CN116763736A - 载多柔比星的抗肿瘤止血微球及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供一种通过简易、安全、低成本的方式构建的载多柔比星的抗肿瘤止血微球及其制备和应用，载多柔比星的抗肿瘤止血微球，包含海藻酸盐、止血组分A、多柔比星或多柔比星脂质体、交联剂，止血组分A选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白中的一种或多种，解决肿瘤切除手术中易出血、化疗药物毒性大、给药剂量大、给药频繁等实际痛点问题，实现在术中快速止血，术后精准靶向给药、降低毒副作用、长效药物缓释，同时该体系所有成分安全可靠，具有良好的生物相容性。

Description

载多柔比星的抗肿瘤止血微球及其制备和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种载多柔比星的抗肿瘤止血微球及其制备和应用。
背景技术
虽然肿瘤医学经历了数十年的快速发展，诞生了免疫疗法、激素疗法、基因治疗等新兴的抗肿瘤疗法，但传统的手术切除结合化疗仍是目前对抗实体瘤最有效的手段。然而，术中易出血、术后局部肿瘤易复发和转移、术后患者健康状态差不宜接受全身化疗等问题限制了其实际疗效。残留的肿瘤细胞和手术创伤引起的肿瘤微环境改变会刺激残留肿瘤细胞疯狂增殖、转移。因此，迫切需要制定一种治疗方案，既能在肿瘤切除手术中起快速止血，又能在术后消除手术部位残留的肿瘤细胞，隔绝微环境抑制肿瘤复发，最大限度地减少癌细胞转移的风险，为化疗“窗口期”争取宝贵的时间。
近些年来，在药物递送领域利用纳米颗粒改善药物溶解性、提高药物稳定性和药物靶向递送备受关注，尤其是脂质体纳米囊泡。如中国专利CN111407742B公开了一种抗肿瘤纳米颗粒及其制备方法和应用，该纳米颗粒能够在肿瘤部位富集，同时通过细胞囊泡解体释放出其中的装载物进入到肿瘤部位更深层次进行治疗。在此技术中，大粒径的细胞囊泡具有腔体，其腔体用于负载装载物，装载物包括具有光热作用的量子点，细胞囊泡能够作为载体延长其体内循环时间并且富集于肿瘤部位，其腔体内的装载物也富集于肿瘤部位，此时对抗肿瘤纳米颗粒施加光刺激能够使细胞囊泡解体释放出小粒径的装载物，小粒径的装载物能够进入到肿瘤部位更深层次进行治疗，具有光热作用的量子点有光热治疗作用。
中国专利CN109481418A公开了一种抗肿瘤纳米颗粒，包括核心、包覆核心的包裹层及包覆包裹层的免疫层。其中，核心包括光敏剂，具有成像引导光动力治疗的作用，包裹层包括高分子有机化合物，将其包覆于核心外形成纳米颗粒，使得纳米颗粒的粒径可调控，合成的纳米颗粒具有符合增强渗透滞留效应的粒径范围，稳定性更高，免疫层包括免疫佐剂，将免疫层包覆于纳米颗粒外，能够使纳米颗粒具有主动靶向性，并且，免疫佐剂还具有引起免疫反应的功能。由免疫佐剂包裹纳米颗粒得到的抗肿瘤纳米颗粒能够达到同时具有光动力治疗和免疫治疗的联合治疗效果，对靶组织及损伤程度具有可选择性，可控性强，可减少对正常组织的损伤，更安全，同时通过增强患者自身免疫力来治疗肿瘤，同时具有反应快、效率高、无副作用、疗效持久、稳定且对预防术后复发具有重要作用等特点。
多柔比星脂质体纳米颗粒(例如：DOX)被FDA批准使用到现在，已被广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、骨癌、肺癌、脑癌、白血病、艾滋病等相关疾病。该脂质体的粒径控制在85到100纳米之间，使之可以利用肿瘤EPR效应在肿瘤组织中富集、滞留(只能透过肿瘤组织血管内皮细胞间隙，100-400nm)，因此，显著提高了多柔比星的实际疗效，降低了毒副作用。尽管如此，多柔比星脂质体仍然具有不可忽视的血液毒性和心脏毒性。一方面由于多柔比星脂质体制剂采用静脉注射的方式，药物不可避免的进入正常细胞和组织产生非靶向的毒副作用；另一方面，由于多柔比星脂质体是一种毒性强大的化疗药物，因此临床很少作为原位的局部治疗的选择。这些问题都限制了多柔比星脂质体的实际抗肿瘤疗效，因此，多柔比星脂质体仍需更合理、科学的使用管理。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种通过简易、安全、低成本的方式构建的载多柔比星的抗肿瘤止血微球及其制备和应用，解决肿瘤切除手术中易出血、化疗药物毒性大、给药剂量大、给药频繁等实际痛点问题，实现在术中快速止血，术后精准靶向给药、降低毒副作用、长效药物缓释，同时该体系所有成分安全可靠，具有良好的生物相容性。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案是：
一种载多柔比星的抗肿瘤止血微球，包含海藻酸盐、止血组分A、多柔比星或多柔比星脂质体、交联剂，止血组分A选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白中的一种或多种。
优选地，海藻酸盐与止血组分A与多柔比星或多柔比星脂质体的质量比为0.1-5:1000-10:1000-10，优选为0.5-5:100-10:100-10，进一步优选为1-5:50-25:50-25。
优选地，微球的平均粒径为200-2000μm，优选为200-800μm。
优选地，海藻酸盐选自海藻酸钠；
