CN109892293B

CN109892293B - 一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法及验证方法

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Publication number: CN109892293B
Application number: CN201910355553.1A
Authority: CN
Inventors: 侯立娟; 林金盛; 蒋宁; 马林; 曲绍轩; 李辉平
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN109892293A

Abstract

本发明涉及果蝇基因表达量处理技术领域，尤其是一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法及验证方法。处理方法包括：(1)桑黄子实体的获得；(2)桑黄水体液的制备；(3)冷冻干燥；(4)配置母液；(5)稀释；(6)倒入培养基，加酵母粉；(7)收集处女果蝇；(8)培养；(9)及时更换培养基。验证方法包括骤：(1)培养；(2)收集果蝇样品；(3)RNA提取；(4)cDNA反转录；(5)qPCR基因验证。本发明的方法简单快捷、效果明显，能提高与果蝇寿命有关基因的表达量，且不需要昂贵的仪器设备，具有省时简便、成本低的优点。本发明对延长人的寿命有重要的参考价值，并对丰富桑黄的药用价值、延长寿命提供了理论基础。

Description

一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法及验证方法

技术领域

本发明涉及果蝇基因表达量处理技术领域，具体领域为一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法及验证方法。

背景技术

果蝇作为一种重要的模式生物，具备繁殖力强、世代周期短、变异类型多且饲养简单等特点。目前它已被广泛用于生命科学的各个研究领域。尤其是果蝇大约75％与人类疾病同源的基因和代谢途径与人类十分相似，而作为研究衰老和衰老相关疾病的模式生物。衰老是机体组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变化，是机体各种生化反应的综合表现，是体内外许多因素(遗传、精神紧张、心理、社会、环境污染等)共同作用的结果，其机制涉及神经、内分泌、免疫等多方面的改变。关于衰老的理论有多种，包括自由基理论、体细胞突变理论、端粒缩短理论等，其中自由基理论是最有代表性的衰老学说之一。

许多方面的研究证明了抗衰老的根本目的在于尽可能的延长寿命，并在此基础上提高生命活力，故国内外均将细胞和整体寿命试验作为药物延缓衰老研究的主要检测手段。减缓自由基的生成、提高抗氧化能力、促进细胞增殖、提高免疫能力、对抗凋亡而发挥延缓衰老的功效，生命活力的提高及内分泌免疫相关基因上调等等也是抗衰老的重要目的。

桑黄是一种名贵的药用菌，桑黄活性成分的组成与含量是其保健治疗作用的根本。其报道较多的主要活性成分有桑黄多糖、黄酮类化合物、萜类化合物、吡喃酮类化合物、甾体类化合物等，药用成分表现在调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抑菌消炎、增强免疫力、保护肝脏，抗炎、止痛与免疫调节作用上预防和治疗关节炎等作用。近年来国内对的抗肿瘤和提高免疫等方面对的学术研究及报道大量涌现，除此之外，桑黄的保肝、抗肝硬化作用有很多报道，桑黄具有对试验大鼠减轻肝细胞损伤，降低肝纤维化，改善肝脏微循环的作用，还可以降低空腹与餐后血糖浓度的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法及验证方法，该处理方法具有操作简便，使果蝇寿命有关的基因的表达量增加，这对人类如何延长寿命提供了重要的理论价值和使用价值。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法，包括以下步骤：

(1)桑黄子实体的获得；(2)桑黄水体液的制备；(3)桑黄水体液冷冻干燥得冻干粉；(4)冻干粉配置母液；(5)母液稀释得稀释液；(6)稀释液倒入培养基，加酵母粉形成含有桑黄水提物的培养基；(7)收集处女果蝇；(8)对处女果蝇在含有桑黄水提物的培养基中培养；(9)及时更换培养基。

其中，步骤(1)中桑黄子实体采自吉林省；为野生桑树上采集，并经专业人员鉴定；

其中，步骤(2)具体为，将干燥的桑黄子实体小颗粒与水按照重量比1:10的比例，在100℃沸水中煮2h，12000G/min下室温离心30min，滤得残渣进行二次提取，合并收集上清液到离50mL灭过菌的管心中。

