CN117899007A

CN117899007A - 一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶及其制备方法和应用

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Publication number: CN117899007A
Application number: CN202410088081.9A
Authority: CN
Inventors: 车鹏程; 王伟潼; 孙红
Original assignee: North China University of Science and Technology
Current assignee: North China University of Science and Technology
Priority date: 2024-01-22
Filing date: 2024-01-22
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明公开了一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。该制备方法包括以下步骤：将ADSCs来源外泌体与羧甲基壳聚糖溶液混合均匀，再加入氧化右旋糖酐溶液，反应得到所述负载ADSCs来源外泌体的水凝胶。该水凝胶可注射、可降解并且生物相容性良好。该水凝胶具有良好的注射性和原位凝胶形成能力，可完全覆盖受损表面；该水凝胶作为Exo的载体，提高了外泌体在腹腔的滞留率，使其更好地发挥治疗作用；该水凝胶可以通过外泌体的抗氧化、抗炎和减少胶原沉积等功能促进腹膜修复和再生。总之，该水凝胶可以有效预防腹膜粘连，这为预防术后腹膜粘连提供了一种很有前景的方法。

Description

一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

腹膜粘连(PA)通常是腹部手术后一种严重而常见的并发症，它是由肠道袢、腹膜和腹壁随机形成的有血管和神经支配的纤维性粘连带。严重的粘连可导致腹痛、肠梗阻和女性不孕，严重影响患者术后生活质量，并增加心理压力和经济负担。据报道，79％的腹部或盆腔手术患者术后会出现不同程度的粘连。腹膜粘连的形成与多种病理因素有关，如组织缺血缺氧、氧化应激、炎症和胶原过度沉积等。PA一直是困扰医生和影响患者预后的关键问题。

腹腔镜是临床上使用的一种微创手术技术，但仍不足以避免腹腔粘连的发生。手术技术的改进以及药物干预和物理分离是预防术后腹腔粘连的主要策略。然而，由于药物治疗存在循环代谢快、药物副作用大等缺点，物理隔离逐渐成为预防腹腔粘连的研究热点。物理屏障可直接隔离损伤表面，是目前临床上预防术后粘连最常用的方法(如薄膜、水凝胶和溶液)。水凝胶因其优异的生物降解性和工程灵活性等特性，成为了一种有应用前景的防粘连材料。一些水凝胶(如透明质酸钠)已获得用于PA治疗的临床批准。尽管水凝胶对预防PA的形成有一定的积极作用，但这些材料只能对受伤部位进行物理隔离，对PA形成的关键过程(如炎症和纤维化过程)的预防能力较差。因此，有必要开发将物理屏障与生物活性因子相结合的产品，以提高对伤口愈合的修复效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该负载ADSCs来源外泌体的水凝胶可注射，可降解，生物相容性良好，并且可以有效预防腹膜粘连。

干细胞有抑制炎症和过度胶原沉积的功能，在组织修复和减少瘢痕形成中扮演着重要角色，然而，干细胞疗法在临床应用中存在一定局限性，如存活率低、免疫排斥、治疗过程中的致瘤性等，限制了其应用和发展。脂肪间充质干细胞(ADSCs)主要是通过其旁分泌的外泌体发挥作用。与ADSCs相比，从ADSCs提取的外泌体具有相同的生物效应，但免疫原性更低，稳定性更高。此外，外泌体还可以通过自身所包含的生物活性物质调节免疫细胞表型、功能和归巢，从而抑制炎症组织中的不良免疫应答，促进受损实质细胞的存活和再生。因此，外泌体可能是治疗腹膜粘连的一种新型、可行的无细胞治疗策略。但遗憾的是，在PA的情况下，体内微环境的高度动态性会导致游离Exo被附近组织快速吸收。因此，本发明采用可注射的水凝胶局部递送外泌体，从而有效解决这一问题。本发明通过氧化右旋糖酐与羧甲基壳聚糖发生席夫碱反应，制备得到了一种可注射的两性离子多糖水凝胶，应用该水凝胶作为物理屏障和外泌体载体，可以有效预防临床术后腹膜粘连。

基于此，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将ADSCs来源外泌体与羧甲基壳聚糖溶液混合均匀，再加入氧化右旋糖酐溶液，反应得到所述负载ADSCs来源外泌体的水凝胶。

进一步地，所述氧化右旋糖酐溶液中的氧化右旋糖酐是将右旋糖酐利用氧化剂氧化制备得到。

进一步地，所述氧化剂为高碘酸钠。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液和所述氧化右旋糖酐溶液的浓度均为5wt％。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液和所述氧化右旋糖酐溶液的体积比为1:1。

