CN116747250A - 控制生物功能的新成分 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是制备一种新的食品来源的外泌体组合物和提供含有新的有效成分的癌症抑制剂或组织弹性降低预防剂或弹性改善剂。对纯化工序深入研究的结果，本发明的发明人发现可以通过独特的制造方法从酒母和醪中提取外泌体。本发明人发现从酒母和醪中回收的外泌体具有抑制癌细胞增殖的能力、促进颗粒酶量增加的能力、促进胶原蛋白和弹力蛋白表达的能力。由此，本发明的发明人提供了一种含有来自日本酒的酒母和醪的外泌体的用于治疗或预防癌症的组合物、以及组织弹性降低预防剂或弹性改善剂。

Description

控制生物功能的新成分
本案是申请日为2020年1月31日，发明名称为控制生物功能的新成分，申请号为202080011901.4的案件的分案申请。
相关申请的相互参照
本国际申请主张基于2019年2月1日在日本专利局所申请的日本专利申请第2019-17296号的优先权，并且日本专利申请第2019-17296号的全部内容通过参照被引入本国际申请。
技术领域
本发明涉及利用来自酵母的外泌体(Exosome)的用于医疗和化妆的组合物等。
背景技术
据报道，益生菌(Probiotic)乳酸菌对代谢综合征具有预防效果，例如抑制脂肪积累的效果和改善胰岛素抵抗的效果。其机制被认为是来自口服摄入并从肠道所吸收的乳酸菌的外泌体作用于远离肠道的组织，如脂肪组织和骨骼肌，并有助于预防代谢综合征。这些效果极有可能是由广泛众多对人体有益的细菌和酵母、以及口服摄取的许多蔬菜和水果所释放的，对其有用性的期待在增长。
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的发明人认为日本酒生产之源的酒母是大量酵母的纯培养物，因此可能是外泌体的宝库，并且首次关注到来自作为日本酒制造过程之源的酒母的培养液中存在的外泌体。另外，本发明的发明人首次关注到与日本酒同样含有酵母的味噌、尤其是1年以上熟化的味噌所含有的外泌体。因此，本发明的一个目的是制备新型食品来源的外泌体组合物。另一方面，本发明的一个目的在于提供一种含有新型有效成分的癌症抑制剂或组织弹性降低预防剂或弹性改善剂。
用于解决技术问题的技术方案
本发明的发明人对其纯化工序深入研究的结果，发现可以通过独特的制造方法提取外泌体。本发明的发明人使用从酒母和醪(未过滤的酒，unrefined sake)中回收的外泌体研究了免疫细胞中细胞内颗粒酶(granzyme)量的变化，发现了增加的情况。关于细胞因子(cytokine)的分泌没有发现变化，另一方面，关于作为成纤维细胞(fibroblast)老化的指标的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色没有发现差异。作为另一个老化的指标，评价老化成纤维细胞中胶原酶(collagenase)的表达和弹力蛋白(Elastin)的表达，结果确认了胶原蛋白(collagen)和弹性蛋白的表达量增加。由此，本发明的发明人首次发现来自日本酒的酒母和醪的外泌体具有预防组织弹性降低和提高弹性的效果。
此外，本发明的发明人研究了添加有从味噌回收的外泌体的老化成纤维细胞中具有抗老化作用的I型胶原蛋白和弹性蛋白的基因量的变化，发现了增加的情况。另外，还发现通过添加从味噌回收的外泌体能提高NK细胞的免疫活性。
因此，本发明涉及以下发明：
(1)一种从酵母所提取的外泌体。
(2)根据(1)所述的外泌体，其中，酵母为日本酒的酒母或醪中所含的酵母。
(3)一种从日本酒的酒母或醪中所提取的外泌体。
(4)根据(2)或(3)所述的外泌体，其是通过将日本酒的酒母或醪以10,000～20,000×g离心而获得上清液，再以10,000～210,000×g超速离心上述上清液所得到的沉淀物。