其中，步骤(3)具体为，将装有上清液的离心管放在冷冻干燥器使其冷冻干燥成干粉备用；所述冷冻干燥器的冷冻温度为-55℃，干燥时间为15d。

其中，步骤(4)具体为，取干粉采用水配置成1mg/mL的母液备用。

其中，步骤(5)具体为，将步骤(4)的母液进行稀释，具体依次为：

步骤a：即取母液18μl、双蒸水982μl装在已灭菌的2mL离心管中为A液，震荡混匀后备用；

步骤b：准备15mL已灭菌离心管，装满13mL双蒸水后为B液，然后将A液用移液枪吸到B液中，将A液离心管离心5000rpm 2min后，确保A液的1mL全部吸到B液中，然后用力颠倒混匀30次后离心5min后，即获得C液。

其中，步骤(6)具体为，准备干净灭过菌的养虫小瓶，装满4g培养基，将步骤(5)配好的C液14mL倒入培养基中；加入25mg的酵母粉，塞好棉塞。

所述培养基为卡罗莱纳生物供应公司产品名为Formula

的培养基(此培养剂为市售饲养果蝇饲料，加水变蓝色，生产厂家位于伯灵顿，北卡罗来纳州；产品购买网址为www.carolina.com)。

其中，步骤(7)具体为，收集同一批次、同一时间内新出现的处女果蝇；

即对加有Formula

培养基饲料的三角瓶中的备用果蝇，进行CO₂麻醉处理；将麻醉的果蝇全部倒掉，然后开始计时，计时后的2-4小时新出现的果蝇为处女果蝇；

将新出现的处女果蝇用CO₂麻醉处理，倒在试验的海绵操作台上，然后分别挑选雌雄各10只，移入盛有步骤(6)制备的培养基的培养瓶后，将培养瓶横卧，以免果蝇粘在培养基上，盖好瓶塞，自由取食；

其中，所述步骤(8)具体为，待果蝇苏醒后即可将培养瓶放入恒温培养箱培养；将培养果蝇小瓶放在温度为25±1℃，相对湿度55-60％左右，光照：黑暗＝12h:12h的人工培养箱里；

其中，所述步骤(9)具体为，每隔5d更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中，即果蝇用CO₂麻醉处理后立刻转入到装有新的培养基的培养瓶中。

为了验证本发明的提高果蝇寿命基因表达量处理方法的效果，采用下述的验证方法，具体包括以下步骤：

(A)培养；(B)收集果蝇样品；(C)RNA提取；(D)cDNA反转录；(E)qPCR基因验证。

其中，步骤(A)具体为按照所述提高果蝇寿命基因表达量的处理方法中步骤(1)-(8)中步骤进行培养；

其中，步骤(B)具体为，每隔5d更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中；分别在培养期的第1d,3d,5d,10d,20d取果蝇成虫雌雄各5只；二氧化碳麻醉后的果蝇，用150μL PBS缓冲液清洗后，再用150μL的70V％的乙醇水溶液清洗后，放置-70℃的低温冷冻冰箱冷冻备用；

其中，步骤(C)具体为，RNA的提取采用TRIzol方法：

a.将5头雌果蝇加入200μL的TRIzol溶液进行电动研磨，研磨到非常小的颗粒，然后在加入800μL的TRIzol补足到1mL；

b.室温裂解5min，可离心去掉沉淀杂质；

c.加入200μL氯仿剧烈震荡混匀，室温放置2-3min在离心力为12000g、4℃下离心10min；

d.吸取上层溶液，转移到另一个新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，轻轻混匀5-6次，放置10min后，在离心力为12000g、4℃下离心10min；

e.用1mL 75V％的乙醇清洗2次，4℃下在离心力为7500g离心10min；

f.用移液枪吸走管底多余的液体，晾干约3-5min；

g.用20μL的DEPC水溶解RNA，测定浓度得RNA溶液。

其中，步骤(D)具体为，合成cDNA：采用两步法进行反转录；总体系为15μL；

第一步，反应体系为10.23μL，包括Oligo(dT)₁₅为0.6μL，1.2μL RNA溶液，采用ddH₂O补齐至10.23μL；70℃反应5min，然后立即放在冰上；

第二步采用4.77μL，依次加入5×buffer 3μL，dNTP 0.75μL；Znhibitor 0.4μL；M-MLV 0.6μL；加完后混匀放在PCR仪中，42℃反应1h；然后测cDNA浓度；

其中，步骤(E)具体为，选用与寿命有关的基因进行qPCR验证：

qPCR在荧光定量PCR系统中完成，所用荧光染料为SYBR green I.反应体系为10μL：SYBR Green PCR Master Mix 5μL，DNA样品1μL，正反引物各1μL及H₂O 3μL；