优选地，交联剂选自含Ca2+交联剂、含Ba2+交联剂、含Cu2+交联剂或戊二醛中的一种或多种。
为解决以上技术问题，本发明采取的又一技术方案是：
一种如上所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制海藻酸盐溶液和止血组分A溶液，将两种溶液混合均匀，得到基质溶液；
(2)药物与基质溶液混合：将步骤(1)中得到的基质溶液与多柔比星药液混合均匀，将混合溶液转移至无菌注射器内，静置，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入交联剂溶液中，持续磁力搅拌使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置，弃上清，无菌纯水洗涤，收集获得微球。
优选地，步骤(1)中海藻酸盐的质量百分比浓度为0.1-15％，止血组分A的质量百分比浓度为0.1-15％；
优选地，步骤(1)中海藻酸盐溶液与止血组分A溶液以体积比1-10：0.1-10混合，更优选地以1：1混合。
优选地，步骤(2)中基质溶液与多柔比星药液的体积比为50-1:1；
优选地，多柔比星药液选自多柔比星脂质体或多柔比星水溶液；
优选地，多柔比星水溶液中多柔比星的浓度为2mg/mL；
优选地，多柔比星脂质体的浓度为2mg/mL。
优选地，步骤(3)中注射器的针头口径为0.001-0.16mm，针头距离交联剂液面为3-8cm，注射速度为2-7mL/min；
优选地，交联剂溶液为CaCl2溶液，CaCl2的重量百分数为0.5-15％。
优选地，还包括步骤(4)冷冻干燥：加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，即得。
为解决以上技术问题，本发明采取的又一技术方案是：
如上所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球在制备抗肿瘤药物和/或止血药物上的应用。
本发明还公开了上述止血微球产品在用于SD大鼠半截尾止血、SD大鼠肝损伤止血、人胰腺癌荧光株细胞PANc-l-luc等实验的应用效果。
本发明的作用机理为：含多柔比星的止血微球经冷冻干燥后具有微米级孔径，内部疏松多孔，具有极高的吸水溶胀倍率，并且成功负载了多柔比星，其载药量和封装效率较高(大于95％)。在模拟的实体瘤切除模型中，一方面利用海藻酸钠和羧甲基壳聚糖的高吸水溶胀特性，强细胞粘附性，快速富集血细胞和凝血因子，形成物理栓塞堵塞减少血液流失，另一方面释放Ca2+进入细小的组织缝隙体液中加速凝血级联反应形成稳定的血栓凝块快速止血，接着利用纤溶系统缓慢降解血栓凝块和水解酶系统降解凝胶基质，缓慢释放多柔比星，直接原位靶向递送抗肿瘤药物至剩余肿瘤组织，对残余肿瘤细胞起细胞毒性杀伤作用，并形成物理屏障防止残留肿瘤细胞转移至周围其他器官和血管。
由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明通过简易、安全、低成本的方式构建多柔比星/海藻酸钠/羧甲基壳聚糖载药止血微球，该体系所有成分安全可靠，具有良好的生物相容性；
2、本发明通过简洁、绿色、低毒的制备工艺达到良好的制备效果，载药量高、药物封装效率高、无引入其他化学试剂，使用安全；
3、本发明的止血微球止血时间短，在SD大鼠的半截尾模型和肝损伤模型中均在1min作用完成凝血；
4、本发明术后精准靶向给药，强效抗肿瘤，降低了化疗药物的非靶向毒性，降低给药频次和给药剂量；
5、本发明使用方便，在切除手术后直接敷于伤口部位即可，且能够长效药物缓释；
6、本发明易储存，保存时间长；
7、本发明止血微球中的海藻酸钠和羧甲基壳聚糖具有可被水解的性质，降解性能好、无免疫原性。
附图说明
图1为实施例1-5抗肿瘤止血微球产品的扫描电镜图；
图2为实施例1-4抗肿瘤止血微球产品的载药量、封装效率、体外缓释、溶胀、降解图，其中：(a)载药量图；(b)封装效率图；(c)溶胀率图；(d)降解率图；(e)体外释放曲线；(f)24h内药物释放曲线；
图3为实施例1-4抗肿瘤止血微球产品的体外止血性能评估图(****:P<0.0001)，其中：(a)全血倒置实验结果图；(b)血栓凝块扫描电镜图；(c)血小板聚集率图；
图4为实施例1-4抗肿瘤止血微球产品的SD大鼠半结尾模型止血性能评估图(**：P<0.01，***:P<0.001)，其中：(a)尾部伤口图；(b)凝血时间图；(c)出血量图；
图5为实施例1-4抗肿瘤止血微球产品的SD大鼠肝损伤模型止血性能评估图(*：P<0.05，***:P<0.001,****：P<0.0001)，其中： (a)：1、术前图；2、术中图；3、术后图； (b)凝血时间图；(c)出血量图；
图6为实施例1-2抗肿瘤止血微球产品的裸鼠模型抗肿瘤性能评估图，其中：(a)21天后肿瘤解剖图(×代表无肿瘤)；(b)肿瘤HE染色图；(c)肿瘤质量图；(d)裸鼠体重监测图；(e)肿瘤细胞活体成像图；(f)活体成像的荧光定量分析图；
图7为实施例6-8抗肿瘤止血微球产品的扫描电镜图；
图8为实施例5-8抗肿瘤止血微球产品的全血凝血性能评估图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体技术或条件者，通常按照本领域内的文献所描述的常规技术或条件，或者按照产品说明书及制造商建议的条件进行。