进一步地，所述ADSCs来源外泌体与所述羧甲基壳聚糖溶液的质量体积比为30μg：50μL。

本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的负载ADSCs来源外泌体的水凝胶。

本发明还提供上述的水凝胶在制备预防腹膜粘连的药物中的应用。

本发明还提供一种预防腹膜粘连的药物，包括上述的水凝胶。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶，该水凝胶可注射、可降解并且生物相容性良好，可作为一种安全的粘附屏障。该水凝胶具有以下优势：

(1)该水凝胶具有良好的注射性和原位凝胶形成能力，可完全覆盖受损表面；

(2)该水凝胶作为Exo的载体，提高了外泌体在腹腔的滞留率，使其更好地发挥治疗作用；

(3)该水凝胶可以通过外泌体的抗氧化、抗炎和减少胶原沉积等功能促进腹膜修复和再生。

总之，该水凝胶可以有效预防腹膜粘连，这为预防术后腹膜粘连提供了一种很有前景的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为DCC水凝胶的制备示意图和表征结果；其中，A为制备示意图；B为DCC水凝胶在流变振荡时间扫描中的凝胶化动力学检测结果；C为凝胶时间；D为DCC水凝胶在粘度-剪切速率表征中的剪切性能检测结果；为E以1mL/min的速度通过1mL注射器和18G针头挤出水凝胶所需的注射力的检测结果，注射力是指力-位移曲线上平坦阶段的平均力(n＝3)；F为皮下植入水凝胶的活体成像以及1、3、5、7和9天时的荧光强度与0天时的荧光强度之比(n＝3)；G为DCC水凝胶皮下植入5天和14天后的大体照片、H&E和Ly-6G免疫组化染色图像；

图2为外泌体的表征结果；其中，A为外泌体的TEM图像；B为外泌体的粒径分析结果；C为外泌体的Western Blot鉴定结果；D为经LPS和外泌体处理的RAW264.7细胞中CD86和CD206的流式细胞术检测结果；E和F分别为M1巨噬细胞标记物CD86阳性细胞和M2巨噬细胞标记物CD206阳性细胞的定量分析结果；G为8天内DCC水凝胶中外泌体的累积释放量；H为通过荧光染色追踪体内植入的DCC/Dil-Exo的图像；

图3为DCC/Exo抑制氧化应激和线粒体损伤实验的结果；其中，A为腹膜损伤后第1天粘连组织中DHE的积累(红色荧光)图像；B为腹膜损伤后第1天粘连组织中线粒体(红色荧光)的图像；C为第1天粘连组织中凋亡细胞的TUNEL染色图像；D为粘连组织中DHE(红色荧光)的统计结果；E为线粒体(红色荧光)的统计结果；F为粘连组织中凋亡细胞的统计结果(n＝3，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)；

图4为DCC/Exo调节炎症微环境的实验结果；其中，A为第5天H&E、Ly6G、CD3和CD68的染色结果；B-D分别为Ly-6G、CD3和CD68的定量分析结果(n＝3，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)；E-G分别为IL-1β、TNF-α和IL-10细胞因子水平检测结果(n＝3，DCC/Exo vsControl，^***P<0.001)；

图5为DCC/Exo调节巨噬细胞极化实验的结果；其中，A为INOS(红色)和CD206(绿色)染色结果(n＝4)；B为INOS面积分数；C为CD206面积分数；D为NOS和CD206的平均面积分数；E为各组中IL-1β、IL-6和Arg-1的Western-blot分析结果；F-H分别为IL-1β、IL-6和Arg-1蛋白水平的定量分析结果(n＝3，^*P＜0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)；

图6为DCC/Exo减少胶原沉积实验的结果；其中，A为腹膜粘连的大体图像；B为粘连评分(n＝5)；C为H&E染色图像；D为术后第7天和第14天的Masson三色染色和天狼星红染色结果(^*P＜0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)；

图7为差异基因火山图谱；

图8为下调差异表达基因(DEG)的GO功能富集散点图；

图9为下调差异表达基因的KEGG通路富集散点图；

图10为Reactome下调差异表达基因富集散点图；

图11为不同比例DCC水凝胶的储存模量(G′)；

图12为不同比例DCC水凝胶的注射力曲线；

图13为用DCC水凝胶浸提液培养HPMC 24小时和48小时的CCK-8检测结果(n＝3，ns：无统计学意义)；

图14为使用DCC水凝胶浸提液培养的HPMC在培养24小时和48小时后的AO/PI染色荧光图像；

图15为分别在注射HA水凝胶后0d、1d、3d和5d拍摄的荧光图像；

图16为DCC/Exo组与DCC组相比，明显下调的差异表达基因的定量GO功能富集分析结果(BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