反应程序：94℃预变性1min，94℃15S,58℃30S,72℃35S，40个循环，每个样品设置3次重复；

qRT-PCR分析所用的引物序列如SEQ ID No:1-28所示；

计算：以RP 49作为对照基因，相对mRNA累计计算方法为：2-△△CT方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的方法简单快捷、效果明显，能提高与果蝇寿命有关基因的表达量，且不需要昂贵的仪器设备，具有省时、简便、成本低的优点。本发明对于如何延长人的寿命有重要的参考价值，同时对丰富桑黄的药用价值、延长寿命提供了理论基础。

附图说明

图1为不同时间对TEP基因的表达情况；

图2为不同时间对Brc基因的表达情况；

图3为不同时间对TotA基因的表达情况；

图4为不同时间对PHM基因的表达情况；

图5为不同时间对SPO基因的表达情况；

图6为不同时间对EcRB基因的表达情况；

图7为不同时间对Dros基因的表达情况；

图8为不同时间对INDY基因的表达情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所用试剂如未做特别说明均为分子生物学中市售常规试剂，具体为美国Promega公司的Cat.#A3500 100次反应所列。

实施例1

一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法，包括以下步骤：

(1)桑黄子实体的获得：野生桑黄子实体采自吉林，并由食用菌分类专家鉴定为桑黄。

(2)桑黄水体液的制备：每隔5d更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中；分别在培养期的第1d,3d,5d,10d,20d取果蝇成虫雌雄各5只；二氧化碳麻醉后的果蝇，用150μL PBS清洗后，再用150μL的70％的乙醇清洗后，放置-70℃的低温冷冻冰箱冷冻备用。

(3)将装有上清液的离心管放在冷冻干燥器使其冷冻干燥成干粉备用；所述冷冻干燥器的冷冻温度为-55℃，干燥时间为15d。

(4)用水将冻干粉先配置成1mg/mL的母液进行备用；

(5)将步骤(4)的母液按照终浓度为1μg/mL的浓度进行稀释(稀释液14mL和4g二者组成的体系中，桑黄冻干粉的浓度为1μg/mL)，具体依次为：

步骤a：即取母液18μl双蒸水及982μl装在已灭菌的2mL离心管中为A液，震荡混匀后备用；

步骤b：准备15mL已灭菌离心管中，装满13mL双蒸水后为B液，然后将A液用移液枪吸到B液中，将A液离心管离心5000rpm2min后，确保A液的1mL全部吸到B液中，然后用力颠倒混匀30次后离心5min后，即获得C液。

(6)准备干净灭过菌的养虫小瓶，装满4g培养基，将步骤(5)配好的14mL C液依次倒入培养基瓶中；所述培养基为Formula

对照组采用14mL双蒸水替代14mL的C液。对照组和处理组分别3次生物学重复和3次技术重复，分别加入25mg的酵母粉，塞好棉塞。Formula

培养基是商业专用于饲养果蝇研制，成分固定；而常规的玉米培养基、香蕉培养基等存在不同批次原料及成分不固定、不确定的因素太多导致对试验误差影响大。

上述培养基的配置，添加桑黄水提物的浓度为1μg/mL(稀释液14mL和4g二者组成的体系中，桑黄冻干粉的浓度为1μg/mL)，以不加桑黄水提物0μg/mL(即以14mL双蒸水代替稀释液14mL)的培养基为对照。

并经过实验，结果发现：浓度1μg/mL为最佳浓度，浓度太低对果蝇的寿命的延长没有显著作用，浓度过高造成果蝇提前死亡，因成虫果蝇是舐吸式口器，对发酵的水果汁和糖醋液有很强的趋向性，单靠水也可以存活，但是培养基有利于产卵，意外发现添加此浓度的桑黄提取液到培养基有很好的延长寿命的作用。

验证实验：

(1)收集同一批次、同一时间内新出现的处女果蝇(W¹¹¹⁸品系果蝇)，即：将三角瓶同样加有Formula

的培养基饲料的备用果蝇，进行CO₂麻醉(对果蝇进行检查，一般用乙醚进行麻醉，但对人体对危害，而CO₂对人体安全)处理后，将三角瓶中麻醉的果蝇全部倒掉，然后开始计时，计时后的2-4小时新出现的果蝇为处女果蝇；

将新出现的处女果蝇用CO₂麻醉处理，倒在试验的海绵操作台上，然后分别挑选雌雄各10只，移入后，将瓶横卧，以免果蝇粘在培养基上，分别放在装有上述步骤(6)制得的处理培养基和对照培养基中里，盖好瓶塞，自由取食；所述同一时间为2-4h内。