除非另有指明，各种起始原料、材料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成。
本发明一种载多柔比星的抗肿瘤止血微球，包含海藻酸盐、止血组分A、多柔比星或多柔比星脂质体、交联剂，止血组分A选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白中的一种或多种。
在某些具体的实施例中，海藻酸盐与止血组分A与多柔比星或多柔比星脂质体的质量比为0.1-5:1000-10:1000-10，优选为0.5-5:100-10:100-10，进一步优选为1-5:50-25:50-25。
在某一具体的实施例中，海藻酸盐与止血组分A与多柔比星的质量比为1:50:50。
在某一具体的实施例中，海藻酸盐与止血组分A与多柔比星的质量比为1:25:25。
在某一具体的实施例中，海藻酸盐与止血组分A与多柔比星脂质体的质量比为1:50:50。
在某一具体的实施例中，海藻酸盐与止血组分A与多柔比星脂质体的质量比为1:25:25。
在某些具体的实施例中，微球的平均粒径为200-2000μm，优选为200-800μm，进一步优选为400-600μm。
在某一具体的实施例中，微球的平均粒径可以为400μm，500μm，600μm。
在某些具体的实施例中，海藻酸盐选自海藻酸钠(SA)。海藻酸盐(SodiumAlginate，SA)是从褐藻中提取的天然线性阴离子多糖，具有优秀的生物相容性、无毒、无免疫原性、易凝胶化、易获得等特点，被认为是一种优良的止血高分子生物材料，是FDA批准使用的安全材料。海藻酸盐的α-L-葡萄糖醛残基可与多价阳离子(Ca2+是最常见的离子)共价交联形成蛋盒构象水凝胶。在止血领域，海藻酸盐/Ca2+交联体系表现出优异的凝血性能。其机制有(1)因为该体系可通过缓控释放Ca2+，该离子是血小板激活以及几种凝血级联反应的辅助因子；(2)海藻酸盐基伤口辅料具有出色的吸水溶胀能力，在接触血液时能大量聚集血液中的血细胞，封闭毛细血管和小血管，对出血的创面进行物理压迫，加速血栓的形成。
在某些具体的实施例中，止血组分A选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白中的一种或多种，优选为羧甲基壳聚糖。
壳聚糖(Chitosan，Cs)及其衍生物是生物止血材料领域研究最多的多糖之一，因其有抗菌、止血、镇痛、生物相容性好等特性，被广泛用于外科手术、药物递送、组织工程等领域。关于其凝血机制，首先，由于含有带正电荷的氨基，可以吸引、富集带负电荷的血液细胞，当与红细胞接触时，会暴露出红细胞表面的磷脂酰丝氨酸酶，从而激活固有的凝血途径；其次，壳聚糖与血液接触后吸收血小板、血浆蛋白(包括纤维蛋白原)，随后粘附在壳聚糖上的血小板与纤维蛋白原相互作用，导致细胞内Ca2+浓度升高，从而刺激血小板活化，启动内源性凝血级联反应。在某一具体的实施例中，本发明选用羧甲基壳聚糖。
在某些具体的实施例中，交联剂选自含Ca2+交联剂、含Ba2+交联剂、含Cu2+交联剂或戊二醛中的一种或多种。
在某一具体的实施例中，含Ca2+交联剂选自CaCl2。
在某一具体的实施例中，含Cu2+交联剂选自CuSO4。
在某一具体的实施例中，含Ba2+交联剂选自BaCl2。
如上所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制海藻酸盐溶液和止血组分A溶液，将两种溶液混合均匀，得到基质溶液；
(2)药物与基质溶液混合：将步骤(1)中得到的基质溶液与多柔比星药液混合均匀，将混合溶液转移至无菌注射器内，静置，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入交联剂溶液中，持续磁力搅拌使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置，弃上清，无菌纯水洗涤，收集获得微球。
在某些具体的实施例中，步骤(1)中海藻酸盐的质量百分比浓度为0.1-15％，还可以为0.1-12％，0.1-10％，0.1-8％，0.1-5％，更具体的可以为0.5％，1％，2％，3％，4％，5％。
在某些具体的实施例中，步骤(1)中止血组分A的质量百分比浓度为0.1-15％，还可以为0.1-12％，0.1-10％，0.1-8％，0.1-5％，更具体的可以为0.5％，1％，2％，3％，4％，5％。
在某一具体的实施例中，步骤(1)中止血组分A选自羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖的质量百分比浓度为0.1-15％，还可以为0.1-12％，0.1-10％，0.1-8％，0.1-5％，更具体的可以为0.5％，1％，2％，3％，4％，5％。
在某一具体的实施例中，步骤(1)中海藻酸盐的质量百分比浓度为2％。
在某一具体的实施例中，步骤(1)中止血组分A的质量百分比浓度为2％。
在某些具体的实施例中，步骤(1)中海藻酸盐溶液与止血组分A溶液以体积比1-10：0.1-10混合，还可以为1-5：0.1-5，1-3：0.1-5，1-3：0.1-3，更优选地以1：1混合。