(5)根据(1)所述的外泌体，其中，酵母为味噌中所含的酵母。
(6)一种从味噌所提取的外泌体。
(7)根据(5)或(6)所述的外泌体，其中，味噌是熟化1年以上的味噌。
(8)根据(7)所述的外泌体，其中，味噌是熟化3年以上的味噌。
(9)一种含有(1)～(8)中任一项所述的外泌体的组合物。
(10)根据(9)所述的组合物，其含有4×108个/ml以上或作为蛋白质的量为33ng/ml以上的(1)～(8)中任一项所述的外泌体。
(11)根据(9)所述的组合物，其含有4.7×1011个/ml以上的(1)～(8)中任一项所述的外泌体。
(12)根据(9)所述的组合物，其含有7.8×1012个/ml以上的(1)～(8)中任一项所述的外泌体。
(13)一种用于抑制癌细胞增殖的组合物，其为含有上述外泌体作为有效成分的(9)～(12)中任一项所述的组合物。
(14)根据(13)所述的组合物，其中，癌细胞是大肠癌、前列腺癌或乳腺癌。
(15)一种NK细胞的颗粒酶表达促进剂，其为含有上述外泌体作为有效成分的(9)～(12)中任一项所述的组合物。
(16)一种用于治疗或预防癌症的医药组合物，其为含有上述外泌体作为有效成分的(9)～(12)中任一项所述的组合物。
(17)一种胶原蛋白和/或弹力蛋白产生促进剂，其为含有上述外泌体作为有效成分的(9)～(12)中任一项所述的组合物。
(18)一种组织弹性丧失预防剂或组织弹性改善剂，其为含有上述外泌体作为有效成分的(9)～(12)中任一项所述的组合物。
(19)根据(18)所述的组织弹性丧失预防剂或组织弹性改善剂，其中，上述组织是皮肤。
(20)根据(19)所述的组织弹性丧失预防剂或组织弹性改善剂，其用于化妆。
(21)一种(1)～(4)所述的外泌体的制造方法，包括：
(a)将日本酒的酒母或醪以10,000～20,000×g离心的步骤；
(b)将通过上述(a)所得到的上清液以10,000～210,000×g超速离心的步骤；以及
(c)将沉淀物作为外泌体组分回收的步骤。
(23)一种(5)～(8)所述的外泌体的制造方法，包括：
(a)将味噌以10,000～20,000×g离心的步骤；
(b)将通过上述(a)所得到的上清液以10,000～210,000×g超速离心的步骤；以及
(c)将沉淀物作为外泌体组分回收的步骤。
发明效果
本发明成功地提取了激活免疫系统、抗衰老、维持身体健康的重要成分。通过这种独特的制造方法得到的含有外泌体的有效成分能够应用于日本酒、味噌以及其他饮料、食品、化妆品和医药品等所有形态的用于维持健康的产品。
附图说明：
图1是显示在4℃下将獭祭的酒母和醪以15,000×g离心15分钟的结果的照片。该上清液用于提取外泌体。
图2是显示使用纳米颗粒分析系统NanoSight(分析条件：Camera Level14，Detection Threshold 7)测量所得到的来自酒母(A)和醪(B)的外泌体组分的颗粒数的结果的曲线图。来自酒母的外泌体在95nm处观察到粒径的峰值，来自醪的外泌体在109nm处观察到粒径的峰值。
图3是显示以0.5、1以及2μg/mL的浓度向HCT116细胞添加各外泌体后评价细胞增殖抑制和细胞凋亡的结果的图表。细胞凋亡显示半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)活性的检测结果。
图4是表示大肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及前列腺癌细胞系PC-3M的增殖抑制试验结果的图表。纵轴表示将对照(未添加外泌体)值作为1时的相对值。
图5是表示大肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及前列腺癌细胞系PC-3M的细胞凋亡诱导能力试验结果的图表。纵轴表示将对照(未添加外泌体)值作为1时的相对值。
图6是表示迁移实验结果的照片。中心线状白色的部分是划痕部分。
