

(2)蛋白浓度测定及蛋白变性处理：配制BSA标准品和BCA工作液(A液：B液＝50：1)。各取25μL标准品与待测样品加入到96孔板中，每孔加入200μLBCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。冷却到室温，在酶标仪上的562nm波长范围处测定吸光度，根据BSA标准品的吸光度绘制标准曲线，依据标准曲线和稀释样品的吸光度计算出待测样品的实际浓度。将样品按照4：1加入5×上样缓冲液，混合振荡均匀后置于恒温金属浴中100℃煮8min，使蛋白变性。

(3)SDS电泳：使用前，将配胶用的玻板和梳子等用超纯水充分洗净并烘干，按比例配置浓缩胶和分离胶。待胶凝固后装入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，将蛋白样品和Marker依次加入上样孔内。盖上盖子，连接电极，将电压调至80V进行电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电压调至120V。

(4)转膜：将PVDF膜置于甲醇中浸透活化，暂置于转膜缓冲液中。将转膜用的夹子打开并浸在转移缓冲液中，夹子两边各放一层海绵，上边再放3层滤纸，用玻璃棒将气泡赶走，将电泳完毕的胶用坡形板裁切好后，按照黑胶白膜的原则置于黑色板一边的滤纸上，PVDF膜覆盖其上，再用玻璃棒赶走气泡，同时需注意避免发生移位。合上转膜夹子，置于转印电极芯内并放入转印槽，在转印槽内倒入预冷的1×转膜缓冲液，设置200mA恒流转膜1-2h。转膜过程中需将转印槽放置在冰水混合物中。

(5)封闭：转膜完毕后取出PVDF膜，用洗涤液洗膜，再放入封闭液中，将孵育盒置于摇床上缓慢摇动，室温封闭1-2h。

(6)孵育一抗：封闭完成后，加入Kv1.3(1：400稀释)、TNF-α(1：1000稀释)、IL-1β(1：1000稀释)、IL-10(1：1000稀释)和IL-6(1：1000稀释)一抗稀释液，4℃孵育过夜。

(7)孵育二抗：第二天将一抗稀释液回收，用洗涤液洗膜3次，每次5min。根据一抗种属来源配制对应的二抗稀释液：山羊抗兔IgG-HRP(1：5000稀释)、山羊抗小鼠IgG-HRP(1：5000稀释)和山羊抗大鼠IgG-HRP(1：5000稀释)，室温摇床孵育1-2h。孵育结束后，取出PVDF膜，用洗涤液洗膜3次，每次5min。

(8)显影和图像分析：将ECL发光液A液和B液等体积混合，将洗净的PVDF膜放置于显影板上，覆盖ECL发光液1min后进行显影，并使用软件分析所得条带的光密度值。

实验七：免疫荧光实验

(1)冷冻切片水洗：将组织切片室温放置30min，在切片四周用组化笔画框，晾干，用0.01M PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤3次，每次5min。

(2)破膜：将切片置于0.5％PBST洗涤槽中，摇床轻摇30min。滴加胃蛋白酶至盖过脑片，置于37℃水浴锅孵育30min。

(3)封闭：加入山羊血清封闭液，常温下孵育1h。

(4)孵育一抗：轻轻甩掉切片上的封闭液，滴加配置好的一抗混合液Kv1.3(1：400)、TNF-α(1：800)、IL-1β(1：800)、IL-10(1：800)和IL-6(1：800)，4℃孵育过夜。

(5)洗片：切片回温30min，用0.01M PBS缓冲液洗涤4次，每次10min。

(6)孵育二抗：加入配制好的二抗混合液，室温避光孵育1h。

(7)洗片：避光，去除二抗后用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，每次10min。

(8)孵育DAPI：用PBS稀释DAPI(1：1000)，于湿盒中孵育10min。

(9)洗片：避光，0.01M PBS洗涤3次，每次10min。

(10)封片：在避光情况下使用50％甘油进行封片。

(11)免疫荧光成像：将封好的切片在荧光显微镜下观察并进行图片采集。

实验八：细胞划痕实验

首先使用记号笔在6孔板背后沿着直尺均匀划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔；按照细胞数5×10⁵个/孔进行铺板，加入含10％血清的DMEM，放入37℃、5％CO2培养箱，培养24h；次日用200μL枪头垂直于6孔板以及背面的参照线划痕，划痕后用PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清DMEM培养基后进行药物处理，施加KA浓度为100μM，PAP-1浓度为1μM，放入37℃、5％CO2培养箱培养。按0h、6h、12h、24h观察拍照。