干细胞有抑制炎症和过度胶原沉积的功能，在组织修复和减少瘢痕形成中扮演着重要角色，然而，干细胞疗法在临床应用中存在一定局限性，如存活率低、免疫排斥、治疗过程中的致瘤性等，限制了其应用和发展。脂肪间充质干细胞(ADSCs)主要是通过其旁分泌的外泌体发挥作用。与ADSCs相比，从ADSCs提取的外泌体具有相同的生物效应，但免疫原性更低，稳定性更高。此外，外泌体还可以通过自身所包含的生物活性物质调节免疫细胞表型、功能和归巢，从而抑制炎症组织中的不良免疫应答，促进受损实质细胞的存活和再生。因此，外泌体可能是治疗腹膜粘连的一种新型、可行的无细胞治疗策略。但遗憾的是，在PA的情况下，体内微环境的高度动态性会导致游离Exo被附近组织快速吸收。因此，本发明采用可注射的水凝胶局部递送外泌体，从而有效解决这一问题。本发明通过氧化右旋糖酐与羧甲基壳聚糖发生席夫碱反应，制备得到了一种可注射的两性离子多糖水凝胶，应用该水凝胶作为物理屏障和外泌体载体，可以有效预防临床术后腹膜粘连，具体详述如下：

实施例1

1.实验方法

1.1实验动物、细胞系和试剂

所有动物(华北理工大学实验动物中心)均在无病原体的环境中饲养，笼子配有灭菌过的饲料和饮用水。所有实验过程均遵循美国国立卫生研究院(NIH)的《实验室动物饲养和使用指南》，并符合动物伦理道德。所有实验均在华北理工大学的指导和批准下进行(批准号：SCXK(京)2019-0008)。人腹膜间皮细胞(Human peritoneal mesothelial cells,HPMC)和RAW264.7购自BeNa Culture Collection Co.,Ltd.(Beijing,China)。医用透明质酸钠凝胶(sodium hyaluronate gel,HA)购自杭州协和医疗用品有限公司。

1.2DCC水凝胶的制备

将3.96g右旋糖酐(Dextran)溶解于50mL去离子水，加入0.54g高碘酸钠进行氧化，避光反应3小时。向反应体系中加入3毫升乙二醇终止反应。将氧化后的右旋糖酐使用去离子水进行透析7天，每12小时换一次水。最终将产物进行冷冻干燥得到氧化的右旋糖酐聚合物。将氧化的右旋糖酐溶解于PBS缓冲液，制备成浓度为5wt％的氧化Dex溶液。将透析纯化后的羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan)溶解于PBS缓冲液制备成浓度为5wt％的CMCS溶液。取5wt％氧化Dex溶液和5wt％CMCS溶液，以不同体积比进行混合(2:1，1:1，1:2)，最终制备成不同比例的右旋糖酐/羧甲基壳聚糖(DCC)水凝胶。

1.3DCC水凝胶的表征

1.3.1流变学测试

使用流变测量仪测定DCC水凝胶的流变特性。将500μL不同比例的DCC水凝胶涂抹在平板上(37℃)，记录其动态储能模量(G′)和损耗模量(G″)(1Hz，1％恒定应变)。在37℃、1Hz条件下测量水凝胶的交替阶跃应变扫描，振幅振荡应变(γ)从1％到500％，每个应变间隔100秒。

1.3.2注射力测量

使用带有50N负荷传感器的普通机电测试仪评估注射性能。注射测试时，将注射器安装在一个拉伸夹具上，然后用上压板压下注射器柱塞。通过带有18G针头的1mL注射器以1mL/min的流速注射水凝胶，以测试注射力。注入力为力-位移曲线上平坦阶段的平均力。

1.4DCC水凝胶的体内相容性

使用3只小鼠追踪植入的DCC水凝胶(25-30g，6周龄)。每只小鼠皮下注射100μLCy5-葡聚糖标记的DCC水凝胶，然后使用Lumina成像系统连续采集第1、3、5、7和9天的荧光图像。同时，使用6只小鼠研究DCC水凝胶的生物降解和组织相容性(25-30g，6周龄)。向小鼠背部注射100μL DCC水凝胶，并在第5天和第14天分别处死3只小鼠，收集植入区域的组织，并通过免疫组化染色观察中性粒细胞标记物Ly6G。

1.5细胞活力测定

用CCK-8法对HPMC进行体外细胞毒性检测。首先，将DCC水凝胶(1g)置于10mL含10％FBS的RPMI-1640培养基中，37℃培养48小时，获得水凝胶浸提液。用浸提液培养HPMC24小时和48小时，用RPMI-1640完全培养基培养HPMC作为对照组。按照标准方案进行CCK-8检测并计算细胞存活率。细胞活力的计算公式为

细胞活力＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％；

其中，A_sample和A_control分别代表水凝胶浸提液和对照组细胞培养后的吸光度。A_blank代表未进行细胞培养的CCK-8溶液的吸光度。

1.6AO/PI染色

按上述方法培养HPMC24小时和48小时，然后用AO/PI染色法观察细胞状态。荧光倒置显微镜拍摄图像。正常细胞被染成黄绿色，形态和结构正常；坏死细胞发出红色荧光。

