CN116724886A - 颜色标记扩繁玉米细胞核雄性不育系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于获得植物的方法领域，具体公开了颜色标记扩繁玉米细胞核雄性不育系的方法。本发明所要解决的技术问题是如何改良细胞核雄性不育系统和/或如何获得高纯度的雄性不育后代。本发明的方法包括用含有恢复基因和筛选基因的保持系B的雄性配子与包含纯合的隐性雄性不育基因的不育系A的雌性配子受精，依据筛选基因的外在性状将所得种子区分为所述不育系A的种子以及所述保持系B的种子。本发明可用于扩繁雄性不育系及相应保持系植物。
Description
技术领域
本发明涉及获得植物的方法领域，具体涉及颜色标记扩繁玉米细胞核雄性不育系的方法。
背景技术
杂种优势使得杂交种的生物量、抗病虫能力、耐胁迫（干旱、高温、低温、盐碱等）能力较其双亲有相当的提升。例如，杂交玉米、杂交水稻的产量远远高于其纯合的双亲。生产杂交种通常采用的方法为：将雌性亲本和雄性亲本种在一起；并将雌性亲本的雄穗去除，保留雄性亲本的雄穗；从雌性亲本收获种子，即为杂交种。
自然界中的植物存在自花授粉、异花授粉及常异花授粉三种类型。自花授粉是指一株植物的花粉，对自身的雌蕊进行授粉的现象。在两性花的植物中，又可分为同花授粉（例如，菜豆属）、邻花授粉和同株异花授粉。同花授粉为同一花的雄蕊与雌蕊之间进行授粉。邻花授粉为在一个花序（个体）中不同花之间进行授粉。同株异花授粉为同株不同花之间进行授粉。有些植物雄蕊和雌蕊不长在同一朵花里，有些甚至不长在同一棵植株上，无法自花授粉，它们的雌蕊只能得到其它花的花粉，这叫做异花授粉。将天然杂交率高于50%且自交衰退的一类作物归为常异花授粉作物。
玉米为雌雄同株，并且雌花和雄花位于植株的不同部位。玉米既可通过自花授粉也可通过异花授粉繁衍后代。在自然条件下，当风将花粉从雄穗吹到雌穗的花丝上时即完成了天然授粉。在玉米育种中，通常先开发出纯合的玉米自交系，然后将两个自交系进行杂交，对杂交的后代的产量、抗逆性等进行评估，以确定其是否具有商业化潜力。其中，每个自交系都可能具有另一个自交系所缺乏的一种或多种优良性状，或补充另一个自交系的一种或多种不良性状。两个自交系杂交的第一代种子为F1代种子，F1代的种子发芽后获得F1代植株，F1代植株较两个自交系亲本（父母本）更健壮，同时拥有更多的生物量。
可以通过对母本人工去雄来生产杂交种（F1），即将未散粉的母本（其可与父本在田间间隔播种，如播种5行母本，一行父本）雄穗去除，保留父本雄穗。随后，只要对外来玉米花粉进行隔离，母本雌穗就只能接受父本的花粉，得到的种子即为杂交种（F1），该杂交种即可用于农业生产。然而，在生产杂交种的实际过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或者去雄不完全。以上两种情况均能导致母本自交授粉，致使生产的杂交种中混杂了母本自交系的种子。而母本自交系的产量远低于杂交种的产量，这样的种子为不合格产品，既会影响农民收入又会影响制种公司信誉，甚至导致制种公司承担相应的赔偿责任。也可以采用机器对母本进行去雄。机器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但速度更快并且成本更低。然而，较之手工去雄，大多数去雄机器会对植株造成更大的破坏。此外，机械去雄对地块的平整度、母本的株型也有一定要求。因此，目前没有令人满意的去雄手段。人们仍在寻找成本更低、去雄更彻底的替换方法。
稳定的雄性不育系统提供了简单、高效的去雄手段。通过使用雄性不育系统，在一些情况下可以避免繁重的去雄工作。该手段包括三个主要材料，即（1）雄性不育系（也简称为不育系）：其为雄性不育材料；（2）雄性不育保持系（也简称为保持系）：其可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系；（3）雄性不育恢复系（也简称为恢复系）：其可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生F1，即为用于农业生产的杂交种。
植物的雄性不育可分为三种类型：细胞质雄性不育，细胞核雄性不育，以及核-质互作雄性不育。细胞质雄性不育植株表现为细胞质遗传，通常以单一的细胞质基因S和N分别代表雄性不育和雄性可育，其难以在农业生产上应用。细胞核雄性不育植株表现为细胞核遗传；在多数情况下，雄性不育性为一对隐性基因（msms）所控制，正常可育性为相对的显性基因（MsMs）或（Msms）所控制。核-质互作雄性不育（CMS）植株表现为核-质互作遗传。简言之，仅当细胞质具有不育基因S，且细胞核里有纯合的不育基因（rfrf）时，植株才表现为雄性不育。如果胞质含有可育基因N，则不论细胞核里的基因是可育基因（RfRf）还是不育基因（rfrf），植株都表现为雄性可育。同样，如果核里具有可育基因（RfRf）或（Rfrf），则不论胞质中的基因是可育基因N还是不育基因S，植株都表现为雄性可育。
