CN116754690A - 一种peg化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，(1)配制标准溶液：取聚山梨酯20为对照品，用稀释剂溶解，得到对照品溶液；(2)取注射液为供试品，采用高效液相色谱仪‑电喷雾检测器进行检测。本方法通过更换检测器类型使方法灵敏度更高，响应值更稳定；通过筛选合适类型色谱柱解决了PEG与聚山梨酯20无法分离情况；采用柱后切换阀将高浓度无机盐及蛋白质切入废液，延长检测器使用寿命。
Description
技术领域
本发明属于生物蛋白类药物辅料检测领域，具体涉及一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法。
背景技术
聚山梨酯20，化学名称为山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯(20)醚，为药物制剂中常用的辅料之一，常见的作用为增溶剂、扩散剂、稳定剂、抗静电剂、润滑剂等。但是研究表明聚山梨酯20对人体或者环境可能会造成危害，诱导细胞产生脱颗粒作用，引起过敏活性物质释放。
现有技术中针对聚山梨酯20的检测通过采用显色反应、高效液相色谱法或者与其他检测器联用，在HPLC-ELSD在检测的过程中使用蒸发光检测器进行检测，该方法使用的色谱柱为Agilent Poroshell 120SB-C18(2.7um，4.6mm*150mm)，流动相为纯水(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱，但是在检测的过程中，响应值不稳定，影响实验的准确性，同时色谱柱在进行PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量时，注射液中残留PEG与聚山梨酯20无法分离。
发明内容
本发明的目的在于克服技术不足，公开了一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，优化了检测条件，同时可以将注射液中的PEG与聚山梨酯20完全分离。
本发明通过以下技术方案实现的：
一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，包括以下步骤：
(1)配制标准溶液：取聚山梨酯20为对照品，用稀释剂溶解，得到对照品溶液；
(2)取注射液为供试品，采用高效液相色谱仪-电喷雾检测器进行检测。
进一步地，高相液相色谱检测时采用的色谱柱为Jupiter300A，C4，尺寸为250mm×4.6mm，5μm。
进一步地，高相液相色谱检测时的流动相：流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸-乙腈溶液。
进一步地，高相液相色谱检测时色谱条件为：柱温：35℃，流速：1.0ml/min，梯度程序：
进一步地，电喷雾检测器参数：雾化器温度：50℃；采集频率：2HZ；过滤常数：3.6s，进样量：20μl。
本发明的有益效果为：
针对注射液中PEG与吐温20难以分离的情况，通过设计合适的色谱柱、洗脱条件以及检测器，达到了以下效果：(1)本方法通过更换检测器类型使方法灵敏度更高，响应值更稳定。(2)通过筛选合适类型色谱柱解决了PEG与聚山梨酯20无法分离情况。(3)采用柱后切换阀将高浓度无机盐及蛋白质切入废液，延长检测器使用寿命。
附图说明
图1为专属性典型图谱；
图2为聚山梨酯20的对照品线形图；
图3为采用对比例1的检测方法得到的图谱。
具体实施方式
为了使技术领域的人员更好地理解本发明方案，并使本发明的上述目的、特征和优点更加明显易懂，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
1材料与方法
(1)仪器：高效液相色谱仪、电喷雾检测器、电子天平、超声波清洗机、涡旋混合器等。
(2)器具：移液器、量筒、容量瓶、离心管、烧杯等。
(3)色谱柱：300A，C4 250mm×4.6mm，5μm。
(4)溶液配制：取聚山梨酯20为对照品，用稀释剂溶解，得到对照品溶液(线性系列溶液10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL)。
(5)流动相
流动相A(0.1％三氟乙酸-水溶液)：量取1ml三氟乙酸加入1000ml超纯水中混匀，超声15min，备用。
流动相B(0.1％三氟乙酸-乙腈溶液)：量取1ml三氟乙酸加入1000ml乙腈中混匀，超声15min，备用。
(6)色谱条件
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
梯度程序见表1：
表1梯度洗脱程序
(7)电喷雾检测器参数：
雾化器温度：50℃；采集频率：2HZ；过滤常数：3.6s。进样量：20μl。
利用上述条件及仪器对样品进行检测。
2结果与讨论
(1)线性范围、相关系数及检出限、定量限
以各待测物的色谱峰面积为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，分别以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)确定方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)，具体结果见表2，结果显示方法满足检测需求。
表2线性方程、线性范围、相关系数、方法检出限及方法定量限
表3-方法检出限及方法定量限
检测限(2.5μg/mL)
结论：检测限溶液2.5μg/mL信噪比S/N分别为7.54、6.06、6.75均大于3，重复进样三次峰面积RSD为5.0％小于20.0％，满足检测限的标准，即检测限为2.5μg/mL。
定量限(10μg/mL)
结论：定量限溶液10μg/mL信噪比分别为12.50、13.94、14.55、13.23、13.33、13.03均大于10，重复进样六次峰面积的RSD为6.4％小于10.0％，且回收率在88.5％～110.4％范围内，满足在75.0％～125.0％之间，满足定量限的标准，即定量限为10μg/mL。
(2)回收率和精密度
选取注射液进行加标回收和精密度实验，利用建立的方法测出样品的本底值，按本底值的50％、100％分别添加低、高2个不同水平浓度的标准溶液，每个添加水平测6次，结果见表4。结果显示，方法重复性良好。
表4方法的回收率和精密度(n＝12)
精密度
对比例1
采用HPLC-ELSD，使用蒸发光检测器进行检测，该方法使用的色谱柱为AgilentPoroshell120SB-C18(2.7um，4.6mm*150mm)，流动相为纯水(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱，洗脱条件同实施例1，最终检测时，空白有干扰且PEG与吐温20不能明显分开。
对比例2
采用HPLC-ELSD，使用蒸发光检测器进行检测，该方法使用的色谱柱为AgilentPoroshell120SB-C18(2.7um，3.0mm*150mm)，流动相为三氟乙酸(1％)的乙腈和水溶液为流动相，洗脱条件同实施例1，检测时，对聚山梨酯20(表面活性剂类)响应不稳定，且灵敏度较CAD低。
Claims (5)
1.一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制标准溶液：取聚山梨酯20为对照品，用稀释剂溶解，得到对照品溶液；
(2)取注射液为供试品，采用高效液相色谱仪-电喷雾检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，其特征在于，高相液相色谱检测时采用的色谱柱为Jupiter300A，C4，尺寸为250mm×4.6mm，5μm。
3.根据权利要求1所述的一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，其特征在于，高相液相色谱检测时的流动相：流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸-乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，其特征在于，高相液相色谱检测时色谱条件为：柱温：35℃，流速：1.0ml/min，梯度程序：
5.根据权利要求1所述的一种PEG化蛋白注射液中聚山梨酯20含量检测方法，其特征在于，电喷雾检测器参数：雾化器温度：50℃；采集频率：2HZ；过滤常数：3.6s，进样量：20μl。
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