1.7外泌体的表征

从SD(雄性，年龄3-4周，体重80±10g)大鼠腹股沟获得原代脂肪间充质干细胞。将取下的脂肪组织用无菌磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)洗涤至少三次后，再将脂肪组织剪碎，用0.75mg/mL消化液(含IV型胶原酶)消化1小时。消化结束后，1000rpm离心5min，弃上清液，收集分离细胞。得到的ADSCs用完全培养基重悬，随后铺瓶。细胞在37℃下培养，培养基每两天更换一次。

通过差速离心法(OPTIMAXPN-100，BECKMAN)从ADSCs上清液中获得外泌体。使用透射电子显微镜(TEM，H-765003040701，Hitachi，Japan)观察分离出的外泌体的形态。采用纳米颗粒跟踪分析技术(NTA，Malvern Zetasizer Mano zs90，Britain)检测外泌体的粒径分布，Western Blot检测蛋白质标志物Alix、TSG101、CD63和Calnexin的表达。

1.7.1DCC/Exo的制备及外泌体释放动力学

DCC/Exo的制备方法：将30μg外泌体与50μL 5wt％CMCS溶液混合均匀，然后与50μL5wt％Dex溶液进一步混合均匀，得到DCC/Exo。

为了追踪外泌体从DCC水凝胶中的释放情况，将DCC/Exo浸入200μLPBS中，37℃孵育。每天收集100μLPBS，并用等量的新鲜PBS补充。用BCA蛋白检测试剂盒(PC0020，Solarbio)计算外泌体的释放量，持续8天。

1.7.2外泌体的标记和摄取

在含有外泌体的PBS中加入10μM细胞膜染色试剂Dil溶液，室温下孵育30分钟。在4℃下以100,00×g超速离心30分钟，去除标记外泌体中多余的染料。然后，在130,000×g下超速离心2小时，分离出Dil标记的外泌体(Dil-Exo)，然后将30μg Dil标记的外泌体混入100μLDCC水凝胶中(制备方法同1.7.1)，制备得到DCC/Dil-Exo。将DCC/Dil-Exo注入皮下组织，并在不同时间点进行冰冻切片y)。随后使用激光扫描共聚焦显微镜观察所有冰冻切片。

1.8流式细胞术

在体外，用1μg/mL浓度的脂多糖作用于RAW264.7细胞，以诱导巨噬细胞极化。为了确定Exo对LPS诱导的巨噬细胞的影响，在LPS刺激前1小时用20μg/mL Exo处理RAW264.7细胞，共培养12小时后，使用Zombie NIR^TM固定活力试剂盒对RAW264.7细胞进行染色，以排除所有实验中的死细胞。为了阻断Fc受体，在免疫染色前，每10个细胞用100μL体积中含1.0μg的TruStain FcX^TM抗体在冰上预孵育10分钟。为了进行表面染色，细胞在染色缓冲液(PBS，2％FBS)中与下列直接结合的鼠蛋白抗体于4℃共孵育30分钟：FITC抗小鼠CD11b；BV421抗小鼠F4/80；AF700抗小鼠CD86。细胞内染色用固定缓冲液和细胞内染色渗透洗涤缓冲液10×固定，然后用APC抗小鼠CD206染色。使用21色CytoFLEX仪器采集数据进行流式细胞分析。数据分析使用Cyto Expert和FlowJo。

1.9小鼠PA模型的制备及粘连评分的评估

用2.5％阿佛丁(0.095mL/10g)对KM小鼠进行腹腔麻醉，然后对腹部皮肤进行预处理和消毒。干纱布擦拭盲肠浆膜至点状出血，用手术刀在腹壁造成1×1cm²的伤口，建立以腹壁缺损和盲肠损伤为特征的小鼠肠粘连模型。

为了评估模型动物的粘连情况，采用双盲法对模型动物进行评分：0，无粘连；1，一处薄粘连，松散易分离；2，一个以上薄粘连；3，较为紧密的粘连；4，一个以上紧密粘连；5，大面积的血管化粘连。

1.10DCC/Exo的抗粘连效果评估

将PA小鼠随机分为4组(n＝5)，即对照组、HA组、DCC组和DCC/Exo组。对照组用100μLPBS冲洗受损盲肠和腹壁；HA组使用100μL医用透明质酸钠水凝胶作为商业对照处理小鼠；DCC组使用100μL 2.5wt％DCC水凝胶(1.2制备得到)处理小鼠；DCC/Exo组使用100μL2.5wt％DCC/Exo(1.7.1制备得到)处理小鼠。HA组、DCC组和DCC/Exo组的处理小鼠是指将透明质酸钠水凝胶、DCC水凝胶或DCC/Exo注射到小鼠损伤部位。