图7是表示图6所示的迁移实验结果的图表。纵轴表示将对照(PBS)值作为1时的相对值。
图8显示添加外泌体时NK细胞中颗粒酶的表达量。上图是显示各蛋白质的表达量的蛋白质印迹法(Western Blotting,WB)的照片。下图显示通过蛋白质印迹法量化表达量的图。
图9是表示外泌体对NK细胞的干扰素γ、白细胞介素17、TNFα这3种细胞因子的分泌量的作用的评价结果的图表。
图10是显示为测量外泌体抗老化能力而进行β-半乳糖苷酶染色结果的照片。细胞被染成绿色则表明细胞正在老化。
图11是显示外泌体对作为重要皮下胶原蛋白的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白表达量的作用的评价结果的图表。各组(从左起依次为：对照(未添加)、EtOH、醪3μl、醪10μl、醪30μl、酒母3μl、酒母10μl、酒母30μl)中所显示的条形图为从左起依次表示I胶原蛋白α1链、I型胶原蛋白α2链、III型胶原蛋白和弹力蛋白的结果。纵轴表示将对照的值作为1时的相对值。
图12显示添加外泌体时NK细胞中颗粒酶的表达量(n＝3)。通过蛋白质印迹法定量表达量并以平均值表示。
图13是表示外泌体对I型胶原蛋白和弹力蛋白表达量的作用的评价结果的图表。各组(从左起依次为：未熟化，1年熟化，速酿，3年熟化)中所显示的条形图左侧表示I型胶原蛋白的结果，右侧表示弹力蛋白的结果。纵轴表示将对照值作为1时的相对值。
具体实施方式
1、制备来自酒母和醪或味噌的外泌体
酒母是为酿造日本酒而在蒸好的米、曲和水的混合物中加入了酵母的培养物。酒母的酵母进行发酵，将蒸好的米、曲和水分成几次加入，得到醪。酒母和醪均在日本酒制造业中常用，其制造方法也广泛知晓的。特别是在獭祭中所使用的酒母和醪能够从旭酒造株式会社(山口县岩国市周东町獭越2167-4)获得。从酒母和醪中提取外泌体例如能够通过如下方式进行：(a)离心日本酒的酒母或醪；(b)超速离心由上述(a)所得到的上清液；以及(c)将由上述(b)所得到的沉淀物作为外泌体组分进行回收。
味噌是向大豆内混入米曲和盐并进行发酵后的产物。“未熟化味噌”是指不进行熟化加工的味噌，“熟化味噌”是通过利用天然酵母或乳酸菌自然发酵的能力静置而熟化的天然酿造所制得的味噌。熟化味噌根据熟化时间的不同，被称为1年熟化味噌、3年熟化味噌等。“速熟味噌”是指通过人工地将其置于一定温度下加热处理，以激活曲的作用而强制发酵，在短时间内制成的味噌，例如有一个月熟化的速熟味噌等。本说明书中的味噌优选为熟化味噌，例如熟化1～3年的味噌，优选为熟化1年以上的味噌，更优选为熟化3年以上的味噌。从味噌中提取外泌体，例如，能够通过(a)离心味噌或味噌悬浮液(例如，溶解在水中的味噌)；(b)超速离心通过上述(a)所得到的上清液；以及(c)将由上述(b)所得到的沉淀物作为外泌体组分进行回收来进行。
步骤(a)中的离心可以在10,000～20,000×g、10,000～15,000×g、12,000～17,000×g或15,000×g下进行。另外，步骤(a)中的离心可以进行例如5分钟以上、10分钟以上、或15分钟以上。另外，步骤(a)中的离心可以在4℃～室温下进行。步骤(a)中所得到的上清液用于外泌体回收。该上清液可以根据需要通过过滤器过滤(例如，通过0.65μm过滤器过滤)，进一步去除上残渣。过滤器过滤可以根据需要分两步进行。
步骤(b)中的超速离心可以在70,000～100,000×g、10,000～210,000×g、50,000～200,000×g、100,000～210,000×g下进行。步骤(b)的超速离心可以进行例如50分钟以上、60分钟以上、或70分钟以上，例如60分钟～4小时。另外，步骤(b)中的超速离心可以在4℃～室温下进行。通过将步骤(b)所得到的沉淀物作为外泌体回收，可以得到来自酒母或醪的外泌体(步骤C)。根据需要，可以用PBS等清洗回收的外泌体。可以通过将沉淀物悬浮在PBS中，然后以100,000～210,000×g离心并去除上清液来进行清洗。离心条件可按照步骤(b)的离心设置。