实验九：动物手术

腹腔注射10％水合氯醛麻醉，等小鼠麻醉完全后，将其俯卧位固定在小鼠脑立体定位仪上，保持颅骨表面水平状态。剃除头部毛发，用医用酒精棉球消毒头部皮肤后，沿头部正中沿矢状缝切开头皮，暴露出颅骨，用30％过氧化氢轻擦颅骨表面，充分暴露小鼠颅骨的正中线和前囟(Bregma，矢状面与冠状面缝合的交点)、后囟(Lambda，矢状面与人字缝的交点)和目标位置。根据小鼠脑图谱，以前囟为坐标原点，按照海马所在位置坐标用0.5mm直径钻头在颅骨上钻孔(具体坐标为：正中矢状缝旁开±1.5mm；前囟后2mm；硬脑膜下深度1.5mm)。为了防止硬脑膜或脑组织的损伤，调节螺钉的旋转度，以确保螺钉没有插入过深。电极固定好后，在不暴露金属部件的情况下，用牙科水泥将电极固定在颅骨上，待等牙科水泥凝固后，将小鼠从立体定位仪上取下。

制备实施例1

(1)10％水合氯醛溶液：取水合氯醛5g，加入超纯水溶解，定容至50mL；

(2)1×蛋白电泳缓冲液：取Tris-Base 3.03g，甘氨酸14.4g，SDS 1g，加入超纯水溶解，定容至1L；

(3)1×蛋白转膜缓冲液：取Tris-Base 3.03g，甘氨酸14.4g，无水甲醇100mL，加超纯水定容至1L；

(4)1×TBST缓冲液：取Tris 12.12g，NaCl 17.54g，加入超纯水溶解并用HCl调pH＝7.5，定容至2L，加入2mL Tween-20，搅拌；

(5)5％脱脂奶粉封闭液：取脱脂奶粉1g，加TBST缓冲液定容至20mL；

(6)聚丙烯酰胺分离胶(10mL)：

表1聚丙烯酰胺分离胶配制

(7)5％聚丙烯酰胺浓缩胶(4mL)：取30％Acr-Bis(29:1)0.67mL，1M Tris-HCl(pH6.8)0.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.04mL，TEMED 0.004mL，超纯水2.7mL。

(8)10％过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵溶解于1mL的超纯水，4℃储存备用。

(9)生理盐水：称取9g NaCl，加入超纯水溶解，定容至1L；

(10)KA溶液：取KA 50mg，加入16.67mL生理盐水溶解。

(11)PAP-1溶液：将50mg PAP-1溶于DMSO中，配成终浓度为50mg/mL储备液备用。

体内实验PAP-1工作液(50mL)：取2.5mL 50mg/mL的澄清DMSO储备液加到20mL PEG300中，混合均匀；向上述体系中加入250μL Tween-80，混合均匀；然后继续加入2.25mL生理盐水定容至5mL。

(12)0.2M PB：取NaH2PO4.2H2O 5.928g，Na2HPO4.12H2O 57.996g，加入超纯水溶解并调pH＝7.4后，定容至1L；

(13)0.01M PBS：取Na2HPO4.12H2O 6.615g，NaH2PO4.2H2O 0.665g，NaCl 18.00g，KCl 0.45g，加入超纯水溶解并调pH＝7.4，定容至2.25L；

(14)4％多聚甲醛：取多聚甲醛80g，加入到1L 0.2M PB中，加入超纯水定容至2L，放置水浴锅中加热至60℃过夜，搅拌至透明，混匀后备用；

实施例一：KA诱导小鼠癫痫模型的建立

根据前述实验方法建立KA诱导小鼠癫痫模型。

模型组小鼠在腹腔注射KA后30min左右陆续开始出现眼神呆滞、频繁点头等表现，随后发展成单侧或双侧前肢阵挛，后期可出现站立现象，伴有跌倒情况发生。对照组在相同时间腹腔注射等量的生理盐水。

