CN110292126A - 马鞭草在促进虎龙杂交斑生长、提高抗氧化和免疫能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了马鞭草在促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力或制备石斑鱼饲料中的应用。本发明首先提供了一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料添加剂，所述添加剂中含有马鞭草粉末。所述添加剂为纯植物成分，具有毒副作用小、价格便宜、不易产生抗药性、无污染、无残留等优点。基于以上饲料添加剂，本发明还提供了一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料，所述饲料含有所述饲料添加剂。所述饲料能有效提高石斑鱼的抗氧化酶活和免疫相关基因的表达，提高其抗氧化和免疫能力；同时，能够提高石斑鱼的成活率以及消化酶活力，从而促进其健康生长，大幅度提升石斑鱼养殖产业的经济效益，促进产业链的健康发展。

Description

马鞭草在促进虎龙杂交斑生长、提高抗氧化和免疫能力中的 应用

技术领域

本发明属于饲料技术领域，更具体地，涉及马鞭草在促进虎龙杂交斑生长、提高抗氧化和免疫能力中的应用。

背景技术

石斑鱼(Epinephelus sp.)隶属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)，我国已有记录的石斑鱼共45种，广泛分布于热带和亚热带海域。虎龙杂交斑(Epinepheluslanceolatus)是由棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus♀)和鞍带石斑鱼(Elancedatiis♂)杂交的新品种，具有生长速度快、成活率高、体形美观、肉质鲜美等优良特性，营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪的上佳食用鱼，在港澳地区很受欢迎。虎龙杂交斑因其较快的生长速度，有效的饲料转化和极高的市场价值，使其在中国南方沿海养殖普遍。但是，由于集约化、规模化养殖面积的扩大和养殖密度的增加，养殖石斑鱼的各种病害发生更加频繁，给养殖业带来了巨大的经济损失。

病害已成为制约水产养殖发展的主要因素之一，目前，主要使用抗生素类及各类化学药品进行疾病防治，而大多数药物在使用过程中都存在过量使用、甚至严重滥用的现象，不仅使病原菌产生了耐药性和抗药性，不能有效治疗病害，而且化学物质在鱼体内的富集不利于食用健康；另外，药物在水体中的残留对环境也造成了严重污染，在一定程度上造成整个水体生态环境的破坏。

现有研究发现，饲料添加剂具有促进水产动物生长的作用，国内外水产养殖者多采用在饲料中加入各类添加剂以达到提高饵料利用率。但是，目前市场上的添加剂大部分是化学合成添加剂，如果长期使用，会在动物体内造成残留，严重影响产品质量，危害人体健康。而且，近年来，随着人们对水产品质量的日益重视，人们对水产动物饲料在人类健康安全和环保方面提出了更高的要求。因此，实行健康养殖是当前及今后鱼类养殖业进一步发展的必然选择，而开发安全、环保、高效的饲料添加剂，提高鱼类免疫抗病力，降低鱼类养殖对药物的依赖，是实现鱼类养殖业可持续发展的重要技术支撑。

近年来，应用中草药降低水产动物发病率是近些年研究的热点之一。到目前为止，有关水产饲料中添加中草药的研究主要集中于鲤鱼、鲫鱼和罗非鱼等，尚无关于中草药对虎龙杂交斑的促生长作用的研究报道。因此，研究一种能够增强强健鱼体，促进虎龙杂交斑生长，提高抗氧化能力和免疫能力，进而降低病害发生的安全、环保、高效的饲料添加剂，对于虎龙杂交斑的健康养殖和可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有饲料添加剂的缺陷和不足，提供马鞭草在促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力或制备石斑鱼饲料中的应用。

本发明的另一目的是提供一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料添加剂。

本发明的再一目的是提供一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明基于前期的研究，首先对马鞭草水提液和马鞭草粉末中含有的营养成分进行测定，发现：马鞭草水提液中含有马鞭草苷、戟叶马鞭草苷成分，不含有齐墩果酸、熊果酸等成分；而马鞭草粉末中保留了其原有的环烯醚萜糖苷类、苯丙素糖苷类、三萜类、黄酮类、甾醇类、挥发油类、有机酸类成分等。因此，本发明以马鞭草粉末作为对象，研究其对石斑鱼生长、抗氧化和免疫力等方面的影响和作用，具体研究内容如下：