所得到的外泌体组分是否含有外泌体可以通过例如按照本申请实施例的记载使用纳米颗粒分析系统NanoSight测量颗粒数或测量所含蛋白质的量来确认。
或者，可以通过其他方法获得以外泌体作为主要成分的组分，在这样的其他条件下分离浓缩的外泌体也包含在本发明的外泌体中。例如，可以使用总外泌体分离(TotalExosome Isolation)试剂(Thermo Fisher Scientific公司)等进行提取。超滤、造粒。
因此，在一个方面，本发明涉及从日本酒的酒母或醪中提取的外泌体。本发明的外泌体优选为通过上述方法所得到的外泌体。外泌体是由细胞所分泌的脂双层(lipidbilayer)包围的直径为30～200nm的膜内质网，通常内包mRNA、miRNA等核酸或蛋白质等。本发明的外泌体的平均粒径优选为80～200nm、100～180nm、110～160nm或118nm。另外，本发明的外泌体的峰值粒径(peak diameter)可以优选为70～140nm、80～130nm、90～120nm或95nm。
2、含有外泌体的组合物
在另一方面，本发明涉及含有上述外泌体的组合物。本发明的组合物中外泌体的含量没有特别限制，只要其浓度能够达到该组合物的使用目的即可，例如可以为1质量％以上、2质量％以上，3质量％以上、4质量％以上、5质量％以上、10质量％以上、20质量％以上、30质量％以上、40质量％以上，或50wt％以上。本发明组合物中外泌体的含量为可以为4×108个/ml以上、5×108个/ml以上、1×109个/ml以上、1×1010个/ml以上、1×1011个以上、或1×1012个/ml以上。或者，本发明的组合物中外泌体的含量以外泌体所含有的蛋白质的量计，可以为33ng/ml以上、50ng/ml以上、100ng/ml以上、500ng/ml以上、1μg/ml以上，5μg/ml以上、10μg/ml以上、500μg/ml以上、1mg/ml以上、5mg/ml以上、10mg/ml以上、50mg/ml以上、100mg/ml以上、500mg/ml以上、1g/ml以上、5g/ml以上。
该组合物中外泌体以外的成分可以根据使用目的进行适当选择，例如可以含有食品、食品添加剂、化妆品原料、化妆品添加剂、医药品添加剂等。这种外泌体组合物可以是例如食品(包括健康食品和营养补充剂)、化妆品或医药品，并且可以通过在生产过程中适当添加这些的原料来生产。因此，本发明的对象包括添加了本发明外泌体的食品和化妆品(仅添加了外泌体来源的酒母、醪和/或味噌的食品和化妆品除外)。
本发明的组合物的形状没有特别限制，并且可以根据使用形态适当选择。例如，可以列举为粉末状、粒状、颗粒状、片状、棒状、板状、液状、饴状、糊状、霜状、如硬胶囊和软胶囊的胶囊状、囊片状、片状(tablet)、凝胶状、啫喱状和霜状等形态。
由于本发明的外泌体具有抑制癌细胞增殖的作用，因此含有上述外泌体的组合物可以作为用于抑制癌细胞增殖的组合物。在本说明书中，“癌症”包括上皮性恶性肿瘤、脊髓源性造血系统恶性肿瘤等，具体包括淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤等)、多发性骨髓瘤等造血细胞恶性肿瘤；卵巢癌；乳腺癌；乳腺导管癌(ductal carcinoma)；子宫体癌、宫颈癌等子宫癌；子宫内膜癌；非粘液性卵巢癌等卵巢癌；食道癌；胃癌；阑尾癌；大肠癌、直肠癌、结肠癌等大肠癌；肝细胞癌等肝癌；胆囊癌；胆管癌；胰腺癌；肾上腺癌；胃肠道间质瘤；胸膜间皮瘤等间皮瘤；喉癌、咽喉癌、口腔癌(口底癌、牙龈癌、舌癌、颊黏膜癌等)等头颈癌；室管膜瘤(ependymoma)等脑癌；唾液腺癌；鼻窦癌(上颌窦癌、额窦癌、筛窦癌、蝶窦等)；甲状腺癌；肺癌；肺腺癌；骨肉瘤；前列腺癌；睾丸绒毛膜上皮癌等精巢肿瘤或睾丸癌；肾细胞癌等肾癌；膀胱癌；横纹肌肉瘤等肉瘤(Sarcoma)；皮肤癌；肛门癌；或者慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia)和急性粒细胞白血病等血癌，或其转移癌。优选地，癌症是大肠癌、前列腺癌或乳腺癌。
