CN116763812A - 一种西洋参多糖及其制备的骨质疏松治疗药物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种西洋参多糖及其制备的骨质疏松治疗药物和应用，属于生物医学技术领域。本发明所提供的西洋参多糖的单糖组成为：81.42% Glc，11.41% Gal‑UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。本发明发现西洋参多糖能够有效的清除DPPH自由基和ABTS自由基，促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化，从而发挥治疗骨质疏松的作用。同时，西洋参多糖可以与香菇多糖联用来协同的发挥治疗骨质疏松的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种西洋参多糖及其制备的骨质疏松治疗药物和应用。
背景技术
骨质疏松是一种骨骼疾病，其特征是骨组织的质量和密度下降，骨强度减弱，易发生骨折。其通常与骨骼中的成骨细胞和破骨细胞的不平衡有关。成骨干细胞是一类存在于骨髓和骨骼中的特殊细胞，它们有能力分化为成骨细胞并产生新的骨组织，因此成骨干细胞在骨骼发育、修复和再生中起着关键作用。在骨质疏松患者的体内成骨干细胞数量可能减少或功能受损，导致骨骼的破坏速度超过修复速度，这造成了骨质疏松的发生与进一步发展。因此，如何有效的提高成骨干细胞的增殖和成骨分化效果是治疗骨质疏松的关键。
西洋参是一种传统药物，含有多糖、精油和人参皂甙等多种活性成分,具有特殊的性质和许多药理功能,例如补气养阴，清热生津的功效。多糖作为西洋参的主要活性成分之一，现有研究表明其具有免疫调节、抗肿瘤等生物活性，然而关于西洋参多糖在骨质疏松治疗中的作用尚无报道。
香菇多糖是香菇最重要生物活性物质，研究报道香菇多糖具有增强免疫、抗菌、抑制肿瘤、清除血脂、抗衰老等功效，通过激发免疫细胞成熟、分化和增殖，来刺激干扰素形成，被称为生物反应修饰剂，从而被广泛关注和重视，目前关于香菇多糖在骨质疏松治疗中的作用也鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西洋参多糖及其制备的骨质疏松治疗药物和应用，从而为骨质疏松的治疗提供一种安全有效的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
其一，本发明提供了一种用于治疗骨质疏松的药物，所述药物的核心组成成分包括西洋参多糖和香菇多糖，所述药物中西洋参多糖和香菇多糖的质量比为1:1。
优选地，所述西洋参多糖的单糖组成为81.42% Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
优选地，所述西洋参多糖的制备方法包括如下步骤：
（1）干燥并切片的西洋参使用石油醚没过浸泡12h后抽滤干燥；
（2）加入约10倍量的蒸馏水，100℃加热2h，过滤收集过滤液1，滤渣再次加入蒸馏水加热至沸腾2h后过滤收集过滤液2，合并过滤液1和过滤液2，得到西洋参过滤液；
（3）将所述西洋参过滤液置于旋转蒸发仪中，在60℃的条件下，浓缩为原体积的20%，得到西洋参浓缩液；
（4）加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%，4℃醇沉24h, 离心后收集沉淀，得到西洋参粗多糖；
（5）按80%氯仿20%正丁醇的比例配制Sevag溶液，将所述西洋参粗多糖配置成0.2g/ml的西洋参粗多糖溶液1，将所述西洋参粗多糖溶液和Sevag试剂按照5:1的体积比例混合，充分震荡混匀，离心取上清，重复8次，得到西洋参粗多糖溶液2；
（6）AB-8大孔树脂用无水乙醇浸泡过夜后，按照所述AB-8大孔树脂：所述西洋参粗多糖溶液2=1:4的比例混合，恒温搅拌16h，脱除多糖的色素；
（7）再次加入无水乙醇醇沉取沉淀，用蒸馏水配置为0.2g/ml的西洋参粗多糖溶液3后，加入超滤机中，选用1kDa的的滤膜进行过滤，留存分子量小于1kDa的溶液,得到西洋参多糖溶液；
（8）将所述西洋参多糖溶液旋转蒸发并冻干得到分子量小于1kDa的西洋参多糖。