已报道使用核-质互作雄性不育（CMS）材料来进行育种。在此类方法中，雄性不育系的遗传组成为S（rfrf），其不能产生正常的花粉，但可作为杂交母本。保持系的遗传组成为N（rfrf），其与所述雄性不育系杂交后所产生的F1仍能保持雄性不育，即：S（rfrf）（作为母本）×N（rfrf）→S（rfrf）（雄性不育）。恢复系的遗传组成为S（RfRf）或N（RfRf），其与所述雄性不育系杂交后所产生的F1恢复为雄性可育，即：S（rfrf）（作为母本）×S（RfRf）→S（Rfrf）（F1）（可育），或S（rfrf）（作为母本）×N（RfRf）→S（Rfrf）（F1）（可育）。得到的F1植株自交产生F2，F2在农业生产上也可以广泛应用。雄性不育系可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、蓖麻、甜菜和油菜等作物已经利用核质互作雄性不育系进行杂交种子的生产。其他作物的核-质互作雄性不育系也正在进行广泛的研究。然而，CMS系统也有它的缺陷：一是观察到个别CMS材料容易感病，二是恢复系比较难寻找。这些问题阻碍了CMS系统在制种中的广泛应用。
对于细胞核雄性不育系统而言，在多数情况下，控制雄性不育的核基因为隐性基因，其仅在纯合（msms）时，植株才会表现为雄性不育。但由于雄性不育植株无法自交，因此，只能通过用杂合植株(Msms)与其杂交，才能得到雄性不育后代植株(msms)。然而，杂合植株(Msms)与雄性不育植株(msms)的后代果穗上，雄性不育种子(msms)与可育的杂合种子(Msms)同时存在，并且，无法分辨哪些是不育的，哪些是可育的；只能在播种后，植株散粉时才可分辨。这限制了细胞核雄性不育系统在制种中的广泛应用。由于细胞核雄性不育系对农艺性状影响小、恢复系基因型不受限制等优点，人们一直尝试去应用细胞核雄性不育系，利用细胞核雄性不育系需要在散粉前有效区分不育个体和可育个体。
近年来，已报道利用转基因的手段来保持雄性不育植株不育性的方法（US6743968）。该方法包括：首先构建一个转基因载体，该载体含有一个花粉细胞致死基因，以及一个恢复植株育性的显性基因；然后，将该载体转入雄性不育植株中，并且该载体在转基因植株中以杂合状态存在。由于恢复育性基因的存在，该转基因植株是雄性可育的。并且，当其与雄性不育植株杂交时，由于含有育性恢复基因的花粉（Msms）同时含有致死基因，因此，含有育性恢复基因的花粉都会败育。因此，该转基因植株只能产生不含恢复基因的花粉（ms），与雄性不育植株雌配子（ms）进行杂交。所产生的后代均为隐性纯合个体(msms)。也即，当这样的植株与雄性不育植株杂交时，其后代都保持了隐性不育植株的纯合隐性状态。然而，上述方法的缺陷是，因异雄核受精现象（胚和胚乳由不同的雄配子体发育形成的精子受精形成，即形成胚和胚乳的精子基因型不同）的存在，对胚乳进行筛选后得到的后代种子中仍然存在着一定比例的可育种子，并且这些可育种子难以与不育种子区分开，不能完全满足实际生产的需要。
此外，中国专利ZL201210406155.6报道利用同时含有Ms45和mn1 RNAi的载体来构建雄性不育保持系和保持雄性不育植株不育性的方法，中国专利201910496386.2报道利用同时含有Ms45和Lc或Oy1或Wi2等形态标记法扩繁植物核雄性不育系。然而，由于异雄核受精等原因，通过对胚乳表型进行筛选获得的种子中，胚乳中不含转基因成分，胚中却含有转基因成分，使得这些植株可育，并且这些可育种子难以与不育种子区分开，只能等到植株散粉时才能确定，但散粉时再去除可育的植株将会对繁殖的杂交种纯度产生影响，不能完全满足实际生产的需要。因此，有必要建立一种播种后、散粉前确定不育株和可育株的方法，以便及时去除混杂的可育单株。而形态标记法的3个基因Lc或Oy1或Wi2，均为玉米內源基因，其在不同遗传背景下表现差异较大，种子及后期田间不容易辨别。
因此，如何改良细胞核雄性不育系统以方便地保持雄性不育系植株的不育性，以及如何获得高纯度的雄性不育后代是育种上急需解决的问题。本领域仍然需要开发更高效的繁育雄性不育系植株的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何改良细胞核雄性不育系统以方便地保持雄性不育系植株的不育性，和/或如何获得高纯度的雄性不育后代，进而更高效地繁育雄性不育系植株。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、植物学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“外在性状”是指，个体（包括种子和植株）所表现出来的可遗传的、能观察到的表型特征，其通常由一对或多对等位基因控制。种子和植株的“外在性状”主要包括根、茎、叶、花、果实、种子的外部形态特征，例如种子颜色，种子尺寸，植株颜色，茎形态，叶形态等。通常，种子的外在性状主要是指种子的外部形态特征，包括例如，种子颜色或种子尺寸。植株的外在性状主要是指根、茎、叶、花、果实的外部形态特征，包括例如植株颜色。