另外，由于本发明的外泌体具有促进NK细胞的颗粒酶表达的作用，因此含有上述外泌体的组合物能够用于促进NK细胞颗粒酶的表达。颗粒酶是一种丝氨酸蛋白酶，在NK细胞的细胞毒性中起核心作用。因此，本发明的用于促进NK细胞颗粒酶表达的组合物够用作利用NK细胞对癌细胞的阻碍能力的用于癌症治疗或预防的医药组合物以外，还能够用作病毒或细菌感染或炎症性疾病的治疗用组合物。
此外，证实了本发明的外泌体具有促进产生胶原蛋白和/或弹力蛋白的作用。因此，含有上述外泌体的组合物能够用于促进产生胶原蛋白和/或弹性蛋白。已知胶原蛋白和弹力蛋白等纤维成分对皮肤和血管等组织的弹性起着重要作用。因此，上述促进产生胶原蛋白和/或弹力蛋白的组合物可用作预防组织失去弹性或提高组织弹性的组合物。特别地，当组织是皮肤时，上述组合物也可用于化妆。更具体地，能够用于改善老化皮肤的外观和减少松弛和/或皱纹或细纹。该用于化妆的组合物可以涂布于皮肤，也可以口服摄入体内。
本发明的组合物的使用量或施用量和使用方法或施用方法可以根据组合物的形态和目的适当设定。例如，当作为食物摄取时，成人可以一天摄取多次，每次摄取0.01mg至100g。
实施例
以下，将列举本发明的实施例来具体说明本发明，但本发明不限于此。另外，本说明书中所引用的文献均通过引用全部并入本说明书。
关于从旭酒造株式会社的獭祭所使用的酒母和醪中回收的外泌体，以评价对癌细胞、免疫细胞和老化细胞的影响为目的进行了以下实验。
(实施例1)制备用于评价的外泌体样品
(1)在4℃下以15,000×g离心獭祭的酒母和醪(旭酒造株式会社)15分钟后，用0.65μm过滤器过滤其上清液(图1)。使用贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司的超速离心机和SW41Ti转子在4℃下以35,000rpm(100,000×g-210,000×g)将过滤后的上清液超速离心70分钟。离心后弃上清，沉淀物悬浮于PBS中，然后在相同条件下再次超速离心，以进行清洗。样品清洗后，将留在管底表面的外泌体组分回收在低吸附管中。超速离心后上清液量为酒母为88mL，醪为176mL。酒母和醪的沉淀物最终分别悬浮在170μL和340μL的PBS中。
(2)未熟化味噌是使用未进行熟化加工的通常的味噌。熟化1～3年的味噌是使用不进行人为加热，利用天然酵母和/或乳酸菌通过自然发酵，等待1～3年在桶中自然熟化的天然酿造所制得的味噌。速熟味噌是使用人为放置在一定温度下加热处理，激活曲的作用而强制发酵，在短时间内做成味噌的速酿法用1个月熟化的味噌。在4℃下以15,000×g离心这些味噌15分钟后，用0.65μm过滤器过滤其上清液(图1)。使用贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司的超速离心机和SW41Ti转子在4℃下以35,000rpm(100,000×g-210,000×g)超速离心过滤后的上清液70分钟。离心后弃上清，沉淀物悬浮于PBS中，然后在相同条件下再次超速离心，以进行清洗。样品清洗后，将留在管底的外泌体组分回收在低吸附管中来使用。
(实施例2)测定制备的外泌体的颗粒浓度和蛋白质浓度
(1)关于从獭祭的酒母和醪回收的外泌体，来自酒母的外泌体用PBS稀释100倍，来自醪的外泌体用PBS稀释40倍。通过纳米颗粒分析系统NanoSight(分析条件：Camera Level14，Detection Threshold 7)对各稀释溶液进行颗粒数测量。关于蛋白质浓度，使用20μL外泌体溶液并使用Qubit蛋白测定试剂盒(Qubit Protein Assay Kit(Invitrogen公司))进行蛋白质定量。