优选地，所述药物通过西洋参多糖和香菇多糖协同清除DPPH自由基和ABTS自由基，协同促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化发挥治疗骨质疏松的作用。
优选地，所述香菇多糖的CAS号为 37339-90-5。
其二，本发明提供了一种用于促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的药物，所述药物的核心组成成分包括西洋参多糖和香菇多糖，所述药物中西洋参多糖和香菇多糖的质量比为1:1；
所述西洋参多糖的单糖组成为81.42% Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39%Ara，0.85% Rha。
其三，本发明提供了西洋参多糖在制备骨质疏松治疗药物中的应用。
优选地，所述西洋参多糖的单糖组成为：81.42% Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
优选地，所述药物能够通过西洋参多糖清除DPPH自由基和ABTS自由基，促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化,从而发挥治疗骨质疏松的作用。
其四，本发明提供了西洋参多糖在制备促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的药物中的应用。
优选地，所述西洋参多糖的单糖组成为：81.42% Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
其五，本发明提供了一种多糖组合物在制备骨质疏松药物中的应用，所述多糖组合物包括西洋参多糖和香菇多糖，所述药物中西洋参多糖和香菇多糖的质量比为1:1；
所述西洋参多糖的单糖组成为：81.42% Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39%Ara，0.85% Rha。
优选地，所述香菇多糖的CAS号为 37339-90-5。
本发明的有益效果在于：
本发明通过有机超滤膜结合AB-8大孔树脂的方式的制备出了西洋参多糖，通过实验发现，西洋参多糖能够有效的清除DPPH自由基和ABTS自由基，促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化发挥治疗骨质疏松，从而可以将西洋参多糖用于制备治疗骨质疏松的药物；
同时，本发明发现将西洋参多糖和香菇多糖联用时，二者可以协同清除DPPH自由基和ABTS自由基，促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化发挥治疗骨质疏松，因此当将二者联用时可以更加有效的治疗骨质疏松疾病。而且，香菇多糖的成本显著低于西洋参多糖，从而本发明可以在降低成本的同时有效的提高作用效果。
附图说明
图1为西洋参多糖的红外吸收光谱图；
图2为西洋参多糖对于DPPH自由基的清除效果及其与香菇多糖联用效果的结果图；
图3为西洋参多糖的单糖组成图；
图4为西洋参多糖对于ABTS自由基的清除效果及其与香菇多糖联用效果的结果图；
图5为西洋参多糖对骨髓间充质干细胞增殖的作用效果及其与香菇多糖联用效果的结果图；
图6为西洋参多糖对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用效果及其与香菇多糖联用效果的结果图；
图7为西洋参多糖对骨髓间充质干细胞成骨分化关键蛋白Runx2蛋白表达的作用效果及其与香菇多糖联用效果的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：制备西洋参多糖
（1）干燥并切片的西洋参200g，石油醚没过浸泡12h后抽滤干燥；
（2）加入2000毫升蒸馏水，100℃加热2h，过滤收集过滤液1，滤渣再次加入蒸馏水加热至沸腾2h后过滤收集过滤液2，合并过滤液1和过滤液2，得到西洋参过滤液；
（3）将西洋参过滤液置于旋转蒸发仪中，在60℃的条件下浓缩为原体积的20%的西洋参浓缩液；