实验按照Racine分级标准，达到4级或以上持续发作的小鼠63只，诱导成功率为90％(63/70)，未发作或发作未达到4级以及抽搐过度死亡小鼠弃用。在造模过程中3只小鼠因为发作程度过强导致抽搐死亡，最终本次KA诱导的小鼠癫痫模型建立成功的小鼠为60只，用于后续实验。将造模后存活的60只WT小鼠随机分入各亚组中，即：7d组(n＝12)、14d组(n＝12)、21d组(n＝12)、48d组(n＝12)和63d组(n＝12)。生理盐水组(Control组)没有小鼠死亡。

实施例二：KA诱导小鼠癫痫模型以及癫痫病人海马中Kv1.3和炎症因子的表达

按照前述实验方法通过免疫印迹实验和免疫荧光实验检测A诱导小鼠癫痫模型中Kv1.3和炎症因子的表达，以及癫痫病人海马中Kv1.3的表达。

WB结果显示，与Control组比较，Kv1.3在KA造模14d和21d的表达水平显著升高(图1A和B)。免疫荧光结果显示，与Control组比较，KA 7d小鼠的小胶质细胞被激活，呈现出分支减少缩短、胞体增大的阿米巴样细胞形态，Kv1.3与小胶质细胞标记物IBA-1共标，在KA14d、21d和63d后表达水平显著升高，表现出与WB结果一致的趋势(图1C和D)。这些结果提示，在KA诱导的癫痫模型中，小胶质细胞被激活，Kv1.3表达水平显著升高。

对从上海中医药大学附属普陀医院获得的癫痫病人样本进行免疫荧光实验，如图2所示，观察到癫痫病人海马中小胶质细胞数量增加，Kv1.3的表达上调。

WB结果显示，腹腔注射KA诱导小鼠癫痫模型后，炎症因子TNF-α在造模7d、14d、21d、48d和63d后的表达均显著上调，KA 48d组的表达水平出现降低，但仍然显著高于Control组，出人意料的是，KA 63d组发现有极显著的表达上调(图3A和B)。IL-10的表达水平呈现出上升后下降的趋势，在造模14d后达到最高(图3A和C)。而IL-6在腹腔注射KA后21d表达显著下调，在其它时期的表达量没有显著性的变化(图3A和D)。

免疫荧光染色结果显示，海马CA1区的TNF-α、IL-1β和IL-10与小胶质细胞标志物IBA-1共标，与Control组相比，TNF-α在KA 7d、14d、21d、48d和63d的表达水平都上调，具有显著性差异(图4A和C)，与WB的结果是一致的；IL-1β在KA 7d、14d、21d和48d的表达水平显著升高(图4B和D)；此外，抗炎因子IL-10的表达水平在KA 7d、14d、21d、48d和63d的表达水平也显著升高(图5A和B)。

为了进一步探讨自噬在癫痫中扮演的角色，对KA诱导癫痫的小鼠海马进行了免疫荧光和免疫印迹实验。结果显示，KA注射后1天小鼠海马中自噬体标志物LC3B、溶酶体标志物LAMP1与小胶质细胞标志物IBA-1三者仍能共标(图6A)，但在KA注射后14天的小鼠海马区，LC3B、LAMP1与IBA-1出现部分不共标(图6B)。

以上结果说明，在癫痫发生过程中，海马小胶质细胞中自噬体与溶酶体可能存在互作融合异常

实施例三：Kv1.3的敲除和PAP-1药理学阻断对癫痫发作的行为学影响

杂合子小鼠(kcna3^+/-)交配获得F1代小鼠，并进行基因分型。根据引入突变位点序列设计2对特异性引物(P1和P2，P3和P4)，分别进行2次PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，根据扩增出的DNA片段长度判断小鼠基因型。

野生型小鼠通过P1和P2 PCR获得单一的2884bp片段，P3和P4可以获得661bp片段；杂合子小鼠通过P1和P2 PCR获得602bp和2884bp两个片段，P3和P4可以获得661bp的片段；纯合子小鼠通过P1和P2 PCR获得单一的602bp片段；P3和P4不能获得条带(图7C)。在野生型及杂合子小鼠中，P1、P2引物是否能扩增出大条带并不影响结果判读，因为设计这对引物目的是用于扩增KO条带。根据分型结果，成功获得了纯合子Kv1.3 KO(kcna3^-/-)小鼠。