下面的表1显示了使用纳米颗粒分析系统的从獭祭的酒母和醪回收的外泌体的颗粒量和蛋白质浓度。另外，图2显示了通过纳米颗粒分析系统所得到的颗粒的粒度分布图。酒母和醪所含的外泌体的量为酒母为3.8×108个/ml，醪为0.37×108个/ml。酒母和醪中所含的外泌体的蛋白质浓度是酒母为32.1ng/ml，醪为18.1ng/ml。
表1
(2)用生理盐水溶解从每种味噌中回收的1g外泌体后，通过NanoSight(分析条件：Camera Level 14，Detection Threshold 7)进行测量颗粒数的测量。
测量结果为未熟化味噌颗粒数为1.2×1010个/ml，1年熟化味噌为4.7×1011个/ml，3年熟化味噌为7.8×1012个/ml，速熟味噌为2.5×1010个/ml。
(实施例3)HCT116细胞的增殖试验和细胞死亡试验
细胞在96孔板的各孔中各接种2000个HCT116细胞(来自人结肠腺癌的癌细胞)，次日，将实施例1制备的外泌体以0.5、1和2μg/mL的浓度添加。三天后进行细胞增殖试验，以评价细胞增殖。
通过测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)活性来评价由于细胞凋亡引起的细胞死亡。从完成细胞增殖试验的(3)的细胞除去培养基，加入100μl M-PER哺乳动物蛋白质抽提试剂(Mammalian Protein Extraction Reagent)(Thermofischer Scientific公司)裂解细胞，得到细胞裂解液。将50μl细胞裂解液和50μl的Caspase-Glo(注册商标)3/7试剂(Caspase-Glo(注册商标)3/7检测系统，Promega公司)的溶液混合，通过发光来测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶活性。
如图3所示，当以0.5、1、2μg/mL的浓度向大肠癌细胞系HCT116中加入来自醪和酒母的外泌体时，与对照(PBS)比较，醪的情况下在5μg/mL以上、酒母的情况下在1μg/mL以上时发现了增殖抑制活性。但是，关于细胞凋亡，与对照比较没有发现显著差异，因此认为来自酒母和醪的外泌体在大肠癌细胞系中的效果是细胞增殖抑制活性。
(实施例4)多种癌细胞种类的增殖试验和细胞死亡试验
为了确认在结肠癌以外的癌细胞中是否获得同样的效果，除了外泌体浓度为2μg/mL以外，以与实施例3相同的方式使用更多的癌细胞种类(大肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MDA-MB-231和前列腺癌细胞系PC-3M)进行了增殖抑制试验和细胞凋亡诱导能力试验。
如图4所示，与实施例2相同，在大肠癌细胞系中再现了增殖抑制效果。另外，在前列腺癌细胞系和乳腺癌细胞系中观察到与大肠癌相同的效果，在肺癌中虽然较弱但是也观察到增殖抑制效果。
细胞凋亡测定结果如图5所示。以与PBS比较的相对量评价的结果，在全部的细胞系中均未发现显著的细胞凋亡诱导。因此，再次确认了图4所发现的细胞增殖抑制效果不是由于细胞死亡诱导而是由于抑制细胞增殖。
(实施例5)癌细胞的迁移试验
接种HCT116细胞到24孔板，次日，在板内划痕，形成部分空间。将划痕当天作为第0天，在第0天、第1天和第2天拍摄细胞，根据划痕部分细胞的迁移评估变窄的程度。
迁移试验的结果显示于图6(照片)和图7(图表)中。关于迁移能力，虽然发现了醪和酒母有抑制的趋势，但未看到显著的抑制效果。