在某些具体的实施例中，步骤(2)中基质溶液与多柔比星药液的体积比为50-1:1，还可以为20-1:1，15-1:1，12-5:1，10-5:1，更具体的可以为5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1。
在某些具体的实施例中，多柔比星药液选自多柔比星脂质体或多柔比星水溶液。
在某些具体的实施例中，多柔比星水溶液中多柔比星的浓度为2mg/mL。
在某些具体的实施例中，多柔比星脂质体的浓度为2mg/mL。
在某些具体的实施例中，步骤(3)中注射器的针头口径为0.001-0.16mm，优选为0.16mm，针头距离交联剂液面为3-8cm，注射速度为2-7mL/min。
在某一具体的实施例中，步骤(3)中针头距离交联剂液面为5cm，注射速度为4.5mL/min。
在某些具体的实施例中，交联剂选自含Ca2+交联剂、含Ba2+交联剂、含Cu2+交联剂或戊二醛中的一种或多种。
在某一具体的实施例中，含Ca2+交联剂选自CaCl2。
在某一具体的实施例中，含Cu2+交联剂选自CuSO4。
在某一具体的实施例中，含Ba2+交联剂选自BaCl2。
在某一具体的实施例中，交联剂溶液为CaCl2溶液，CaCl2的重量百分数为0.5-15％，还可以为0.5-12％，0.5-10％，2-8％，优选为5％。
在某些具体的实施例中，还包括步骤(4)冷冻干燥：加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，即得。
在某些具体的实施例中，将冷冻干燥处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
如上所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球在制备抗肿瘤药物和/或止血药物上的应用。
实施例1
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的羧甲基壳聚糖溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与多柔比星脂质体(2mg/mL)药液按体积比10：1混合均匀(编号SCs-lip-1)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例2
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的羧甲基壳聚糖溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与多柔比星脂质体(2mg/mL)药液按体积比5：1混合均匀(编号SCs-lip-2)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例3
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的羧甲基壳聚糖溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与2mg/mL的多柔比星水溶液药液按体积比10：1混合均匀(编号SCs-DOX-1)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例4
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的羧甲基壳聚糖溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与2mg/mL的多柔比星水溶液药液按体积比5：1混合均匀(编号SCs-DOX-2)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例5
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的羧甲基壳聚糖溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与多柔比星脂质体(2mg/mL)药液按体积比10：1混合均匀(编号SCs-lip-3)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)将微球放入-80℃冰箱预冷过夜，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例6
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的透明质酸溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与多柔比星脂质体(2mg/mL)药液按体积比5：1混合均匀(编号SH-lip-2)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例7
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的胶原蛋白溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与多柔比星脂质体(2mg/mL)药液按体积比5：1混合均匀(编号SCol-lip-2)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