本发明首先提供了马鞭草在促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力或制备石斑鱼饲料中的应用。

优选地，所述石斑鱼为虎龙杂交斑、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、云纹石斑鱼、宝石石斑鱼、七带石斑鱼、鳃棘鲈或驼背鲈中的任意一种或几种。

更优选地，所述石斑鱼为虎龙杂交斑。

本发明还提供了一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料添加剂，所述添加剂中含有马鞭草粉末。

优选地，所述马鞭草粉末的制备方法为：将马鞭草原料粉碎，混合均匀，即可得到所述马鞭草粉末。

优选地，所述马鞭草粉末的粒度范围为20～60目。

更优选地，所述马鞭草粉末的粒度范围为40目。

本发明还提供了一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料，所述饲料含有马鞭草粉末。马鞭草粉末以饲料添加剂的作用添加于饲料中。优选地，以质量百分比计，所述饲料包括：2％～6％的马鞭草粉末、94％～98％的基础饲料。

当马鞭草粉末的质量百分比不在2％～6％范围内时，制备得到的饲料对石斑鱼生长、抗氧化和免疫能力的影响与对照组无显著差异，对于促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力无显著效果。

更优选地，以质量百分比计，所述饲料包括：4％的马鞭草粉末、96％的基础饲料。

更优选地，以质量百分比计，所述饲料包括：2％的饲料添加剂、98％的基础饲料。

更优选地，以质量百分比计，所述饲料包括：6％的马鞭草粉末、94％的基础饲料。

优选地，所述饲料的制备方法为：将饲料添加剂和基础饲料经粉碎、过筛、混匀，制成直径为0.5～10mm的沉性颗粒料，冷冻干燥，即可得到所述饲料。

所述沉性颗粒料的直径根据饲养鱼的口径大小选择，沉性颗粒料的直径以1/2口径以下最适。

优选地，所述沉性颗粒料的直径为3mm。

优选地，所述过筛时所用的筛网规格为40目。

优选地，所述粉碎速度为2000～3000r/min。

优选地，所述基础饲料包括鱼粉45.26％、去皮豆粕23％、面粉18.04％、虾粉4％、鱼用预混料2％、磷脂2％、鱼油2％、水产维生素C三聚磷脂0.2％、磷酸二氢钙1％、多维0.5％、多矿1.5％、核苷酸0.1％、氯化胆碱0.4％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首先提供了马鞭草在促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力或制备石斑鱼饲料中的应用。基于该应用，本发明提供了一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料添加剂，所述添加剂中含有马鞭草粉末。所述添加剂为纯植物成分，具有毒副作用小、价格便宜、不易产生抗药性、无污染、无残留等优点，不含化工原料，降低了因化工原料污染带来的风险，克服了化学药物存在的缺陷。

基于以上饲料添加剂，本发明还提供了一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料，所述饲料能有效提高石斑鱼的抗氧化酶活和免疫相关基因的表达，提高其抗氧化和免疫能力；同时，能够提高石斑鱼的成活率以及消化酶活力，从而有效促进营养素在石斑鱼体内的消化吸收和转化，促进其健康生长。在饲料中添加本发明的饲料添加剂，能够有效地预防石斑鱼尤其是虎龙杂交斑在养殖过程中的病害问题，促进石斑鱼的生长，大幅度提升石斑鱼养殖产业的经济效益，促进产业链的健康发展。