（4）加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%，4℃醇沉24h, 离心后收集沉淀，得到西洋参粗多糖；
（5）按80%氯仿20%正丁醇的比例配制Sevag溶液150ml，将西洋参粗多糖溶解于蒸馏水中，配置成0.2g/ml的西洋参粗多糖溶液1，将西洋参粗多糖溶液1和Sevag试剂按照5:1的体积比例混合，充分震荡混匀，离心取上清，重复8次，得到西洋参粗多糖溶液2；
（6）AB-8大孔树脂用无水乙醇浸泡过夜后，按照AB-8大孔树脂：西洋参粗多糖溶液2=1：4的比例混合，恒温搅拌16h，脱除多糖的色素；
（7）再次加入300ml无水乙醇醇沉取沉淀，用蒸馏水配置为0.2g/ml的西洋参粗多糖溶液3后，加入超滤机中，选用1kDa的的滤膜进行过滤，留存分子量小于1kDa的多糖溶液；
（8）将西洋参多糖溶液3旋转蒸发并冻干得到分子量小于1kDa的西洋参多糖。
实施例2：红外光谱研究西洋参多糖的结构和官能团
（1）提前开启空调与除湿，室内温度稳定在18~20℃，湿度65%再进行下一步操作；
（2）用分析纯的无水乙醇清洗玛瑙研钵，用擦镜纸擦干后，再用红外灯烘干；
（3）取烘干后的溴化钾粉末，在红外灯下，在玛瑙研钵中研细越细越好，平均分成两份备用；
（4）取多糖粉末与干燥的KBr粉末以1：100混合，置于玛瑙研钵中，在红外灯下混匀，充分研磨颗粒粒度2微米左右，以免散射光影响，边研边用红外灯照射，以减小湿度；
（5）将其中一份研好的溴化钾粉末用15T压片机压成透明的样品薄片，用作参比本底；用药匙取约70-80mg研好的混合粉末，用15T压片机压成透明的被测样品薄片备用；
（6）测试本底作为空白，取下压片，擦拭干净后依次放入西洋参多糖压片，进行采集，结果如图1所示。
从图1中可以看出，3290 cm–1处为羟基伸缩振动吸收峰；2917cm-1处为C–H伸缩振动吸收峰；1590cm−1是C=O非对称伸缩振动峰，是未酯化的糖醛酸羧基特征吸收峰；在1400cm–1处为C-H的变形吸收峰； 1000 cm–1 是吡喃糖的特征吸收峰，以上吸收峰均是糖类物质的特征吸收峰，说明本实验方法成功获得了西洋参多糖。
实施例3：离子色谱法检测多糖的单糖组成
使用岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸、古罗糖醛酸作为单糖标准。
（1）称取样品5 mg加入1mL 2M三氟乙酸（TFA, 3 mol/L）在 121℃下加热3小时；
（2）然后，在氮气流下干燥。随后，加入50mL 水进行涡旋混合；
（3）过滤后，使用配备有 Dionex™ CarboPac™ PA20（150*3.0mm，10μm）液相色谱柱和电化学检测器的HPIC分析上清液；
（4）0.1M NaOH、0.1 M NaOH 和0.2M NaAc用作流动相，流速设定为0.5 mL/min，进样量为5uL，柱温为30℃；
（5）单糖标准溶液按上述相同方法处理，根据单糖的摩尔质量计算摩尔比；
（6）通过HPIC分析了不同分子量的西洋参多糖样品的单糖组成，其组成是使用IC和通过匹配色谱曲线中的保留时间与单糖标准物质的保留时间来确定的，结果如表1和图3所示。
表1 西洋参多糖的单糖组成结果
| 半乳糖醛酸 | 阿拉伯糖 | 鼠李糖 | 半乳糖 | 葡萄糖 | |
| 样品名称 | Gal-UA | Ara | Rha | Gal | Glc |
| 西洋参多糖 | 11.41% | 2.39% | 0.85% | 3.92% | 81.42% |
实施例4：检测西洋参多糖对于DPPH自由基的抑制作用并检测其与香菇多糖联用的效果
（1）配制0.1mM的 DPPH溶液：配两次，每次取0.002gDPPH溶于50mL乙醇，避光保存。
（2）按照如下分组进行实验：
空白组:样品溶液100uL+无水乙醇100uL(每个浓度3个孔)
对照组:DPPH醇溶液100uL+水100uL(一块板可共用一个对照组,3个孔)
西洋参多糖组:0.5mg/ml的西洋参多糖)溶液100uL+DPPH醇溶液100uL(每个浓度3个孔)；
香菇多糖组：0.5mg/ml的香菇多糖溶液100uL+DPPH醇溶液100uL(每个浓度3个孔)，香菇多糖的CAS号为 37339-90-5；