实施例8
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制2％质量百分比浓度的海藻酸钠溶液和2％质量百分比浓度的丝素蛋白溶液，将两种溶液以体积比1：1混合均匀，得到基质溶液，备用；
(2)药物与基质溶液混合：随后将上述基质溶液与多柔比星脂质体(2mg/mL)药液按体积比5：1混合均匀(编号SSF-lip-2)，接着将混合溶液转移至无菌注射器内，放入4℃冰箱静置2h，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器(针头口径0.16mm)装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入50mL的5％的CaCl2溶液中，针头距离交联剂液面5cm，注射速度为4.5mL/min，持续磁力搅拌交联10min，使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置5min，弃上清，加入50mL无菌纯水洗涤3次，收集获得微球；
(4)加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，将处理后的微球放入棕色样品瓶密封，-20℃保存。
测试例
1、微球扫描电镜分析
目的：观察实施例1-5微球产品和基底材料组(SCs)的微观形貌特征
方法：为了观察止血微球的表面形貌，将微球样品表面镀金后使用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800，Japan)进行扫描，结果如附图1所示。
结果：附图1显示在干燥状态下微球直径约1mm，微球表面褶皱，内部呈现疏松多孔的网状结构，这种结构可显著提高微球的比表面积，提高吸水溶胀倍率。放大50000倍后可清晰看见脂质体颗粒(约100nm)附着在微球表面，由于交联密度较高，机械性能较好，微球在冻干过程中仍能保持良好了球形形貌，无塌陷痕迹。液氮预冷处理后的微球冷冻干燥后能更好保持微球形貌，而-80℃处理预冷的样品塌陷严重，无法维持其正常形貌。
2、载药与封装、体外缓释、溶胀与降解分析
目的：测定实施例1-4微球产品的药物负载能力、药物释放行为、吸水溶胀与降解性能
方法：载药量与封装效率测定：标准曲线绘制参照中国药典2015版第二部，取适量多柔比星标准品加入适量甲醇稀释至0、10、20、30、40、50μg/mL，使用紫外分光光度计测量OD478(n＝3)。待测样品称取2mg，加2mL 1×PBS缓冲液(pH＝7.4)在37℃使之充分溶胀。随后12000rpm离心10min，取上清液测量OD478。每个样品3次平行重复，计算载药量和封装效率，结果如附图2(a)和(b)所示。
载药量EE％＝药物含量/材料总质量×100％
封装效率EF％＝药物含量/药物理论量×100％
体外缓释：为了模拟止血微球在体外的药物释放模型，取10mg微球与4mL PBS溶液(pH＝7.2)37℃共同孵育，在0h、0.5h、2h、6h、24h、48h、72h、96h、120h取100μL上清液(补充等量新的PBS)放入-20℃冰箱保存。用甲醇配制10μg/mL的DOX(多柔比星)标准品溶液，按照20、15、10、5、0μL进样量绘制标准曲线。取出上清液，室温溶解后加入200μL色谱级甲醇，漩涡震荡5min后12000rpm离心10min。取100μl转入进样瓶中用于高效液相色谱，测定样品溶液中的多柔比星含量，结果如附图2(e)和(f)所示。
液相条件：仪器型号(Agilent 1100Series)，色谱分离柱(Agilent Zorbax 300SBC18250mm×4.6mm，5mm)，荧光探测器(FLD G1321A)。流动相为32.5％乙腈、67.4％水和0.1％三乙胺，并用磷酸调节pH＝3，超声震荡后用0.22μm滤膜过滤备用。进样流速设定为1mL/min，温度设置为37℃，激发波长和接收波长分别设为480和560nm。
溶胀与降解：为了研究抗肿瘤止血微球的吸水溶胀能力，称取2mg微球，记录EP管重(W0)和含微球的EP管重量(W1)。通过在2mL的pH＝7.2的PBS溶液中37℃孵育1h、2h、6h、24h、48h、72h。12000rpm离心2min去除多余液体后，记录湿重(W2)。每次记录完补充新鲜的2mLPBS溶液。采用以下公式计算膨胀率，结果如附图2(c)所示：
溶胀率(％)＝(W2-W1)/(W1-W0)×100％
为了模拟微球在体内的降解，称取2mg微球，加入2mL PBS充分溶胀后，离心去除上清液，记录初始湿重(W0)。随后孵育在37℃含有1.5μg/mL溶菌酶的PBS(pH＝7.2)中。最后，在0h、5h、10h、15h取出离心，去除上清液记录湿重(W1)。用以下公式计算生物降解率，结果如附图2(d)所示：
降解率(％)＝(W0-W1)/W0×100％
结果：附图2(a)和(b)表明SCs-lip-1载药量在1％左右，而SCs-lip-2载药量在2％左右，存在较好的剂量效应，符合理论剂量差异。与此同时SCs-lip系列微球的载药量和封装效率均显著比游离剂量组SCs-DOX高，这表明脂质体负载的多柔比星可以更好地结合到SA/CMCs复合基质中，形成更稳定的体系。