附图说明

图1是HSP90基因在虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量结果。

图2是IGM基因在虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量结果。

图3是TRIF基因在虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量结果。

图4虎龙杂交斑肠道微生物在门水平上菌群结构组成的变化分析结果图。

图5虎龙杂交斑肠道微生物优势菌种分析进化分支图。

图6是虎龙杂交斑肠道微生物优势菌种LDA分析结果图；其中，图中由内至外辐射的不同圆圈层分别代表了由门至属(或种)的分类级别；各个节点代表该水平下的一个物种分类，该物种丰度越高节点越大，黄色节点为无显著差异的物种。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中的马鞭草采购于天地本草公司；基础饲料由中山大学生命科学学院购买提供；供试鱼(虎龙杂交斑幼鱼)为惠州市海燕水产养殖科技有限公司人工培育。

以下实施例中的数据用平均值±标准误(Mean±SE)表示，用SPSSStatistics17.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

实施例1饲料添加剂的制备

取检验合格的中药材马鞭草原料，使用超微粉碎机粉碎(90％达40目)，按比例在V型搅拌机内混合均匀，即可得到马鞭草粉末。

以下实施例中所用的饲料添加剂均为本实施例1制备得到的仅含有马鞭草粉末的饲料添加剂。

实施例2饲料的制备

将马鞭草粉末和基础饲料粉碎，过40目筛，采用逐级扩大法，将马鞭草粉末按照不同添加水平加入基础饲料中，混匀，用挤压机制成直径为3mm的沉性颗粒料，冷冻干燥，即可得到添加不同水平马鞭草粉末的饲料。

添加不同水平马鞭草粉末的饲料分为4组，具体分组如下：

A2组：2％的马鞭草粉末、98％的基础饲料；

A4组：4％的马鞭草粉末、96％的基础饲料；

A6组：6％的马鞭草粉末、94％的基础饲料；

对照组：100％的基础饲料。

基础饲料的组成如表1所示；基础饲料的营养水平如表2所示。

表1基础饲料组成

表2基础饲料的营养水平

然后，选取平均体重为(130±2.0)g，体长为(17.0±0.5)cm的虎龙杂交斑幼鱼，在海燕水产养殖科技有限公司循环水养殖系统中散养，池驯养7d后，选取体格健壮、规格基本一致的个体，随机放入4个直径1.5m的鱼缸中，每缸3个网箱，每网25尾，称初始体重。

将上述虎龙杂交斑幼鱼在水温25℃～28℃、pH 8.2±0.3、溶氧浓度＞7.0mg/L、氨氮浓度＜0.2mg/L的环境下饲养，每天8：00和17：00定时投喂实施例2制备得到的添加不同水平马鞭草粉末的饲料，每次投喂量为体重1％，每次达到表观饱食停止投喂，余料称重回收，每隔两周秤鱼体总重；每周监测水质，光照为自然光源，用增氧机昼夜持续增氧；观察鱼体摄食情况和健康状况，并记录死亡鱼的数目和重量，实验期为8周。实验完成后，对虎龙杂交斑的性能进行测试，具体实验方法和实验结果如下：

实施例3添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑生长性能的测试

1、实验方法

对虎龙杂交斑进行采样(采样前停喂24h)，称取全缸鱼的体重；并从每个网箱随机选取3尾鱼，用1mL的注射器从尾鳍上部侧线鳞下方尾静脉处进行抽血，注入1.5mL的离心管，并静置4h后，3000rmp/min离心10分钟，分离出血清，保存于-20℃冰箱中。抽完血后，用灭菌灭酶的采样工具采集肝胰脏、脾脏、肾脏和鳃放入灭菌灭酶1.5mL离心管中，用液氮速冻2h后，于-80℃冰箱保存；分别采集肝胰脏、肠道(去除肠系膜脂肪)，其中，剪取每尾鱼的肝胰脏，保存于-20℃，用于消化酶活力测定。

测定虎龙杂交斑的生长指标，包括：净增重量(GR)、相对增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和饲料系数(FCR)，计算公式如下：