如本文中所使用的，术语“雄性不育”是指植物的雄性细胞或组织丧失生理机能的现象。通常，在有性繁殖的植物中（例如，玉米），雄性不育表现为雄性组织（例如，雄蕊）发育不正常，不能产生有正常功能的花粉，但雌性组织（例如，雌蕊）发育正常，能接受正常花粉而受精结实。如本文中所使用的，术语“雄性不育基因”是指能够控制植物雄性不育性状的基因。在本申请中，优选地，雄性不育基因是细胞核雄性不育基因。在多数情况下，控制雄性不育的核基因为隐性基因，其仅在纯合（ms/ms）时，植株才会表现为雄性不育。
如本文中所使用的，术语“恢复基因”是指，能够恢复因雄性不育基因导致雄性不育的植物的雄性能育性的基因。当将该恢复基因导入雄性不育系植株时，所述植株将恢复雄性能育性。在本申请中，当雄性不育基因是隐性基因时，所述恢复基因可以是所述隐性基因的显性等位基因。
目前已报道了多种能够导致植物雄性不育的隐性基因以及其对应的能够恢复植物雄性能育性的显性等位基因。例如，已经在玉米中鉴定了多种隐性雄性不育基因以及其对应的显性等位恢复基因，包括但不限于图4中所示的那些（Skibbe et al.2005）。
如本文中所使用的，术语“调控种子颜色的筛选基因”是指，能够通过影响色素、甜菜红素等的合成而影响种子颜色的基因。此类基因包括例如，RUBY基因（He等人，2020，Hortic. Res. 7, 152）。RUBY基因是一种与甜菜红素合成相关的调节基因，它在多种植物（例如，玉米、水稻、番茄）中的异源表达可以影响甜菜红素合成，增加甜菜红素的含量，并影响种子的颜色。该基因的表达能够使玉米等植物种子表现为紫色。另外，还已发现，RUBY基因能够影响植株的颜色。该基因的表达能够使玉米植株表现为紫色。因此，RUBY基因也是“调控植株颜色的筛选基因”。
如本文中所使用的，术语“组织优选的启动子”是指，可优先地在某些植物组织（例如，雄蕊、花粉囊、花丝和花粉）中起始转录的启动子。如本文中所使用的，术语“生长期优选的启动子”是指，可优先地在某些生长发育阶段（例如，造孢组织、小孢子和小配子体）中起始转录的启动子。如本文中所使用的，术语“组织特异性启动子”是指，仅在某些植物组织中特异性起始转录的启动子。
如本文中所使用的，术语“选择标记基因”是指，其编码产物能够使转化或转染的宿主细胞在选择压力下正常生长或表现出其他可视特征的基因。此类选择压力包括但不限于，选择剂（例如，抗生素或除草剂）的添加或营养的缺乏。如本文中所使用的，术语“抗生素抗性基因”是指，其编码产物能够使转化或转染的宿主细胞在抗生素的选择压力下正常生长或表现出其他可视特征的基因。如本文中所使用的，术语“除草剂抗性基因”是指，其编码产物能够使转化或转染的宿主细胞在除草剂的选择压力下正常生长或表现出其他可视特征的基因。
如本文中所使用的，术语“异雄核受精”是指，在双受精过程中，同一个种子的胚和胚乳由2个不同的雄配子体形成的精子受精而形成的现象。在这种情况下，同一个种子的胚和胚乳可具有不同的基因型。
在本申请中，植株可为植株的全部或部分，如根、茎、叶、胚、根尖、花粉或花药等。
本申请的发明人通过精心设计和大量实验，获得了生产一种能够保持雄性不育系植株的不育性的保持系植株的方法，所述保持系植株在与雄性不育系植株杂交时，能够同时获得可区分的不育系和保持系后代，显著提升了不育系植株的扩繁效率和育种效率。此外，在本申请的某些优选实施方案中，所述保持系植株含有双重的筛选基因，并且，在将所述保持系植株与雄性不育系植株杂交后，通过双重筛选法可以更准确地区分不育系和保持系后代，进一步提高育种效率。由此，本申请的发明人完成了本发明。
因此，在本申请的第一方面，提供了颜色标记扩繁玉米细胞核雄性不育系的方法，包括如下步骤：
a）提供保持系B，所述保持系B是包含与不育系A中相同的纯合的隐性雄性不育基因，并且含有以杂合状态存在的核酸分子的自交系；所述核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸；所述第一多核苷酸包含恢复基因，所述恢复基因能够恢复因所述隐性雄性不育基因导致的雄性不育的植物的雄性能育性；所述第二多核苷酸包含能够调控种子和/或植株的外在性状的筛选基因，所述外在性状包含种子颜色和/或植株颜色；所述不育系A为包含纯合的隐性雄性不育基因的不育系；