附图2(e)和(f)显示，在足量的PBS缓冲介质中，所有样品均在24h左右达到释放峰值，随后开始缓慢下降(其原因可能是DOX在碱性条件中不稳定，缓慢降解)。值得注意的是SCs-lip载药微球呈现典型的双相释放行为(先快后慢)，这种释放模型既可以在短时间内起到良好疗效，还可以长时间持续释放药物，维持作用浓度。然而这种短期的突释行为并不都是理想的，释放过量则会导致药物易被机体降解、药物滞留时间短等问题使得药物疗效变差。因此，申请人对快速释放相(0-24h)累积释放药物量与理论最大释放量进行对比，结果表明快速释放相累积释放药物含量均在20％左右。这是一个比较合理的结果，既保证了能快速释放药物起疗效，也保证了不会因为突释过量导致药物缓释时间短。这些结果表明基于SCs-lip系列止血微球有着出色的药物缓释性能。
附图2(c)显示，所有样品在6h左右达到最大溶胀倍率，值得注意的是，基底材料组(SCs)在1h内迅速达到最大溶胀倍数69.8±14.1后迅速降解，其原因可能是由于羧甲基壳聚糖由于交联密度极低，不断溶解于更换的缓冲液体系中导致质量迅速下降，而SCs-lip-2时所有材料组中吸水能力最好的，其最大溶胀率达到出色的74.2±11.2倍。强大的吸水倍率是止血性能的保证，可快速吸收、聚集血液中的血细胞和凝血因子，促进血栓的形成。
在达到最大溶胀倍率后，模拟了微球在体内的降解行为。由于人体在自然条件下并无海藻酸盐的专一性降解酶，但可以通过Ca2+与体液中的单价阳离子发生置换，瓦解其交联体系达到降解作用，因此在PBS缓冲体系中引入了溶菌酶，模拟其在体内被酸性的多糖降解酶降解的行为。附图2(d)显示，所有样品在15h内缓慢降解，最大降解率仅20％左右，这种缓慢的降解，有利于药物的缓慢释放，延长药物滞留时间，并降低药物突释带来的风险。
3、体外凝血分析
目的：体外研究实施例1-4止血微球产品的凝血性能、血细胞富集性能
方法：全血倒置实验：称取5mg止血材料(各3份)于1.5mL Ep管中(以市售止血微球CELOX作为阳性对照)，加入500μL兔抗凝血，涡旋振荡器振荡5s，每隔100s将试管倒置，观察试管中血液流动性。BK为空白对照组。若血液可流动，则重置管路，直至血液完全凝固或时间超过600s。记录完全凝固所需时间，结果如附图3(a)所示。
血细胞吸附能力：取上述倒管实验结束后(30min以后)的血栓用2mL无菌PBS洗涤两次，以去除未粘附的血细胞，加入0.5mL的2％戊二醛(电镜固定液)固定2h。随后取出血栓样品，用2mL乙醇梯度脱水(20、50、70、100％，每个步骤12h，4℃冰箱)。将脱水后的样品室温通风干燥过夜后，切成小块固定在电镜硅片上，喷金后用扫描电子显微镜观察样品对血细胞的吸附情况，结果如附图3(b)所示。
血小板聚集：取15mL新西兰兔全血(购自杭州师范大学动物实验中心)于15mL离心管中，800rpm，8min离心3次，收集富含血小板的血浆(PRP)上清液，接着取2.5mg止血样品分别(每个样品3个重复)与0.5mL兔血小板悬浮液RPR混合(CELOX作为阳性对照)。孵育1分钟、3分钟和5分钟后，每管收集10μL上清液，稀释后用倒置荧光显微镜计数血小板的数量，以聚集前血小板数量(BA)作为空白对照。根据以下公式计算血小板聚集率(AGR)，结果如附图3(c)所示：
AGR＝(BA-AA)/AA×100％(BA：聚集前血小板数；AA：聚集后血小板数)
结果：附图3(a)显示，脂质体复合微球(SCs-lip)表现出优秀的凝血能力，在100s内形成稳定的血栓凝块。游离DOX组(SCs-DOX)和基底材料组(SCs)同样可在200s内形成稳定的血栓凝块。其原因可能一方面得益于载脂质体微球在接触血液后，迅速释放大量Ca2+加速凝血，另一方面得益于冷冻干燥工艺和高比表面积带来的高溶胀高吸水倍率。而商业市售CELOX在5mg剂量时并不能提供足够的凝血性能，在长时间静置(500s)后仍然不能形成稳定的血栓凝块。
进一步对血栓凝块进行扫描电子显微镜微观成像，附图3(b)显示，止血材料表面吸附大量的血细胞，可清晰看见红细胞(圆盘型)和活化血小板(星状)。
附图3(c)显示，虽然血小板聚集实验显示所有材料组在血小板富集率上无显著差异，但均与阳性对照CELOX组存在极显著差异(P<0.0001)。综上结果表明，SCs-lip系列止血微球通过高吸水溶胀倍率富集血细胞和凝血因子加速血液固化。
4、SD大鼠半截尾止血模型分析
目的：评估实施例1-4微球产品在血流量较大、血压较高的SD大鼠尾静脉和动脉模型中的凝血性能
方法：42只雄性SD大鼠(200-250g)随机分成7组，使用干纱布作为空白对照(BK)，市售止血微球CELOX作为阳性对照。腹腔注射戊巴比妥(30mg/kg)麻醉，用外科手术刀剪掉一半的大鼠尾巴之后，静置15s使鼠尾正常出血，随后将鼠尾浸没于装有预先称重含20mg止血材料的5mL EP管中，以最小的压力覆盖伤口，记录止血过程中凝血时间(s)和失血量(g)，结果如附图4所示。所有大鼠在实验结束后以符合动物伦理要求安乐处死。