净增重量(GR，g)＝末均重一初均重；

相对增重率(WGR，％)＝100×(末均重一初均重)/初均重；

特定生长率(SGR，％)＝100×(Ln末均重-Ln初均重)/饲喂天数；

饲料系数(FCR)＝均摄食量/(末均重一初均重)；

存活率(SR，％)＝100×初始鱼尾数/终末鱼尾数。

2、实验结果

添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑生长指标的影响结果如表3所示，可以看出：基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平的马鞭草粉末，虎龙杂交斑的净增重量、相对增重率和特定生长率均显著高于对照组(P＜0.05)，其中，4％添加水平最为显著，促进虎龙杂交斑生长效果最好；基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平的马鞭草粉末，虎龙杂交斑的饲料系数均显著低于对照组，其中，4％添加水平最为显著。另外，对照组虎龙杂交斑的存活率为89.03±1.66b，A2组虎龙杂交斑的存活率为81.39±5.13b，A4组虎龙杂交斑的存活率为84.7±5.32b，A6组虎龙杂交斑的存活率为89.09±3.96a，可以看出，实验组与对照组相比，存活率均无显著差异(P＞0.05)。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末均能促进虎龙杂交斑的生长，4％添加水平的马鞭草粉末促进虎龙杂交斑生长的效果最好，且对成活率无显著影响。

表3添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑生长指标的影响

注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

实施例4添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑血清生化指标的影响

1、实验方法

测定虎龙杂交斑的血清中6个生化指标，分别为：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血糖(Glu)、总蛋白(TP)、球蛋白(GLO)、白蛋白(ALB)。所有血清生化指标由广州达安临床检测中心有限公司进行测定。

2、实验结果

(1)ALT、AST、Glu的测定结果

添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑ALT、AST、Glu的测定结果如表4所示，可以看出，基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平的马鞭草粉末，虎龙杂交斑血清中的ALT和Glu均低于对照组，但无显著差异；虎龙杂交斑血清中的AST均高于对照组，其中，6％添加水平显著高于对照组。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末能降低虎龙杂交斑谷丙转氨酶和血糖的含量，同时升高谷草转氨酶的含量，并随着添加水平增加作用加强。

表4添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑ALT、AST、Glu的测定结果

注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

(2)TP、GLO、ALB的测定结果

添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑TP、GLO、ALB的测定结果如表5所示，可以看出，基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平的马鞭草粉末，虎龙杂交斑血清中的TP、GLO、ALB的含量均高于对照组，在TP的含量方面，6％添加水平显著高于对照组；在GLO的含量方面，4％添加水平、6％添加水平显著高于对照组；在ALB的含量方面，6％添加水平显著高于对照组。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末能升高总蛋白、球蛋白和白蛋白的含量，其中，6％添加水平效果最为显著，并随着添加水平增加效果加强。

表5添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑TP、GLO、ALB的测定结果

注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

实施例5添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑血清抗氧化和免疫能力的影响

1、实验方法

测定虎龙杂交斑的血清中抗氧化和免疫指标：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)，采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

2、实验结果

添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑血清抗氧化和免疫能力的影响结果如表6所示，可以看出，基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平的马鞭草粉末，虎龙杂交斑血清中的SOD、CAT、T-AOC的含量，会随着添加水平的增加出现先升高后降低的趋势；其中，在SOD的含量方面，2％添加水平和4％添加水平高于对照组，但均无显著差异；在CAT的含量方面，4％添加水平和6％添加水平高于对照组，但均无显著差异；在T-AOC的含量方面，4％添加水平和6％添加水平高于对照组，但均无显著差异；在MDA的含量方面，6％添加水平高于对照组，但无显著差异。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末能增强虎龙杂交斑的血清抗氧化和免疫能力，4％添加水平的马鞭草粉末增强血清抗氧化和免疫能力的效果最好。

表6添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑血清抗氧化和免疫能力的影响结果

注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

实施例6添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑肝胰脏抗氧化和免疫能力的影响

1、实验方法

测定虎龙杂交斑的肝胰脏中抗氧化和免疫指标：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)，采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