成功地分别从酒母和醪分离出外泌体组分。评价癌细胞的增殖抑制能力和细胞死亡诱导能力的结果，在前列腺癌、大肠癌和乳腺癌细胞系中观察到增殖抑制作用，在肺癌细胞系中观察到弱的增殖抑制作用。由于确认到对这些细胞系没有诱导细胞死亡，所以可知来自酒母和醪的外泌体不导致癌细胞死亡而仅具有抑制细胞增殖而的效果。另外，关于癌细胞迁移能力，虽然发现了阻碍的趋势，但没有观察到显著的变化。据此，酒母和醪来源的外泌体观察到了抑制癌细胞增殖的效果，但考察到该效果不像抗癌试剂那种诱导细胞死亡那么强的效果，而是平稳地阻止癌细胞增殖的效果。
表2
(实施例6)免疫细胞颗粒酶表达分析
(1)将能够长期培养的NK细胞的NK-92MI细胞各25,000个细胞接种于24孔板，添加实施例1制备的外泌体为3、10或30μ/L(味噌外泌体时，每个细胞大约100个颗粒，即每孔2×107个颗粒)。两天后收集细胞，提取蛋白质，并通过蛋白质印迹法测定蛋白质表达量。
(2)酒母外泌体的结果
如图8所示，发现通过添加酒母外泌体，NK细胞中颗粒酶的表达量增加。图8的上图为评价蛋白质表达量的蛋白质印迹法的照片，下图为定量其表达量的图。综上，认为酒母外泌体通过提高NK细胞内颗粒酶表达而有助于杀伤细胞效果。关于醪外泌体，没有发现颗粒酶的表达量有显著变化。
(3)味噌外泌体的结果
如图12所示，通过添加1年和3年熟化味噌的外泌体，发现NK细胞中颗粒酶的表达量增加。因此，1年以上熟化味噌的外泌体通过提高NK细胞内颗粒酶的表达而有助于细胞杀伤效果。
(实施例7)测定免疫细胞中细胞因子的分泌
评价了干扰素γ、白细胞介素17和TNFα这三种细胞因子的分泌量，其是NK细胞的主要细胞因子分泌物。将NK-92MI细胞各25,0000个细胞接种到24孔板上，并添加外泌体至3、10或30μ/L。两天后，收集培养上清液，以300g离心3分钟，收集上清液。使用ELISA试剂盒(R&D系统)测定上清液中的干扰素γ、白细胞介素17和TNFα。
结果如图9所示。没有发现任何细胞因子分泌量显著上升，但酒母外泌体中干扰素γ分泌的量减少。
(实施例8)老化细胞中的β-半乳糖苷酶染色
进行β-半乳糖苷酶染色作为老化细胞的评价方法。β-半乳糖苷酶染色使用了已知具有高灵敏度的SPiDER-βGal(Dojindo公司)。具体地，将添加至3、10或30μ/L的外泌体的成纤维细胞(P8)以2×105个细胞/培养皿接种于60mm培养皿中，并传代2次，使细胞老化。每次细胞传代时，添加外泌体至3、10或30μ/L。之后，将老化的成纤维细胞(P10)接种在35mm玻底培养皿上。次日，通过抽吸除去培养基并用2ml HBSS清洗一次。培养开始72小时后，添加2ml4％多聚甲醛/PBS溶液，在室温固定3分钟。抽吸除去2ml 4％多聚甲醛/PBS溶液，用2mlHBSS清洗两次。加入2ml SPiDER-βGal工作液(Dojindo)，在37℃静置30分钟。之后，用2mlHBSS清洗两次，并用激光扫描共聚焦显微镜观察。
结果如图10所示。对照和添加外泌体的细胞中的细胞均被染成绿色，由此表明来自醪和酒母的外泌体不能阻止细胞老化。
(实施例9)老化细胞中胶原酶和弹力蛋白表达量的测定
(1)评价了通过添加外泌体，老化成纤维细胞中活性减少的胶原蛋白和弹力蛋白的表达量的变化。在24孔板上接种100,000个细胞的老化的成纤维细胞(P10)，次日，以3、10或30μ/L(味噌外泌体时，每个细胞大约100个，即每孔2×107个颗粒)添加外泌体，两日后，使用Qiagen miRNeasy mini试剂盒进行RNA提取。将提取的RNA作为样品，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems公司)进行RT-PCR。使用Taqman Universal Master Mix II(Applied Biosystems公司)用于定量PCR。作为用于检测胶原酶和弹力蛋白的引物/探针，使用Applied Biosystems公司的Taqman方法进行评价。使用I型胶原蛋白α1链、I型胶原蛋白α2链、III型胶原蛋白和弹力蛋白的引物/探针。