结果:大鼠尾部富含尾静脉和一条尾动脉，因此常被用于评估止血材料的止血性能，由于动脉压和静脉压的存在，截尾模型十分考验止血材料黏附能力和快速止血能力。附图4显示，在相同质量(20mg)时，含脂质体的止血微球SCs-lip-1和SCs-lip-2表现出极为出色的凝血性能。在伤口正常出血后，浸没在止血微球SCs-DOX-2、SCs-lip-1和SCs-lip-2可在短时间内50s内将血液完全止血，显著优于空白对照组(***P<0.001)和阳性对照组(评估标准为伤口在20s内不再滴血)，并且其失血量较少。SCs-lip-2组的失血量和凝血时间均显著优于市售止血微球CELOX。
5、SD大鼠肝损伤止血模型分析
目的：评估实施例1-4微球产品在SD大鼠肝损伤模型中的凝血性能
方法：42只SD雄性大鼠被随机分成7组，每组6只，使用干纱布作为空白对照(BK)，市售止血微球CELOX作为阳性对照。使用戊巴比妥(30mg/kg)麻醉大鼠后，沿大鼠腹中线切开皮肤，暴露出肝脏并用开口器固定伤口，随后用干净无菌纱布擦去肝脏表面多余液体，接着用无菌手术刀在大鼠肝左叶切出1cm×1cm×0.5cm的十字型伤口，无菌棉花擦去渗血后迅速给予10mg微球止血，记录出血时间、术前纱布重量(W0)和术后纱布重量(W1)，结果如附图5所示。最后用缝合线缝合腹部伤口，所有大鼠在实验结束后注射过量麻醉剂处死。
结果：肝脏是人体的出血库，含有大量的血液，因此也被常用于凝血模型。在制造十字型伤口之后，立刻给予10mg止血材料，记录凝血时间和失血量，附图5显示，市售阳性对照CELOX组和基底材料SCs组与对照组(纱布)存在显著性差异(P<0.001)，而SCs-lip两组与空白对照组之间存在极显著的差异(P<0.0001)。SCs-lip-1和SCs-lip-2在凝血时间和失血量两个指标均表现出优异的凝血性能。SCs-lip系列止血微球，不仅可快速吸水溶胀、富集血细胞形成物理栓塞，还可通过释放Ca2+进入体液，随之渗透进细小的伤口缝隙中加速血液凝固。
6、抗肿瘤性能分析
目的：评估实施例1-2抗肿瘤止血微球产品在肿瘤切除手术中的抗肿瘤性能
方法：按30％接种量将人胰腺癌细胞PANC-1-luc接种在含10％FBS和1％双抗(青霉素和链霉素)的1640培养基中，在5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养90％密度时继续传代扩大培养。待细胞数量长至所需数量时，用胰酶消化、离心收集所有细胞至50mL无菌离心管中，并用无菌生理盐水洗涤细胞3次，去除剩余血清等残留，最后用生理盐水重悬细胞。将上述细胞按1×107cell/200μL/只皮下注射至裸鼠腋窝。待肿瘤体积长至约200mm3时，注射舒泰50(50mg/kg)麻醉裸鼠，模拟肿瘤切除手术，保留约100mm3肿瘤。给予5mg止血微球(阳性对照组按SCs-lip-2中多柔比星等效剂量予以尾静脉注射治疗，同等手术操作不予以任何治疗的裸鼠作为空白对照(Blank control，简称BK))治疗后，缝合伤口并给予氨苄青霉素治疗，防止伤口感染。在指定间隔时间点对裸鼠腹腔注射发光底物(luciferin)后，利用活体成像仪检测肿瘤细胞的荧光强度评估瘤体大小和密度，结果如附图6所示。
结果：在模拟实体瘤切除手术实验中，将5mg抗肿瘤止血微球加入到肿瘤切除部位，以等效剂量的尾静脉注射进裸鼠中作为阳性对照，同等手术操作不予以任何治疗的裸鼠作为空白对照，用于评估SCs-lip止血微球的抗肿瘤性能，附图6显示，在为期21天实验周期结束后，SCs-lip-1和SCs-lip-2处理组肿瘤显著小于空白对照组和阳性对照组，其中有SCs-lip-1和SCs-lip-2各有一只裸鼠无肉眼可见的剩余肿瘤组织，并且平均的肿瘤质量也显著少于对照组。
利用活体成像对组织内肿瘤细胞活力进行定量分析，结果表明，在施以手术1天后，SCs-lip止血微球负载着多柔比星脂质体，在局部高浓度脂质体作用下，产生的细胞毒性使得剩余肿瘤组织细胞活力迅速大幅下降，仅表达出少量的活细胞荧光。随着时间的推移两个实验组的活肿瘤细胞呈现缓慢增长，该结果表明SCs-lip负载的脂质体在长时间内被缓慢释放，表现出长效抑制肿瘤作用。而空白对照组由于接受手术刺激后，肿瘤细胞在术后快速增殖。在为期21天的实验周期内SCs-lip抗肿瘤止血微球的肿瘤相对抑制率与空白对照组相比达95％以上，结果表明SCs-lip可增强多柔比星药物在肿瘤组织的滞留时间，并表现出长效、强效的抗肿瘤作用。
7、扫描电镜分析
目的：观测实施例6-8产品的微观形貌
方法：为了观察止血微球的表面形貌，将微球样品表面镀金后使用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800,Japan)进行扫描，结果如附图7所示。
结果:附图7显示，所有样品呈现完整的椭球型，并且表面粗糙褶皱，有利于粘附血细胞，促进凝血。然而，海藻酸钠/丝素蛋白复合微球机械性能弱，冻干后球形塌陷、破裂。
8、体外凝血分析
目的：体外研究实施例5-8产品全血凝血性能评估
方法：全血倒置实验：称取5mg止血材料(各3份)于1.5mL Ep管中(以不做任何处理作为空白对照(Blank control，简称BK))，加入500μL兔抗凝血，涡旋振荡器振荡5s。每隔100s将试管倒置，观察试管中血液流动性，若血液可流动，则重置管路，直至血液完全凝固或时间超过600s，记录完全凝固所需时间。