b）用所述保持系B的雄性配子与所述不育系A的雌性配子受精，依据所述筛选基因的外在性状将所得种子区分为所述不育系A的种子以及所述保持系B的种子，完成雄性不育系及相应保持系的扩繁。
上述扩繁方法中，所述不育系为植物不育系，所述保持系为植物保持系。
上述扩繁方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物可为玉米（Zeamays）、油菜（Brassica napus）、稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大麦（Hordeumvulgare）、小麦（Triticumaestivum）、高粱（Sorghum bicolor）、大豆（Glycinemax）、苜蓿（Medicago sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）、棉花（Gossypiumhirsutum）、向日葵（Helianthus annuus）或甘蔗（Saccharum officinarum）。本发明的实施方案中，所述植物为玉米（Zea mays）。
上述扩繁方法中，所述隐性雄性不育基因在纯合状态下导致植物雄性不育。所述隐性雄性不育基因选自ms1，ms2，ms3，ms4，ms5，ms6，ms7，ms8，ms9，ms10，ms11，ms12，ms13，ms14，ms15，ms16，ms17，ms18，ms19，ms20，ms21，ms22，ms23，ms24，ms25，ms26，ms27，ms28，ms29，ms30，ms31，ms32，ms33，ms34，ms35，ms36，ms37，ms38，ms43，ms45，ms47，ms48，ms49，ms50和ms52中的至少一种。本发明的实施方案中，所述雄性不育基因为ms45。
上述扩繁方法中，所述恢复基因能够恢复因隐性雄性不育基因导致雄性不育的植物的雄性能育性。所述恢复基因选自Ms1，Ms2，Ms3，Ms4，Ms5，Ms6，Ms7，Ms8，Ms9，Ms10，Ms11，Ms12，Ms13，Ms14，Ms15，Ms16，Ms17，Ms18，Ms19，Ms20，Ms21，Ms22，Ms23，Ms24，Ms25，Ms26，Ms27，Ms28，Ms29，Ms30，Ms31，Ms32，Ms33，Ms34，Ms35，Ms36，Ms37，Ms38，Ms43，Ms45，Ms47，Ms48，Ms49，Ms50和Ms52中的至少一种。本发明的实施方案中，所述恢复基因为Ms45。
易于理解，在本申请的核酸分子中，所述恢复基因与所述雄性不育基因应当是相对应的，从而，其能够挽救所述隐性雄性不育基因导致的不育性状。本发明的实施方案中，所述隐性雄性不育基因为ms45，对应的，所述恢复基因为Ms45。
具体的，所述恢复基因Ms45编码Ms45蛋白，所述Ms45蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：
A1、氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2、将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3、在A1或A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述扩繁方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
上述扩繁方法中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85%、90%、91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。
上述扩繁方法中，所述恢复基因Ms45具体可为编码链的编码序列是的核苷酸序列为SEQ ID No.1的核酸分子。
上述扩繁方法中，所述第一多核苷酸还包含与所述恢复基因的核苷酸序列可操作连接的表达调控元件，例如启动子和增强子。在某些实施方案中，所述表达调控元件选自：启动子，增强子，调控序列，可诱导元件，及其任何组合。上述核酸分子中，所述启动子选自：组成型启动子，诱导型启动子，组织优选的启动子，组织特异性启动子，生长期优选的启动子。可用于本申请的启动子并不局限于上述所列举的启动子。易于理解，在上述核酸分子中，可以根据实际需要，使用本领域技术人员已知的任何一种启动子。
上述扩繁方法中，所述第一多核苷酸序列包含或者由SEQ ID No.3组成。