使用蛋白质印迹进一步验证Kv1.3的敲除效率，与WT小鼠比较，Kv1.3 KO小鼠仅显示出少量的Kv1.3的表达(图7B)。

按照前述实验方法，通过观察小鼠的癫痫发作行为、Y迷宫实验和Morris水迷宫实验研究Kv1.3的敲除和PAP-1药理学阻断对癫痫发作的行为学影响。

行为学录像观察结果显示，生理盐水组未见癫痫发作，与KA组相比较，Kv1.3 KO组小鼠的发作以2、3级为主，4级以上大发作的次数显著降低(图8A)；Kv1.3 KO组小鼠的强直痉挛发作的持续总时长也显著缩短(图8B)。结果提示，Kv1.3的敲除会降低惊厥发作的强度和强直痉挛发作持续时长，使癫痫发作情况得到明显的好转。

通过小鼠水迷宫游泳轨迹分析(图9A)，与Control组比较，KA模型组穿越平台次数明显减少；与KA模型组比较，PAP-1治疗组和Kv1.3 KO组穿越平台次数显著增加，PAP-1治疗组和Kv1.3 KO组与生理盐水组比较无显著差别(图9B)。KA模型组小鼠在目标象限的活动时长与Control组相比显著缩短，而PAP-1治疗组和Kv1.3 KO组在目标象限活动时长显著高于KA模型组，且与生理盐水组比较没有显著性差异(图9C)。对照组穿越平台次数明显较多，能很快寻找到站台原来所在位置，KA模型组小鼠记忆能力障碍，多次探索原站台以外区域，而PAP-1治疗组、Kv1.3敲除组小鼠均在原平台位置区域多次穿梭并且在目标象限活动较长时间，展现出较小的学习记忆和认知功能障碍。

Y迷宫实验结果显示，与Control组相比，KA组的自发交替率显著降低，PAP-1治疗组和Kv1.3 KO组的交替率与KA组比较显著升高，且与对照组相比没有显著性差异(图10A，B)。结果提示，KA诱导的癫痫小鼠空间记忆能力受损，而Kv1.3的阻断和敲除小鼠改善了癫痫导致的空间工作记忆能力障碍。

实施例四：Kv1.3的敲除和PAP-1药理学阻断改善癫痫模型小鼠的脑电信号

根据前述方法，研究Kv1.3的敲除和PAP-1药理学阻断对癫痫模型小鼠的脑电信号影响。

脑电记录结果显示，正常小鼠脑电图表现为频率、波幅较低的基础波，没有出现异常的癫痫波；KA组癫痫模型小鼠脑电图中可见爆发性、频率高、波幅大的多尖棘波；KA+PAP-1组和Kv1.3KO组的脑电频率和波幅均有下降，但是仍表现出比对照组高的趋势(图11A)。对脑电采集到的五种常见节律的能量强度值进行统计，如图11B所示：δ波(0.5-4Hz)属于一种慢波，是小鼠睡眠状态下的主要节律，与Control组相比，KA模型组的δ节律能量强度显著增强，KA+PAP-1组和Kv1.3 KO组的δ节律能量强度没有显著差异，与KA组相比，KA+PAP-1组和Kv1.3 KO组的δ节律能量强度表现出显著的降低；θ波(4-7Hz)与δ波相似，也是在睡眠时出现的节律，KA模型组的θ节律能量强度高于Control组，KA+PAP-1组和Kv1.3 KO组与Control组相比没有统计学意义，与KA模型组相比较，KA+PAP-1组和Kv1.3 KO组的θ节律能量强度显著降低；α波(8-13Hz)是小鼠正常的脑电波，与Control组相比较，KA癫痫模型组的α节律能量强度显著增强，KA+PAP-1组与Kv1.3 KO组的能量强度与KA组相比显著降低，但是仍表现出高于Control组的节律强度；β波(15-30Hz)是大脑处于兴奋状态时的主要节律，与Control组相比，KA组的β节律能量强度显著升高，KA+PAP-1组和Kv1.3 KO组的β节律能量强度与KA组相比较显著降低，并且与Control组比较没有显著性差异；γ波(>30Hz)属于出现在快速眼动睡眠时期的一种快波，KA组的γ节律能量强度显著增强，而KA+PAP-1组与KA组相比较显著降低，且与Control组比较没有显著性差异，Kv1.3 KO组与Control组相比没有显著性差异。图11C显示，KA组的平均功率谱密度(PSD)增加，而PAP-1治疗组和Kv1.3敲除组的PSD较KA组有所下降。以上结果表明，KA诱导的癫痫模型小鼠出现了高频、高幅的多尖棘脑电波，各个频段的节律能量强度均升高，尤其是对低频节律造成了极显著的影响。Kv1.3的特异性阻断或敲除可明显改善癫痫小鼠的异常脑电波，提示其对癫痫造成的脑损伤存在一定的保护作用。