结果：附图8显示，所测样品SCs-lip-3、SH-lip-2表现出优秀的凝血能力，在100s内形成稳定的血栓凝块。而SCol-lip-2、SSF-lip-2表现良好的凝血能力，在300s内形成稳定的血栓凝块。因此，SCs-lip-3和SH-lip-2相较于SCol-lip-2和SSF-lip-2，凝血能力更为突出。
综上所述，如附图3显示，两个SCs-lip组微球均可在100s内形成稳定的血栓凝块。海藻酸盐/壳聚糖-游离DOX组和基底材料组(SCs)同样在200s内形成稳定的血栓凝块。一方面得益于载DOX脂质体微球在Ca2+交联体系中形成更稳定的体系，其微球内含有更高浓度使得微球在接触血液后，迅速释放大量Ca2+加速凝血，另一方面的得益于冷冻干燥工艺和高比表面积带来的高溶胀高吸水倍率。进一步对血栓凝块进行扫描电子显微镜微观成像，止血材料表面吸附大量的血细胞，可清晰看见红细胞(圆盘型)和活化血小板(星状)。血小板聚集实验显示SCs系列微球在血小板富集上无显著差异，但均与阳性对照CELOX组存在极显著差异(P<0.0001)。综上结果表明，SCs系列止血微球通过高吸水溶胀倍率富集血细胞和凝血因子并释放Ca2+加速血液固化。而SCs-lip系列微球由于具有更完整的形貌和更高浓度的Ca2+，表现出优秀的止血速度。
本发明采用海藻酸钠、羧甲基壳聚糖和多柔比星脂质体为原料，氯化钙作为绿色交联剂制备的可降解复合抗肿瘤止血微球，旨在肿瘤切除手术中起快速止血，术后作为抗肿瘤药物的“仓库”起长效、缓释抗肿瘤药物的作用。本发明利用海藻酸钠和羧甲基壳聚糖的高吸水溶胀倍率、强细胞粘附性和Ca2+的凝血级联反应，在肿瘤切除手术中起快速止血作用，并且术后利用溶胀后的凝胶-脂质体体系起精准原位给药、缓释抗肿瘤药物的作用，从而在肿瘤切除手术中起快速止血、术后局部缓释抗肿瘤药物抑制肿瘤复发和转移。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (10)

1.一种载多柔比星的抗肿瘤止血微球，其特征在于，包含海藻酸盐、止血组分A、多柔比星或多柔比星脂质体、交联剂，所述止血组分A选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球，其特征在于，所述海藻酸盐与止血组分A与多柔比星或多柔比星脂质体的质量比为0.1-5:1000-10:1000-10，优选为0.5-5:100-10:100-10，进一步优选为1-5:50-25:50-25。
3.根据权利要求1或2所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球，其特征在于，所述微球的平均粒径为200-2000μm，优选为200-800μm。
4.根据权利要求1或2所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球，其特征在于，所述海藻酸盐选自海藻酸钠；
优选地，所述交联剂选自含Ca2+交联剂、含Ba2+交联剂、含Cu2+交联剂或戊二醛中的一种或多种。
5.一种如权利要求1至4中任一项所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基质溶液制备：分别用纯净水配制海藻酸盐溶液和止血组分A溶液，将两种溶液混合均匀，得到基质溶液；
(2)药物与基质溶液混合：将步骤(1)中得到的基质溶液与多柔比星药液混合均匀，将混合溶液转移至无菌注射器内，静置，除去气泡；
(3)交联制微球：将注射器装在微量注射泵中，将混合溶液缓慢注入交联剂溶液中，持续磁力搅拌使微球充分交联，将获得的微球悬浮液静置，弃上清，无菌纯水洗涤，收集获得微球。
6.根据权利要求5所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中海藻酸盐的质量百分比浓度为0.1-15％，所述止血组分A的质量百分比浓度为0.1-15％；
优选地，所述步骤(1)中海藻酸盐溶液与止血组分A溶液以体积比1-10：0.1-10混合，更优选地以1：1混合。
7.根据权利要求5所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中基质溶液与多柔比星药液的体积比为50-1:1；
优选地，所述多柔比星药液选自多柔比星脂质体或多柔比星水溶液；
优选地，多柔比星水溶液中多柔比星的浓度为2mg/mL；
优选地，多柔比星脂质体的浓度为2mg/mL。
8.根据权利要求5所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中注射器的针头口径为0.001-0.16mm，针头距离交联剂液面为3-8cm，注射速度为2-7mL/min；
优选地，所述交联剂溶液为CaCl2溶液，CaCl2的重量百分数为0.5-15％。
9.根据权利要求5所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球的制备方法，其特征在于，还包括步骤(4)冷冻干燥：加入足量液氮对微球充分冷冻，并通过冷冻干燥机对样品进行完全干燥，即得。
10.如权利要求1至4中任一项所述的载多柔比星的抗肿瘤止血微球在制备抗肿瘤药物和/或止血药物上的应用。
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