(2)酒母、醪外泌体的结果
评价作为重要的皮下胶原蛋白的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白的表达量。其结果如图11所示。通过加入酒母外泌体，I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹力蛋白的表达量全部提升。另一方面，当添加醪外泌体时，没有发现这些物质的表达量发生变化。
(3)味噌外泌体的结果
评价I型胶原蛋白和弹力蛋白的表达量。其结果如图13所示。通过加入味噌外泌体，I型胶原蛋白和弹力蛋白的表达量全部提升。尤其是，加入3年熟化的外泌体时，这些物质的表达量显著提高。
如上所述，从酒母和醪以及味噌分离外泌体组分，评价免疫细胞和老化细胞中的功能。关于免疫细胞，着眼于对癌细胞具有细胞杀伤效果的NK细胞。其结果发现，通过加入酒母外泌体，已知具有细胞杀伤效果的颗粒酶在细胞内的量增加了。这一结果表明，NK细胞在攻击癌细胞时会更有效地杀死更多的癌细胞。另一方面，唤醒其他免疫细胞的细胞因子的分泌没有显著变化。酒母外泌体中的干扰素γ的分泌量减少，与颗粒酶的表达量呈负相关，由此可以认为NK细胞处于提高细胞杀伤活性的阶段。
另一方面，关于成纤维细胞老化的评价，酒母外泌体和醪外泌体都不能阻止成纤维细胞的老化。另一方面，通过添加酒母外泌体，老化成纤维细胞的胶原蛋白和弹力蛋白的产生提高，因此表明它具有提高因皮肤老化而减少的胶原蛋白和弹性蛋白产生的作用。
综上所述，发现来自酵母(酒母、醪、味噌)的外泌体通过增加颗粒酶的表达量来提高NK细胞的细胞杀伤效果。另外，关于老化细胞，由于提高胶原蛋白和弹力蛋白的表达量，从而能够有助于来防止皮肤弹性下降和提高弹性。
表3
醪 酒母
抗癌作用 + +
增强免疫力效果 - ++
抗老化作用 - -
美肤效果 - +++

Claims (8)

1.一种用于抑制癌细胞增殖的组合物，所述组合物包含外泌体作为有效成分，所述外泌体提取自日本酒的酒母或醪中所含的酵母，或熟化1年以上或3年以上的味噌中所含的酵母。
2.根据权利要求1所述的组合物，其含有4×108个/ml以上或作为蛋白质的量为33ng/ml以上的所述外泌体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其含有4.7×1011个/ml以上的所述外泌体。
4.根据权利要求1所述的组合物，其含有7.8×1012个/ml以上的所述外泌体。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，癌细胞是大肠癌、前列腺癌或乳腺癌。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述外泌体通过包括以下步骤的方法制造：
(a)以10,000～20,000×g离心日本酒的酒母或醪，或熟化1年以上或3年以上的味噌；
(b)以10,000～210,000×g超速离心通过所述(a)所得到的上清液；以及
(c)将沉淀物作为外泌体组分回收。
7.一种用于增强NK细胞的颗粒酶表达的组合物，所述组合物包含外泌体作为有效成分，所述外泌体提取自日本酒的酒母中所含的酵母，或熟化1年以上或3年以上的味噌中所含的酵母。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述外泌体通过包括以下步骤的方法制造：
(a)以10,000～20,000×g离心日本酒的酒母，或熟化1年以上或3年以上的味噌；
(b)以10,000～210,000×g超速离心通过所述(a)所得到的上清液；以及
(c)将沉淀物作为外泌体组分回收。
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