1.11染色方法和图像分析

获得的组织经固定、石蜡包埋和切片后进行进一步分析。使用Image J软件对所有图像进行定量分析。

1.12活性氧(Reactive oxygen species，ROS)检测

腹膜损伤后1d的OCT切片用于检测ROS水平。用Mitotracker-Red标记线粒体以观察线粒体损伤。DAPI用于细胞核的标记。高速共聚焦显微镜拍摄荧光图像。

1.13TUNEL染色

采用TUNEL染色法检测PA的细胞凋亡。样本经DAPI染色封片后，用高速共聚焦显微镜进行检测。

1.14免疫组织化学

抗Ly6G、抗CD3和抗CD68评估炎症反应程度的标记物。光学显微镜拍摄图像。

1.15免疫荧光染色

选择INOS和D206抗体作为观察巨噬细胞极化的标记物。荧光二抗为AF568抗小鼠抗体和AF488抗兔抗体。所有免疫荧光染色的细胞核均用DAPI染色。

1.16马松和天狼星红染色

马松和天狼星红染色，用来评价组织纤维化程度。

1.17Western Blot

采用含1mM苯甲磺酰氟的RIPA裂解液提取总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。总蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到PVDF膜上。用5％脱脂乳封闭2h后，将膜与指定的一抗IL-6、Arg-1和GAPDH抗体4℃孵育过夜。然后，与二抗室温孵育2h，通过ECL化学发光试剂(SQ202L，Epizyme Biomedical Technology)进行显影。

1.18ELISA

PA模型建立后，分别在0、1、5d采集小鼠血清样本。通过ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-10，评价全身炎症因子水平。

1.19RNA测序和数据分析

为了比较DCC水凝胶组和DCC/Exo组的基因表达富集差异，Novogene生物信息科技有限公司(中国北京)进行了高通量转录组测序分析。利用ClusterProfiler软件对差异表达基因进行了基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集、京都基因组百科全书(KyotoEncyclopedia ofGenes and Genomes，KEGG)通路和Reactome富集分析。

1.20数据分析

所有数据均用均值±标准差表示。计量资料组间采用单因素方差分析，两两比较则采用LSD分析。所有分析均使用Graphpad Prism 9和Image J。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1DCC的表征

本发明通过Dex的醛基和CMCS的氨基之间的希夫碱反应制备得到了DCC水凝胶(图1中A)。最初，当Dex与CMCS溶液结合时，储存模量(G′)低于损耗模量(G″)，表明水凝胶处于溶胶状态。随着时间的推移，G′和G″都在增加，它们的交点决定了DCC水凝胶的凝胶化时间。最终，G′超过G″并趋于稳定，表明水凝胶已经形成(图1中B)。对不同质量比的DCC水凝胶的凝胶化动态进行了深入研究。图1中C和图11显示，当质量比(Dex/CMCS)从1:2变为2:1时，凝胶时间从178秒降至121秒。与此同时，G′从76Pa逐渐升高到112Pa，这一变化归因于DCC水凝胶(2:1)中醛基浓度较高导致交联密度增加。DCC水凝胶通过亚胺键进行可逆的动态化学交联，从而提高了注射性。经过测试可知，所有的水凝胶都具有适宜的力学强度，较小的注射力，尤其是1:1的水凝胶具有更适宜的凝胶化时间，时间太短不利于水凝胶注射到伤口表面，时间太长会导致水凝胶前驱液流动，无法保留在伤口部位，因此，在后续的研究中，本发明选择DCC/CMCS为1:1制备得到的DCC水凝胶进行外泌体包覆，以及细胞或动物实验。

氧化Dex溶液和CMCS溶液的混合物很容易用注射器注射，这表明DCC水凝胶具有良好的注射性(图1中D)。当DCC水凝胶通过注射器针头挤出时，粘度明显降低，这是交联结构在应力触发下分解的结果。此外，还记录了以1mL/min的流速通过18G针头注射DCC水凝胶时所施加的力(图1中E)，结果显示在稳定之前出现了最初的线性增加(图12)。在测试过程中，无论质量比如何，所有注射力都小于1N，这代表了操作者在启动和保持柱塞运动时施加的力。总之，这种方法大大简化了手术过程中的操作难度。

研究表明，间皮细胞在腹膜损伤中发挥着重要作用。为了评估DCC水凝胶的细胞相容性，使用CCK-8和AO/PI检测法检测了HPMC。培养24和48小时后，HPMC的存活率与正常组相当，大多在100％左右(图13)。在AO/PI染色中，大多数HPMC显示绿色荧光，表示活细胞，只有少数显示红色荧光，表示细胞死亡(图14)。这些发现证实了DCC水凝胶的细胞相容性，为体内实验奠定基础。

为了分析体内降解性，将标记有Cy5的DCC水凝胶植入皮下。利用IVIS活体成像系统进行的荧光成像显示，注射后(第0天)，背侧区域立即出现了清晰的信号，表明DCC水凝胶在原位迅速形成。随着时间的推移，荧光信号保持在局部，表明注射部位的水凝胶具有很强的完整性。此外，荧光强度在第7天下降，表明DCC水凝胶具有合适的体内降解性(图1中F)。相比之下，商用HA水凝胶在体内降解的速度比DCC水凝胶快，注射5天后就观察不到荧光信号了(图15)。这些结果表明，DCC水凝胶可以提供更好的治疗递送平台。