西洋参多糖+香菇多糖组：1mg/ml的西洋参多糖+1mg/ml香菇多糖的混合溶液100uL+DPPH醇溶液100uL(每个浓度3个孔)；
（3）上板：避光操作，上完板后，室温避光30分钟，测517nm处吸光度；
（4）检测并计算清除率，取吸光度的平均值，计算每个浓度的DPPH清除率，做出折线图，清除率= (1-(Asample - Ablank）/Acontrol）* 100%，实验结果如图3所示。
如图3所示，可以看出西洋参多糖能够有效的清除DPPH自由基，且当将西洋参多糖和香菇多糖联用的时候可以产生协同的效果，高于二者单独使用。
实施例5：检测西洋参多糖对于ABTS自由基的抑制作用并检测其与香菇多糖联用的效果
（1）配制 ABTS+溶液，用PBS 将 ABTS+溶液稀释至吸光度为 〔0.70士0.02）（Abs=734 nm处）；
（2）按照如下分组进行实验：
空白组：10uL的不同浓度样品液和200 uL的PBS 液（A0）；
对照组：加入 210uL的 ABTS溶液（A1）；
西洋参多糖组：0.5mg/ml的西洋参多糖溶液10uL+ 200uL的ABTS+溶液；
香菇多糖组：0.5mg/ml的香菇多糖溶液10uL+ 200uL的ABTS+溶液；
西洋参多糖+香菇多糖组：1mg/ml的西洋参多糖5 uL +1mg/ml香菇多糖的混合溶液5 uL + 200uL的ABTS+溶液；
（3）振摇6 min后检测其在734 nm处的吸光度（Aa)，将测定值代入一下公式计算清除率：
ABTS+自由基清除率( %）=1-(Aa-A0/A1) ×100%
得到的结果如图4所示，从图4可以看出，西洋参多糖可以有效的清除ABTS自由基，并且当将其和香菇多糖联用的时候可以产生显著的协同效果。
实施例6：检测西洋参多糖对于骨髓间充质干细胞增殖的影响并检测其与香菇多糖联用的效果
（1）将本实验室保存的P3代骨髓间充质干细胞复审后培养至P3代，将P3代的骨髓间充质干细胞消化后制备成细胞悬液并进行计数；
（2）按照每孔1×104的量将100uL的细胞悬液接种到96孔中，置于细胞培养箱中培养24h；
（3）按照如下分组进行实验：
对照组：更换为DMEM培养基；
西洋参多糖组：更换为含有5mg/ml的西洋参多糖的DMEM培养基；
香菇多糖组：更换为含有5mg/ml的香菇多糖的DMEM培养基；
西洋参多糖+香菇多糖组：更换为含有5mg/ml的西洋参多糖和5mg/ml的香菇多糖的DMEM培养基；
（4）放入细胞培养箱中继续培养24h后，每孔加入10ul CCK-8溶液，37℃孵育3h后，测定450nm吸光度并计算各处理组相对于对照组的细胞增殖促进率，结果如图5所示。
从图5可以看出，相对于对照组，西洋参组的细胞增殖促进率为27.25±2.91，香菇多糖组的细胞增殖促进率为23.09±2.01，西洋参多糖＋香菇多糖组的细胞增殖促进率为64.84；
根据金氏公式q＝E（A＋B）／（EA＋EB－EA·EB），得到西洋参多糖和香菇多糖联用的q值为1.47，说明二者联用可以对骨髓间充质干细胞的增殖产生协同作用。
实施例7：检测西洋参多糖对于骨髓间充质干细胞成骨分化的影响并检测其与香菇多糖联用的效果
（1）将P3代的骨髓间充质干细胞消化后制备成细胞悬液并进行计数；
（2）按照每孔2×105的量将细胞悬液接种到6孔中，置于细胞培养箱中进行培养；
（3）待细胞密度达到80%以上时，按照如下分组（每组设置3个孔的重复）进行实验：
空白组：更换为DMEM培养基；
对照组：更换为成骨分化培养基；
西洋参多糖组：更换为含有5mg/ml的西洋参多糖的成骨分化培养基；
香菇多糖组：更换为含有5mg/ml的香菇多糖的成骨分化培养基；
西洋参多糖+香菇多糖组：更换为含有5mg/ml的西洋参多糖和5mg/ml的香菇多糖的成骨分化培养基；
（4）每2天进行一次换液，培养7天后，使用ALP酶检测试剂盒检测ALP酶活性，并计算各组相对于空白组的相对AL酶活性，实验结果如图6所示。
从图6可以看出，使用成骨培养基培养骨髓间充质干细胞后，可以有效的提高细胞中ALP酶活性；
同时，可以看出，西洋参多糖组的ALP酶相对活性相较于对照组增加了33.41%，香菇多糖组的ALP酶活性相较于对照组增加了25.85%，西洋参多糖+香菇多糖组的ALP酶活性相较于对照组增加了71.78%，说明西洋参多糖能够有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化；