(2)待果蝇苏醒后即可将培养瓶放入恒温培养箱培养；将培养果蝇小瓶放在温度为25±1℃，相对湿度55-60％左右，光照：黑暗＝12h:12h的人工培养箱里；

(3)每隔5d更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中，即果蝇用CO₂麻醉处理后立刻转入到装有新的培养基的培养瓶中。分别在培养期的第1d,3d,5d,10d,20d取果蝇成虫雌雄各5只。

(4)二氧化碳麻醉后的果蝇，用150μL PBS清洗后，再用150μL的70V％的乙醇水溶液清洗后，放置-70℃的低温冷冻冰箱冷冻备用。

(5)RNA的提取采用TRIZOL方法：

b.室温裂解5min，可离心去掉沉淀杂质；

c.加入200μL氯仿剧烈震荡混匀，室温放置2-3min，12000g在4℃下离心10min；

d.吸取上层溶液，转移到另一个新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，轻轻混匀5-6次，放置10min后，于12000g，在4℃下离心10min；

e.用1mL 75V％的乙醇水溶液清洗2次，4℃下7500g离心10min；

f.用移液枪吸走管底多余的液体，晾干约3-5min；

g.用20μL的DEPC水溶解RNA，测定浓度。

(6)合成cDNA：

采用两步法进行反转录。总体系为15μL。

第一步，反应体系为10.23μL，包括Oligo(dT)₁₅为0.6μL，1.2μL RNA(步骤g所得)，ddH₂O补齐至10.23μL。70℃反应5min，然后立即放在冰上；

第二步采用4.77μL，依次加入5×buffer 3μL，dNTP 0.75μL；Znhibit or 0.4μL；M-MLV 0.6μL；加完后混匀放在PCR仪中，42℃反应1h。然后测cDNA浓度。

(7)选用与寿命有关的基因进行qPCR验证。

qPCR在荧光定量PCR系统(7500型，ABI，USA)中完成，所用荧光染料为SYBR greenI.反应体系为10μL：SYBR Green PCR Master Mix 5μL，DNA样品1μL，引物各1μL及H₂O 3μL。反应程序：94℃预变性1min，94℃15S,58℃30S,72℃35S，40个循环，每个样品设置3次重复。qRT-PCR分析所用的引物如表1所示，引物序列如SEQ ID No:1-28所示。多个与寿命有关基因在不同时间点下的表达情况如图1-8所示(图中x轴代表饲养果蝇的天数，Y轴代表的是实验组与对照组培养基培养出的果蝇的基因表达倍数)。

计算结果：

RP 49作为对照基因，相对mRNA累计计算方法为：2-△△CT方法(△△CT＝△CT目标基因-△CT_RP49)。

表1.qRT-PCR分析所用的引物

最终结果表明：在果蝇的饲料中添加了1μg/mL桑黄水提液(稀释液14mL和4g二者组成的体系中，桑黄冻干粉的浓度为1μg/mL)，能使抗衰老、抗肿瘤及免疫基因，抗氧化显著高表达。在与对照比较，在培养整个阶段，多达几个时间都比对照得基因显著表达，尤其如寿命基因INDY以及TotA、Dros在饲养果蝇20d的时间点还是显著高表达，说明随着时间的延长，添加了桑黄的提取液能够诱导这些基因的高表达。因其果蝇的基因组与人类的基因组有70％的相似性，以模式动物开展的衰老的研究比较广泛，而用桑黄研究对果蝇寿命能延长，具有创新性和新颖性，本结果显示能延长果蝇的寿命，也就意味着同样也能延长人类的寿命。为桑黄的药用价值的丰富，奠定了理论基础。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种提高果蝇寿命基因表达量的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）桑黄子实体的获得；桑黄子实体采自吉林省；为野生桑树上采集；

（2）桑黄水体液的制备；步骤（2）具体为，将干燥的桑黄子实体小颗粒与水按照重量比1:10 的比例，在100℃沸水中煮2h后室温离心，滤得残渣进行二次提取，合并收集上清液；