2、实验结果

添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑血清抗氧化和免疫能力的影响结果如表7所示，饲料中添加一定量的马鞭草能一定程度提高虎龙杂交斑肝胰脏抗氧化能力。从肝胰脏抗氧化指标看，试验组的肝胰脏中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)较对照组均有不同程度的提高，但会随着添加水平的增加出现先上升后下降的趋势，其中，在SOD的含量方面，2％添加水平、4％添加水平和高6％添加水平高于对照组，其中2％添加水平、4％添加水平显著提高；在CAT的含量方面，4％添加水平相对对照组，显著提高；在T-AOC的含量方面，2％添加水平、4％添加水平和6％添加水平高于对照组，均显著提高；在MDA的含量方面，4％添加水平和6％添加水平低于对照组，但无显著差异。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末能增强虎龙杂交斑的血清抗氧化和免疫能力，4％添加水平的马鞭草粉末增强血清抗氧化和免疫能力的效果最好。

表7添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑肝胰脏抗氧化和免疫能力的影响结果

实施例7添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑肝胰脏消化酶活力的影响

1、实验方法

测定虎龙杂交斑肝胰脏的酶活指标：胰蛋白酶(Trypsin)、淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)。

2、实验结果

添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑肝胰脏消化酶活力的影响结果如表8所示，可以看出，在Trypsin的含量方面，随着添加水平的增加出现先升高后降低的趋势，2％添加水平和4％添加水平显著高于对照组；在LPS的含量方面，随着添加水平的增加逐渐升高，4％添加水平和6％添加水平显著高于对照组；在AMS的含量方面，与对照组均无显著差异。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末能增强虎龙杂交斑肝胰脏中的胰蛋白酶和脂肪酶活力，其中，4％添加水平的马鞭草粉末增强虎龙杂交斑的胰蛋白酶和脂肪酶活力的效果最好，而对淀粉酶不产生影响，活性稳定。

表8添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑肝胰脏消化酶活力的影响结果

注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

实施例8添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑免疫相关基因表达的影响

1、实验方法

采集虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官，并检测热休克蛋白90(HSP90)基因、β干扰素的TIR结构域衔接蛋白(TIRF)基因和免疫球蛋白(IGM)基因3个免疫相关基因在其中的表达量。

(1)RNA提取

脑、鳃、脾、肾四个器官各组织的总RNA采用Magen公司的《Hipure Universal RNAKits》试剂盒进行提取，在微型核酸测定仪上测定RNA浓度，测定前，先用1μL的DEPC水清洗测定探头，然后用干净的滤纸吸干，再点1μL的RNA样品，测定OD值和RNA浓度；

(2)cDNA的合成

RNA提取后，cDNA的合成采用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(本试剂盒包含去除基因组中残留DNA步骤)进行；

(3)荧光定量PCR(qPCR)引物的设计

根据GenBank中已公布的虎龙杂交斑HSP90基因、TIRF基因、IGM基因的cDNA序列，应用Primer Premier 5.0软件进行荧光定量引物设计，并在NCBI/Primer-BLAST上进行比对，设计特异性引物，qPCR引物及其序列如表9所示；

表9 qPCR引物及其序列

(4)qPCR反应

荧光定量PCR是在Mx3005P荧光定量仪上完成的，每个样品做3个复孔。荧光定量PCR实验采用北京全式金生物技术有限公司的TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒进行。

qPCR反应体系：SYBR Green I Master：5μL；Forward primer：0.5μL；Reverseprimer：0.5μL；cDNA：0.5μL；ddH2O：3.5μL。

qPCR反应程序：95℃预变性10min；40个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s)。使用β-actin做为内参。扩增完成后荧光值转变成Ct值。根据标准曲线的Ct值，采用2^-ΔΔCt来算出样品的相对表达量。

2、实验结果

(1)添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑HSP90基因表达的影响

HSP90基因在虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量结果如图1所示，可以看出，基础饲料中添加6％添加水平(A6组)马鞭草粉末，HSP90基因在脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量均显著高于对照组，且HSP90基因在脑中的表达量最高，在鳃中的表达量最低。