根据金氏公式q＝E（A＋B）／（EA＋EB－EA•EB），得到西洋参多糖和香菇多糖联用的q值为1.42，说明二者联用可以协同的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
实施例8：检测西洋参多糖对于成骨转化关键蛋白RUNX2表达的影响
（1）将P3代的骨髓间充质干细胞消化后制备成细胞悬液并进行计数；
（2）按照每孔2×105的量将细胞悬液接种到6孔中，置于细胞培养箱中进行培养；
（3）待细胞密度达到80%以上时，按照如下分组（每组设置3个孔的重复）进行实验：
空白组：更换为DMEM培养基；
对照组：更换为成骨分化培养基；
西洋参多糖组：更换为含有5mg/ml的西洋参多糖的成骨分化培养基；
香菇多糖组：更换为含有5mg/ml的香菇多糖的成骨分化培养基；
西洋参多糖+香菇多糖组：更换为含有5mg/ml的西洋参多糖和5mg/ml的香菇多糖的成骨分化培养基；
（4）每2天进行一次换液，培养7天后，去除培养基，加入蛋白裂解液提取蛋白样品；
（5）将收集的蛋白于 10% SDS-PAGE分离胶中进行电泳分离，随后通过湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜上，300m A，2 h；
（6）接着进行膜封闭1 h，然后与一抗进行杂交反应，4 ℃ 过夜；
（7）次日进行二抗杂交，并通过使用超敏 ECL 发光液显色对蛋白表达水平进行检测，结果如图7所示。
从图7可以看出，相较与空白组，对照组的RUNX2的表达明显升高，说明成功诱导成骨分化，西洋参多糖组相较于对照组明显升高，说明西洋参多糖可以有效的促进骨髓间充质干细胞中RUNX2的蛋白表达；
同时，可以看出，西洋参多糖和香菇多糖联用时的RUNX2的表达量最高，说明西洋参多糖和香菇多糖联用时可以对成骨分化关键蛋白RUNX2的蛋白表达产生协同促进作用。
Claims (9)
1.一种用于治疗骨质疏松的药物，其特征在于，所述药物的核心组成成分包括西洋参多糖和香菇多糖，所述药物中西洋参多糖和香菇多糖的质量比为1:1。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述西洋参多糖的单糖组成为81.42%Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物通过西洋参多糖和香菇多糖协同清除DPPH自由基和ABTS自由基，协同促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化发挥治疗骨质疏松的作用。
4.一种用于促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的药物，其特征在于，所述药物的核心组成成分包括西洋参多糖和香菇多糖，所述药物中西洋参多糖和香菇多糖的质量比为1:1；
所述西洋参多糖的单糖组成为81.42% Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
5.西洋参多糖在制备骨质疏松治疗药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述西洋参多糖的单糖组成为：81.42%Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物能够通过西洋参多糖清除DPPH自由基和ABTS自由基，促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化,从而发挥治疗骨质疏松的作用。
8.西洋参多糖在制备促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述西洋参多糖的单糖组成为：81.42%Glc，11.41% Gal-UA，3.92% Gal，2.39% Ara，0.85% Rha。
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