在本申请中，在某些情况下，两个或更多个外在性状的同时使用是优选和有利的。例如，在某些实施方案中，可以将调控种子的外在性状（例如种子颜色和/或种子尺寸）的筛选基因和调控植株的外在性状（例如植株颜色）的筛选基因联合使用，由此，可以利用种子的外在性状与植株的外在性状来对杂交后代进行筛选，从而确保杂交后代的纯度。
上述扩繁方法中，所述第二多核苷酸可包括：能够调控种子的外在性状（例如种子颜色或种子尺寸）的第一筛选基因，以及能够调控植株的外在性状（例如植株颜色）的第二筛选基因。
上述扩繁方法中，所述第一筛选基因和第二筛选基因可为相同的。在此类实施方案中，所述第二多核苷酸含有能够控制种子的外在性状与植株的外在性状的一种筛选基因。例如，在本发明的实施方案中，所述筛选基因为RUBY基因，其能够控制种子的颜色和植株的颜色。
上述扩繁方法中，所述第一筛选基因和第二筛选基因也可为不同的。
所述RUBY基因编码RUBY蛋白，所述RUBY是如下C1、C2或C3的蛋白质：
C1、氨基酸序列是SEQ ID No.5所示的氨基酸序列的蛋白质；
C2、将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3、在C1或C2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述扩繁方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
上述扩繁方法中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85%、90%、91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。
上述扩繁方法中，所述RUBY基因具体可为编码链的编码序列是的核苷酸序列为SEQ ID No.4的核酸分子。
上述扩繁方法中，所述第二多核苷酸还包含与所述筛选基因的核苷酸序列可操作连接的表达调控元件，例如启动子和增强子。在某些实施方案中，所述表达调控元件选自：启动子，增强子，调控序列，可诱导元件，及其任何组合。在某些实施方案中，所述启动子选自：组成型启动子，诱导型启动子，组织优选的启动子，组织特异性启动子，生长期优选的启动子。可用于本申请的启动子并不局限于上述所列举的启动子。易于理解，在本申请的实施方案中，可以根据实际需要，使用本领域技术人员已知的任何一种启动子。
上述扩繁方法中，所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列是基因连锁的。例如，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸共价相连。所述共价相连可通过或者不通过连接核苷酸。所述连接核苷酸的长度不超过10kb，不超过5kb，不超过1kb，不超过500bp，不超过100bp，不超过50bp，不超过10bp，不超过5bp，或者更短。
在本申请的第二方面，提供了保持系的构建方法，所述方法包括将上文所述的核酸分子导入包含纯合的隐性雄性不育基因的不育系，得到所述核酸分子以杂合状态存在且所述隐性雄性不育基因纯合的保持系，该保持系即为用于上述扩繁方法的保持系B。
在本申请的第三方面，提供了分离的核酸分子，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸；所述第一多核苷酸包含恢复基因，所述恢复基因能够恢复因隐性雄性不育基因导致雄性不育的植物的雄性能育性（雄性育性）；所述第二多核苷酸包含能够调控种子和/或植株的外在性状的筛选基因，所述外在性状包含种子颜色和/或植株颜色。
在本申请的第四方面，提供了与上述的核酸分子相关的生物材料，为下述B1）至B8）中的任一种：
B1）含有所述核酸分子的表达盒；
B2）含有所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B3）含有所述核酸分子的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2）所述重组载体的重组微生物；
B4）含有所述的核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系；
B5）含有所述的核酸分子的转基因植物组织、或含有B1）所述表达盒的转基因植物组织；
B6）含有所述的核酸分子的转基因植物器官、或含有B1）所述表达盒的转基因植物器官。