其中，在脑组织中，对HSP90基因表达的影响随着添加水平增加逐渐加强，A2组相较于对照组略低，但差异不显著，A4、A6组均较对照组显著提高；在鳃组织中，HSP90基因表达量相对较少，A2组相较于对照组略低，但差异不显著，A4、A6组均较对照组显著提高，且A4、A6组的组间差异不显著；在脾脏组织中，A4组相较于对照组略高，但差异不显著，A2、A6组均较对照组显著提高；在肾脏组织中，A2组相较于对照组略低，但差异不显著，A4组相较于对照组略高，但差异不显著，A6组均相较于对照组显著提高，且各实验组的组间差异显著；因此，马鞭草粉末能一定程度提高鞍带石斑鱼的脑、鳃、脾、肾中的HSP90基因的表达。

(2)添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑IGM基因表达的影响

IGM基因在虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量结果如图2所示，可以看出，基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平(A2、A4、A6组)马鞭草粉末，IGM基因在脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量均显著高于对照组，且IGM基因在鳃中的表达量最高，在肾中的表达量最低。

其中，在脑组织中，A2组相较于对照组IGM基因表达量显著提高，A4、A6组相较于对照组略高，但差异不显著；在鳃组织中，A2、A4、A6组相较于对照组IGM基因表达量均显著提高；在脾脏组织中，A4组相较于对照组IGM基因表达量显著提高，A2、A6组相较于对照组略高，但差异不显著；在肾脏组织中，A2、A4、A6组相较于对照组IGM基因表达量均显著提高；因此，马鞭草粉末能一定程度提高鞍带石斑鱼的脑、鳃、脾、肾中的IGM基因的表达。

(3)添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑TRIF基因表达的影响

TRIF基因在虎龙杂交斑的脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量结果如图3所示，可以看出，基础饲料中添加4％添加水平(A4组)马鞭草粉末，TRIF基因在脑、鳃、脾、肾四个器官中的表达量均显著高于对照组，TRIF基因在鳃中的表达量最高，在肾中的表达量最低。

其中，在脑组织中，A6组相较于对照组TRIF基因表达量显著提高，A4组相较于对照组略高，但差异不显著，而A2组相较于对照组略低，但差异不显著；在鳃组织中，A2、A4、A6组相较于对照组TRIF基因表达量均显著提高；在脾脏组织中，A4组相较于对照组TRIF基因表达量显著提高，A2、A6组相较于对照组TRIF基因表达量均显著降低；在肾脏组织中，A2、A4、A6组相较于对照组TRIF基因表达量均显著提高；因此，马鞭草粉末能一定程度提高鞍带石斑鱼的脑、鳃、脾、肾中的TRIF基因的表达。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

实施例9添加不同水平马鞭草粉末的饲料对虎龙杂交斑肠道微生物的影响

(1)虎龙杂交斑肠道微生物菌群多样性分析

1、实验方法

提取虎龙杂交斑肠道微生物基因组DNA，将每组中3个重复的提取产物混为一个样品，按指定测序区域，合成特异引物进行PCR扩增，利用uminamiSeq平台进行16S rDNA基因V3-V4区高通量测序，肠道菌群生物信息学分析测序得到的原始数据经质控和过滤后，得到高质量的优化数据；然后，对优化数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，用Searc对所有样品的优化序列聚类，默认以97％的相似水平将序列聚类OTUSRDPClassifierl叶斯算法与Greengene进行物种注释分析，再用OTUs进行丰度、多样性指数等分析，用Ace和Chao指数来度量样品菌群丰度，Shannon和Simpson指数来度量菌群多样性。

2、实验结果

虎龙杂交斑肠道微生物菌群多样性分析结果如表10所示，可以看出，对MiSeq测序原始数据处理后，10组样品共产生894770条优化序列，各组样品菌群测序覆盖率在94％～96％，样本微生物群落的检测比率接近饱和，表明该测序结果可以反映虎龙杂交斑的肠道微生物的真实情况。