如图1中G所示，第5天在皮下组织中观察到少量水凝胶，第14天皮下水凝胶完全降解，这与小动物体内成像结果一致，表明DCC水凝胶具有良好的降解性。如第5天的不规则虚线所示，在剩余的DCC水凝胶周围仅观察到少量炎症反应Ly6G⁺中性粒细胞。随着水凝胶的降解，第14天基本未观察到Ly6G⁺中性粒细胞。

本发明制备得到的DCC/Exo有优越的细胞相容性和组织相容性，不会损害间皮细胞的活力和增殖，在动物体内异物反应小，并可在一定时间内降解。虽然商业化防粘连水凝胶在盲肠-腹壁损伤粘连模型中一定程度上能够减轻粘连的严重程度，但是并不能起到预防粘连的效果，这可能与它降解速率快和凝胶化缓慢有关。

2.2外泌体的表征

本发明通过差速离心法从ADSCs中纯化出ADSCs-Exo，随后通过TEM、NTA、Westernblot对提取出来的外泌体进行表征。透射电子显微镜图像显示，分离出的外泌体具有双膜、杯状的典型形状(图2中A)。NTA显示，外泌体的直径分布在30-200nm之间，平均直径为116nm(图2中B)。WesternBlot进一步证实，ADSCs-Exo高度富集了特征性的CD63、Alix和TSG101蛋白，而未检测到Calnexin(一种内质网蛋白)(图2中C)。综上所述，这些数据表明本发明成功获得了ADSCs-Exo。

体外共培养试验进一步研究了外泌体对巨噬细胞调节作用的影响(图2中D-F)。众所周知，巨噬细胞在损伤时具有在M1和M2之间切换的能力。因此，使用流式细胞仪分析测量了M1和M2表型的数量。数据显示，与LPS刺激组相比，外泌体处理组的M1(CD86⁺)巨噬细胞比例明显降低，但外泌体处理组的M2(CD206⁺)巨噬细胞比例明显升高，差异有统计学意义。这些结果表明，ADSCs-Exo能改善LPS诱导的炎症反应，并促进巨噬细胞极化为M2而非M1。

为了研究外泌体从DCC水凝胶中的体外释放行为，将30μg外泌体包裹在100μg DCC水凝胶中，记录外泌体从DCC水凝胶中的持续释放，并建立外泌体释放曲线(图2中G)。起初是爆发性释放，随后是持续性释放，大多数外泌体在8天内释放完毕，在此期间释放了95％以上的外泌体。外泌体在不同的病理阶段发挥着重要作用。因此，在一段时间内释放外泌体可确保其在PA的不同阶段长期发挥作用，从而实现有效地修复和愈合。

为了追踪DCC/Dil-Exo移植后在体内的结合和保留情况，将DCC/Dil-Exo皮下植入小鼠背部，并在不同的时间点进行了荧光观察(图2中H)。移植后1天，可观察到大量Dil标记的外泌体。在局部细胞的细胞质中检测到红色荧光，这表明外泌体能够被细胞成功摄取。移植后3天和5天，Dil标记的外泌体数量明显减少。移植后7天，观察到的红色颗粒数量极少。结果表明，DCC/Exo主要在组织损伤后的早期阶段发挥作用。

DCC水凝胶不仅作为递送载体和增加外泌体对靶向部位的保留，还作为损伤区域的隔离屏障以防止粘连。在本实验中，本发明发现了DCC水凝胶的防粘效果要优于商业HA水凝胶。ADSC-Exo已被证明在伤口愈合中有效，但注射到腹腔后，ADSC-Exo悬液容易流失，导致ADSC-Exo在所需位置的保留有限。本发明以水凝胶为载体制备了DCC/Exo，使外泌体尽可能在损伤原位发挥作用，证明了DCC/Exo能够促进小鼠腹膜损伤后的修复，这可能为探索治疗和预防术后腹腔粘连提供新的思路。

2.3DCC/Exo可减少氧化应激和线粒体损伤

组织缺氧是腹膜粘连的主要驱动因素之一，在引发炎症和进一步加速胶原沉积方面起着核心作用。研究表明，从ADSCs提取的Exo具有与其亲代细胞相同的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，从而改善组织修复效果。然而，人们对外泌体在腹膜氧化应激损伤和PA修复方面的具体功能仍知之甚少。为了评估DCC/Exo水凝胶的抗氧化作用，本发明对其自由基清除特性和细胞凋亡进行了研究。