实施例五：PAP-1改善KA诱导癫痫的神经炎症

按照前述实验方法，研究药理学阻断Kv1.3对KA诱导癫痫的神经炎症影响。

免疫印迹结果显示，与KA模型组相比，KA+PAP-1 14d和KA+PAP-1 21d组小鼠海马的TNF-α表达水平显著降低(图12A和B)；KA+PAP-1 14d和KA+PAP-1 21d组小鼠海马的IL-6表达量明显降低(图12A和C)；而KA+PAP-1 14d和KA+PAP-1 21d组小鼠海马的IL-1β表达量没有显著差异(图12A和D)；KA+PAP-1 14d和KA+PAP-1 21d组小鼠海马的抗炎型IL-10表达量显著降低(图12A和E)。整体看来，Kv1.3的药理学阻断可以抑制炎症因子的分泌，减轻癫痫模型中的神经炎症。

为了验证PAP-1改善神经炎症的过程是否会引起Kv1.3通道表达水平的变化，使用免疫印迹法分析PAP-1治疗14d和21d后的小鼠海马组织中Kv1.3的表达水平。如图13所示，KA+PAP-1 14d组、KA+PAP-1 21d组与KA 14d、KA 21d组比较，均没有显著性差异。结果说明PAP-1的日常饮食处理没有改变Kv1.3的表达水平，进一步提示炎症反应的减弱可以由Kv1.3通道的功能障碍所介导。

实施例六：PAP-1处理抑制KA诱导Bv2细胞的迁移

对接种于6孔板中的Bv2细胞进行划痕实验，划痕24h后施加终浓度为100μM的KA模拟体外癫痫模型，PAP-1处理组除了加入KA外另加入终浓度为1μM的Kv1.3小分子抑制剂PAP-1。

拍照结果显示，对照组Bv2细胞具有正常迁移能力，加入KA后6h、12h、24h后Bv2细胞的迁移速率被显著抑制，PAP-1处理逆转了KA抑制的Bv2细胞的迁移速率，且与Control组相比没有显著性差异(图14A，B)。结果表明，使用PAP-1特异性阻断Kv1.3可以逆转KA诱导的小胶质细胞迁移。

以上研究结果提示，KA诱导癫痫发作后，Kv1.3和炎症因子表达上调，使用PAP-1药理学阻断或者敲除Kv1.3后可以改善小鼠癫痫发生的严重程度和学习记忆障碍，减轻神经炎症反应，对癫痫的发作起保护作用。提示PAP-1可以通过阻滞Kv1.3通道进而发展成为癫痫治疗的潜在药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市普陀区中心医院

<120> 电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂及其应用

<130> P2022-0399

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggcgatccag tgacaaagaa 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 4

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Claims

1.一种电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗和/或预防癫痫。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂选自下组：小分子化合物、核酸药物、多肽或蛋白类药物或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂选自下组：5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(PAP-1)；靶向Kv1.3的sgRNA、siRNA、shRNA、micrRNA及其前体或表达载体；或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癫痫具有以下特征：小胶质细胞的Kv1.3通道在海马组织中表达上调。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述“治疗和/或预防癫痫”包括：

(iii)逆转受试者体内被抑制的小胶质细胞迁移；

(v)改善受试者的学习记忆能力和认知障碍。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，和(a)电压门控钾离子通道Kv1.3的选择性抑制剂。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型，优选为口服剂型。

8.一种组合物产品，其特征在于，所述组合物产品包括：

9.如权利要求8所述的组合物产品，其特征在于，所述治疗和/或预防癫痫的其它药物选自下组：

10.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：