可用现有的植物表达载体构建B2）所述的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pCAMBAI3301、pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的双丙氨磷抗性基因（bar基因），赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因、新霉素抗性基因（例如编码新霉素磷酸转移酶的基因）、潮霉素抗性基因（例如编码潮霉素磷酸转移酶的基因）、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、磺酰胺抗性基因、溴苯腈抗性基因、草甘膦抗性基因和草胺膦抗性基因。本发明的实施方案中，所述选择标记基因为除草剂抗性基因，具体所述除草剂抗性基因为bar基因。所述bar基因的核苷酸序列为SEQ ID No.6。所述载体能够在植物细胞（例如，玉米）中表达如上所述的核酸分子。
上述生物材料中，B3）所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
上述生物材料中，B4）所述植物细胞系为单子叶植物或双子叶植物的细胞系。
上述生物材料中，B4）所述植物细胞系为选自下列的植物的细胞系：玉米（Zeamays）、油菜（Brassica napus）、稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大麦（Hordeumvulgare）、小麦（Triticumaestivum）、高粱（Sorghum bicolor）、大豆（Glycinemax）、苜蓿（Medicago sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）、棉花（Gossypiumhirsutum）、向日葵（Helianthus annuus）或甘蔗（Saccharum officinarum）。
在本申请的第五方面，提供了上述扩繁方法、和/或上述构建方法、和/或上述核酸分子、和/或上述生物材料在植物杂交制种中的应用。
有益效果：
本申请提供了一种雄性不育系及相应保持系的扩繁方法及其所用核酸分子。本申请所提供的保持系植株在与雄性不育植株杂交后，能够同时收获并且有效区分雄性不育植株和保持系植株的后代。由此，本申请的所提供的方法和保持系植株能够实现雄性不育植株的高效扩繁，提高了育种效率。此外，通过种子的外在性状与植株的外在性状的联合使用，本申请的所提供的方法能够对杂交后代进行两次或更多次的筛选，这进一步提高了雄性不育系植株后代和保持系植株后代各自的纯度，提高了育种效率和所产生的杂交种子的质量和纯度。
在以往的技术中，仅对种子或仅对植株进行标记、筛选，然而，这些方法具备以下不足：（1）仅对种子进行筛选，由于异雄核受精等原因，通过对胚乳表型进行筛选获得的部分种子中，胚乳中不含转基因成分，胚中却含有转基因成分，这些种子发育成的植株是可育的，并且这些可育种子难以与不育种子区分开，只能等到植株散粉时才能确定，但散粉时再去除可育的植株将会对繁殖的杂交种纯度产生影响，不能完全满足实际生产的需要；（2）仅对植株进行筛选，则无法在种植时将不育种子与可育种子区分开，耗费大量人力物力。而本申请的方法结合种子和植株的标记和筛选，并且能够在植株播种后、散粉前（例如苗期）确定不育株和可育株，及时去除混杂的可育株，显著提高了育种效率和所产生的杂交种子的质量和纯度。
附图说明
图1为本发明实施例1中不含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交后代籽粒（标为1，籽粒颜色为黄色）以及含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交后代籽粒（标为2，籽粒颜色为紫色）。
图2为本发明实施例1中不含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交后代幼苗（标为1，其为绿色）以及含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交后代幼苗（标为2，其为紫色）。
图3为本发明实施例1中为以保持系植株郑58B作为父本与郑58A杂交产生的果穗，其中，1为雄性不育系籽粒郑58A（ms45/ms45），2为保持系籽粒郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45/ms45）。
图4为玉米中的隐性雄性不育基因以及其对应的显性等位恢复基因。
图5为本发明实施例中所用的培养基配方。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米品种B73来自中国农业大学国家玉米改良中心。公众可从申请人处获得以重复本实验。