第1天，对照组、HA组和DCC组的细胞核周围都出现了明显的DHE阳性荧光。特别是，对照组在盲肠和腹壁之间的粘连区域显示出明显的红色荧光(图3中A)。令人印象深刻的是，与DCC组相比，DCC/Exo组的平均红色区域比例减少了93.6％(图3中D)。

线粒体是生物能和活性氧的重要来源，在正常情况下，线粒体能将ROS维持在较低水平，但当机体受到损伤刺激时，ROS的升高会超出机体的清除能力，导致线粒体甚至细胞生理活性异常。如图3中B所示，线粒体在氧化应激作用下受损，而在DCC中加入Exo可以保护线粒体免受损伤，这对维持细胞平衡至关重要。而且，DCC/Exo组的平均红色荧光强度比DCC组高约2.5％(图3中E)。有趣的是，由于外泌体的治疗作用，DCC/Exo组的线粒体与正常组相似。上述结果表明，外泌体可以通过清除ROS减少线粒体损伤。

当盲肠和腹壁受损时，ROS作为细胞内氧化应激的效应分子可介导细胞凋亡。术后1d，与对照组相比，DCC/Exo组的凋亡细胞数量明显减少，绿色荧光的面积分数从1.81±0.07(％)减少到0.23±0.06(％)。与DCC组相比，外泌体的加入明显减少了TUNEL阳性细胞的表达，这表明了外泌体与DCC水凝胶协同治疗的有效性(图3中C和F)。

上述结果表明，DCC/Exo可通过降低氧化应激水平和改善线粒体功能来促进细胞存活。

2.4DCC/Exo调节免疫微环境

当腹膜受到刺激并构成损伤时，毛细血管通透性增加，血液中的炎性细胞和纤维蛋白大量渗出，引发炎症并形成粘连。如果减轻炎症反应和胶原纤维的沉积，就可以防止粘连的形成。外泌体参与了多种炎症性疾病和肿瘤相关炎症，其作为细胞间的重要通讯介质，不断地调节炎症微环境。

在此，本发明在术后第5天检测了早期粘连的形成和炎症反应。对照组腹膜粘连明显，而DCC/Exo组术后第5天未发现粘连(图4中A)。第5天，Ly6G、CD3和CD68被作为损伤部位的炎症细胞标记物。对照组观察到明显的Ly6G⁺细胞、CD3和CD68浸润(图4中B-D)。与对照组相比，DCC/Exo组的中性粒细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞浸润明显减少。相比于对照组，HA组和DCC组的粘连组织更松散，但在损伤区域仍能观察到炎症细胞的聚集。

通过ELISA测定血清中IL-1β、TNF-α和IL-10等炎症细胞因子的水平，进一步评估炎症反应程度。与对照组相比，DCC/Exo组的促炎因子IL-1β和TNF-α呈下降趋势(^***p<0.001)。相反，DCC/Exo组的抗炎因子IL-10水平有所提高(图4中E-G)。

结果表明，DCC/Exo可减轻PA后的炎症反应，这种治疗效果可能归因于所负载的外泌体。外泌体可能携带抗炎介质来调节炎症微环境。

2.5DCC/Exo调节巨噬细胞极化

DCC/Exo治疗后，局部浸润的炎症细胞减少，血清中的抗炎细胞因子增加，基于这些令人鼓舞的实验结果，本发明对其中的潜在机制进行了深入研究。

巨噬细胞极化对抗炎和组织修复非常重要。大量研究表明，间充质干细胞衍生的外泌体可促进M1向M2的极化，并增加抗炎细胞因子和趋化因子的表达，此过程可减轻炎症。

免疫荧光染色检测了第5天不同组体内巨噬细胞的浸润情况。对照组标记INOS的M1表型巨噬细胞数量明显高于DCC/Exo组(P＜0.001)(图5中A和B)。如图5中A所示，HA组、DCC组和DCC/Exo组中标记有CD206的M2巨噬细胞数量逐渐增加(图5中A和C)，且抗炎的M2巨噬细胞广泛存在于盲肠和腹壁。从各组M1和M2标记物的平均面积分数来看，M2巨噬细胞在DCC/Exo组中所占比例最大(图5中D)，而促炎性M1巨噬细胞则明显减少，这表明DCC水凝胶递送的外泌体可能有助于腹膜损伤后巨噬细胞的极化。

M1巨噬细胞释放促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等，而M2巨噬细胞则分泌抗炎介质，包括IL-10、TGF-β等。巨噬细胞表型相关蛋白进一步通过WesternBlot进行检测。与对照组相比，DCC/Exo组中M1相关蛋白IL-1β和IL-6的表达下调(图5中E、F和G)，而M2相关蛋白Arg-1的表达则显著上调(图5中E和H)。