对操作分类单元(OTU)序列数据结果进行分析，结果显示：这些分类单元主要属于38个细菌门，103个纲，202个目，359个科和826个属，另外，还有一些OUT在分类上属于未鉴定(unclassified)序列；各实验组(B2、B4、B6组)的Shannon指数均一定程度高于对照组，表明基础饲料中添加2％、4％、6％添加水平(B2、B4、B6组)马鞭草粉末，能一定程度提高虎龙杂交斑肠道微生物的菌群多样性，并随着马鞭草粉末添加水平增加，菌群多样性也随之增高；另外，B6组chao指数低于对照组，B2、B4组的chao指数均高于对照组。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末，能一定程度提高虎龙杂交斑肠道微生物的菌群丰度。

表10虎龙杂交斑肠道微生物菌群多样性分析结果

(2)虎龙杂交斑肠道微生物菌群结构组成的变化分析

1、实验方法

将每个OTU中丰度最高的序列作为代表序列，进行物种注释分析，对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析(将相对丰度小于1％部分合并为others)。

2、实验结果

虎龙杂交斑肠道微生物在门(Phylum)水平上菌群结构组成的变化分析结果如图4所示，虎龙杂交斑肠道微生物前10个优势细菌门类及其相对丰度如表11所示，从图4和表9数据可以看出，马鞭草粉末的添加使得菌群优势门丰度发生了明显改变；对照组肠道主要菌群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetae)和蓝细菌门(Cyanobacteria)，而实验组(B2、B4、B6组)中肠道主要菌群与对照组相似，但随着马鞭草粉末水平增加，变形菌门的比重逐渐降低，拟杄菌门、厚壁菌门和梭杆菌门的比重逐渐升高。

表11虎龙杂交斑肠道微生物前10个优势细菌门类及其相对丰度

(3)虎龙杂交斑肠道微生物优势菌种分析

1、实验方法

从样本聚类和物种聚类两个层面对属水平上丰度排名前20的物种进行分析。优势菌种分析(Lefse)是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件，采用线性判别分析(LDA)来估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，LDA分析主要是想找到组间在丰度上有显著差异的物种，即生物标记物(biomarkers)。

2、实验结果

虎龙杂交斑肠道微生物优势菌种分析进化分支图如图5所示，虎龙杂交斑肠道微生物优势菌种LDA分析结果图如图6所示，从图5和图6的结果可以看出，相较于对照组，各实验组(B2、B4、B6组)具有显著差异的物种数量较多，表明基础饲料中添加马鞭草粉末，能一定程度改变优势菌种的物种丰度，显著差异的物种丰度增加明显。

以上结果表明：基础饲料中添加马鞭草粉末，能较大程度改变优势菌种的物种丰度和结构。

Claims (10)

1.马鞭草在促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力或制备石斑鱼饲料中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述石斑鱼为虎龙杂交斑、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、云纹石斑鱼、宝石石斑鱼、七带石斑鱼、鳃棘鲈或驼背鲈中的任意一种或几种。

3.一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中含有马鞭草粉末。

4.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，所述马鞭草粉末的制备方法为：将马鞭草原料粉碎，混合均匀，即可得到所述马鞭草粉末。

5.一种促进石斑鱼生长、提高抗氧化和免疫能力的饲料，其特征在于，所述饲料含有马鞭草粉末。

6.根据权利要求5所述的饲料，其特征在于，以质量百分比计，所述饲料包括：2％～6％的马鞭草粉末、94％～98％的基础饲料。

7.根据权利要求6所述的饲料，其特征在于，以质量百分比计，所述饲料包括：4％的马鞭草粉末、96％的基础饲料。

8.根据权利要求6所述的饲料，其特征在于，以质量百分比计，所述饲料包括2％的马鞭草粉末、98％的基础饲料。

9.根据权利要求6所述的饲料，其特征在于，以质量百分比计，所述饲料包括6％的马鞭草粉末、94％的基础饲料。

10.根据权利要求4～9任一所述的饲料，其特征在于，所述饲料的制备方法为：将饲料添加剂和基础饲料经粉碎、过筛、混匀，制成直径为0.5～10mm的沉性颗粒料，冷冻干燥，即可得到所述饲料。