（3）桑黄水体液冷冻干燥得冻干粉；步骤（3）具体为，将上清液冷冻干燥成冻干粉备用；所述冷冻干燥的冷冻温度为-55℃，干燥时间为15d；

（4）冻干粉配置母液；步骤（4）具体为，取冻干粉采用水配置成1mg/mL的母液备用；

（5）母液稀释得稀释液；步骤（5）具体为，将步骤（4）的母液进行稀释，具体依次为：

步骤a：即取母液18μl、双蒸水982 μl装在已灭菌的2mL离心管中为A液，震荡混匀后备用；

步骤b：准备15mL已灭菌离心管，装13mL双蒸水后为B液，然后将A液用移液枪吸到B液中，然后用力颠倒混匀30次后离心5min得C液；

（6）稀释液倒入培养基，加酵母粉形成含有桑黄水提取物的培养基；步骤（6）具体为，准备干净灭过菌的培养瓶，装满4g培养基，将步骤（5）配好的C液14mL倒入培养基中；加入25mg酵母粉，塞好棉塞；所述培养基为卡罗莱纳生物供应公司产品名为Formula 4-24®的培养基；

（7）收集处女果蝇；步骤（7）具体为：

收集同一批次、同一时间内新出现的处女果蝇；

即对加有Formula 4-24® 培养基饲料的三角瓶中的备用果蝇，进行CO2 麻醉处理；将麻醉的果蝇全部倒掉，然后开始计时，计时后的2-4小时新出现的果蝇为处女果蝇；

将新出现的处女果蝇用CO2 麻醉处理，然后分别挑选雌雄各10只，移入盛有步骤（6）制备的培养基的培养瓶后，将培养瓶横卧，盖好瓶塞，自由取食；

（8）对处女果蝇在含有桑黄水提取物的培养基中培养；所述步骤（8）具体为，待果蝇苏醒后即可将培养瓶放入恒温培养箱培养；培养温度为25±1℃，相对湿度55-60％，光照：黑暗=12h:12h的恒温培养箱里；

（9）及时更换培养基；

所述步骤（9）具体为，每隔5d 更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中，即果蝇用CO2 麻醉处理后立刻转入到装有新的培养基的培养瓶中；

所述果蝇寿命基因为INDY以及TotA、Dros。

2.一种根据权利要求1所述提高果蝇寿命基因表达量处理方法的验证方法，具体包括以下步骤：

（A）培养；（B）收集果蝇样品；（C）RNA 提取；（D）cDNA反转录；（E）qPCR 基因验证；

其中，步骤（A）具体为按照所述提高果蝇寿命基因表达量的处理方法中步骤（1）-（8）中步骤进行培养；

其中，步骤（B）具体为，每隔5d 更换一次相应的新鲜的培养基，活的果蝇成虫转管到新的培养基中；分别在培养期的第1 d, 3d, 5d,10d,20d 取果蝇成虫雌雄各5只；二氧化碳麻醉后的果蝇，用150µL PBS缓冲液清洗，再用150 µL的70V%的乙醇水溶液清洗，放置-70℃的低温冷冻冰箱冷冻备用；

其中，步骤（C）具体为，RNA的提取采用TRIzol方法：

a. 将5头雌果蝇加入200 µL的TRIzol 溶液进行电动研磨，研磨到非常小的颗粒，然后再加入800 µL的TRIzol补足到1mL；

b. 室温裂解5min，离心去掉沉淀杂质；

c. 加入200µL氯仿震荡混匀，室温放置2-3 min后离心；

d. 吸取上层溶液，转移到另一个新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，轻轻混匀5-6次，放置10min后离心；

e．用1mL 75V%的乙醇水溶液清洗2次，离心；

f. 用移液枪吸走管底多余的液体，晾干3-5min；

g. 用20 µL 的DEPC水溶解RNA，测定RNA溶液的浓度；

其中，步骤（D）具体为，合成cDNA：采用两步法进行反转录；总体系为15µL；

第一步，反应体系为10.23 µL，包括Oligo(dT) ₁₅为0.6 µL，1.2 µL RNA模板，采用ddH₂O 补齐至10.23µL；70℃反应5min；

第二步，反应体系为4.77 µL：依次加入 5×buffer 3 µL，dNTP 0.75 µL；Znhibitor0.4 µL；M-MLV 0.6 µL；加完后混匀放在PCR仪中，42℃反应1h；然后测cDNA浓度；

其中，步骤（E）具体为，选用与寿命有关的基因进行qPCR验证：

qPCR在荧光定量PCR系统中完成，所用荧光染料为SYBR green I，反应体系为10 µL：SYBR Green PCR Master Mix 5 µL，DNA样品1 µL，引物各1 µL及H₂O 3 µL；

反应程序：94℃预变性1min，94℃ 15S, 58℃ 30S, 72℃ 35S，40个循环，每个样品设置3次重复；

qRT-PCR分析所用的引物序列如SEQ ID No:1-28所示；

计算：以RP 49作为对照基因，相对mRNA累计计算方法为：2-△△CT 方法。