这些结果进一步证明，DCC/Exo可以缓解免疫功能紊乱和减轻炎症反应。这种治疗效果得益于Exo促进抗炎M2样巨噬细胞的极化并表现出促进伤口愈合的免疫调节特性。

2.6DCC/Exo减少胶原沉积

持续的炎症反应会破坏损伤部位的纤溶系统和细胞外基质重塑，这种纤维化过程在PA的病理中起着至关重要的作用。纤维和胶原形成发生在术后PA发育的最后阶段，是腹膜损伤后修复的一种手段。为了评估DCC/Exo抗粘连的效果，收集了7天和14天受损部位的组织观察粘连情况并对粘连进行量化评分(图6中A和B)。在术后第7天，对照组小鼠的腹壁上皮与受损盲肠表面之间形成明显的粘连，并且随着病程的延长,对照组的粘连越来越严重，表现为牢固的粘连组织。相应地，对照组第7天和14天的粘连评分从3.6增长到了4.6分。比较乐观的是，与对照组相比，HA和DCC水凝胶的引入使粘连评分略有降低，但仍有一定程度的粘连。与此形成鲜明对比的是，DCC/Exo组在术后7天和14天均未观察到粘附的形成，并且盲肠与腹壁表面愈合光滑，粘连评分与Control组相比明显降低(第7天0分；第14天0.2分)。H&E染色观察到与大体图片类似的结果(图6中C)，对照组随着病程延长，粘连面积和粘连厚度逐渐增加，粘连涉及整个肠壁，有致密的结缔组织并伴有大量白细胞。商业HA水凝胶组和DCC水凝胶组也观察到盲肠和周围腹壁之间有轻微桥接的中度粘连。相比之下，DCC/Exo治疗后，腹壁与盲肠之间没有发生明显的粘连，炎细胞和成纤维细胞浸润不明显，并且可观察到在盲肠与腹壁的损伤面有一层新生的间皮层。

Masson三色染色和天狼星红染色更直观地评价纤维化程度(图6中D)。术后7天，对照组的胶原蛋白沉积丰富，尽管商用HA组和DCC水凝胶具有保护作用，但胶原沉积仍然明显，导致轻/中度粘连的形成。与H&E染色一致，DCC/Exo组未观察到纤维结缔组织。术后14天，对照组的盲肠与腹壁之间形成更加致密的纤维结缔组织，这可能与持续的炎症引发的纤维增生有关。与HA组相比，DCC水凝胶有较好的抗粘附效果，但不能起到治疗或促进愈合的作用。有趣的是，DCC/Exo组没有胶原沉积或胶原沉积非常有限。

综上所述，DCC/Exo在体内具有令人满意的抗粘附效果，能够较少胶原沉积，促进组织愈合。

2.7DCC/Exo相关差异表达基因的生物功能与信号通路

为了进一步探索DCC/Exo对腹膜粘连可能的作用机制，在治疗后的第5天，分别取DCC组和DCC/Exo组小鼠粘连或未粘连组织，对其进行转录组测序(RNA-seq)，分析各组基因表达谱差异和富集情况。差异基因表达分析如图7所示，DCC/Exo组与DCC组转录组相比，有6060个基因存在差异，其中，2543个基因显著上调(红点)，3517个基因显著下调(绿点)。GO分析结果显示(图8和图16)，下调的差异表达基因主要参与细胞外基质、蛋白细胞外基质和收缩纤维等的组成。分子功能主要包括整合素结合、生长因子结合、细胞因子结合等，参与了趋化作用、血管生成、白细胞迁移等生物学进程(P＜0.05)。KEGG通路富集分析结果如图9所示，下调基因涉及的通路共20条，提示DCC/Exo通过多通路而发挥腹膜粘连的预防作用。与DCC组相比，DCC/Exo组的PI3K-Akt信号通路、细胞因子受体相互作用、粘着斑、Rap1信号通路、ECM受体作用通路均显著下调(P＜0.05)，暗示Exo可能通过这些通路发挥生理活性。通过Reactome数据库比对分析结果显示(图10)，与DCC组相比，DCC/Exo组的胶原形成、细胞外基质结构、整合素相关通路、中性粒细胞脱颗粒相关通路显著下调。

综合以上结果，进一步证实了DCC/Exo可以调节腹膜粘连后的免疫微环境，下调炎症相关基因与通路的表达，达到防止腹膜粘连形成的目的。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种负载ADSCs来源外泌体的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化右旋糖酐溶液中的氧化右旋糖酐是将右旋糖酐利用氧化剂氧化制备得到。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸钠。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖溶液和所述氧化右旋糖酐溶液的浓度均为5wt％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖溶液和所述氧化右旋糖酐溶液的体积比为1:1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ADSCs来源外泌体与所述羧甲基壳聚糖溶液的质量体积比为30μg：50μL。

7.一种根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的负载ADSCs来源外泌体的水凝胶。

8.一种如权利要求7所述的水凝胶在制备预防腹膜粘连的药物中的应用。

9.一种预防腹膜粘连的药物，其特征在于，包括权利要求7所述的水凝胶。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。