玉米品种HiIIA和HiIIB均记载于如下文献中：“Armstrong C L, Green C E andPhillips R L. Development and availability of germplasm with high Type IIculture formation response. Maize Genetics Cooperation News Letter, 1991, 65:92-93”。公众可从申请人四川天能璟秀生物科技有限公司处获得，以重复本实验。
玉米ms45雄性不育材料905I为玉米遗传合作股份中心（Maize GeneticsCooperation Stock Center）产品。
本发明能够导致植物雄性不育的隐性基因以及其对应的能够恢复植物雄性育性的显性等位基因可为任何已报道的具体相应功能的基因，具体可选自图4。本实施例具体选用的为雄性不育隐性基因ms45及其对应的雄性不育恢复基因Ms45。
下述实施例中所用的培养基配方如图5所示。图5中，MS盐购自phyto TechnologyLaboratories公司，货号为M524。
实施例1
1、载体的构建
1.1、雄性不育恢复基因Ms45的扩增
雄性不育恢复基因Ms45来源于玉米品种B73，其编码序列如SEQ ID No.1所示，其编码的Ms45蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1如下：
ATGGAGAAGAGGAACCTGCAGTGGCGGCGAGGGCGTGATGGCATCGTGCAGTACCCTCACCTCTTCTTCGCGGCCCTGGCGCTGGCCCTCCTAGTCGCGGACCCGTTCGGCCTCAGTCCGCTGGCCGAGGTCGACTACCGGCCGGTGAAGCACGAGCTCGCGCCGTACGGGGAGGTCATGGGCAGCTGGCCCAGAGACAATGCCAGCCGGCTCAGGCGCGGGAGGCTGGAGTTCGTCGGCGAGGTGTTCGGGCCGGAGTCTATCGAGTTCGATCTCCAGGGCCGCGGGCCGTACGCCGGCCTCGCCGACGGCCGCGTCGTGCGGTGGATGGGCGAGGAGGCCGGGTGGGAGACGTTCGCCGTCATGAATCCTGACTGGTCAGAAGAAGTCTGTGCCAATGGAGTGAACTCAACGACGAGGAAGCAGCACGAGAAGGAGGAGTTCTGCGGCCGGCCGCTCGGCCTGAGGTTCCACGGGGAGACCGGCGAGCTCTACGTCGCCGACGCGTACTACGGTCTCATGGTCGTTGGCCAGAGCGGCGGCGTGGCGTCCTCCGTCGCGAGGGAAGCCGACGGGGACCCCATCCGGTTCGCGAACGACCTCGATGTGCACAGGAATGGATCCGTATTCTTCACTGACACGAGCATGAGATACAGCAGAAAGGACCATCTGAACATCCTGTTAGAAGGAGAAGGCACCGGGAGGCTGCTCAGGTATGATCCAGAAACAAGCGGTGTCCATGTCGTGCTCAAGGGGCTGGTGTTCCCAAACGGCGTGCAGATCTCAGAGGACCATCAGTTTCTTCTCTTCTCCGAGACAACAAACTGCAGGATAATGAGGTACTGGCTGGAAGGCCCAAGAGCGGGCGAGGTAGAGGTGTTCGCGAACCTGCCGGGCTTCCCCGACAACGTGCGCTCCAACGGCAGGGGCCAGTTCTGGGTGGCGATCGACTGCTGCCGGACGCCGGCGCAGGAGGTGTTCGCCAAGAGGCCGTGGCTCCGGACCCTGTACTTCAAGTTCCCGCTGTCGCTCAAGGTGCTCACTTGGAAGGCCGCCAGGAGGATGCACACGGTGCTCGCGCTCCTCGACGGCGAAGGGCGCGTCGTGGAGGTGCTCGAGGACCGGGGCCACGAGGTGATGAAGCTGGTGAGCGAGGTGCGGGAGGTGGGCCGCAAGCTGTGGATCGGAACCGTGGCGCACAACCACATCGCCACCATCCCCTACCCTTTAGAGGACTAA
SEQ ID No.2如下：
MEKRNLQWRRGRDGIVQYPHLFFAALALALLVADPFGLSPLAEVDYRPVKHELAPYGEVMGSWPRDNASRLRRGRLEFVGEVFGPESIEFDLQGRGPYAGLADGRVVRWMGEEAGWETFAVMNPDWSEEVCANGVNSTTRKQHEKEEFCGRPLGLRFHGETGELYVADAYYGLMVVGQSGGVASSVAREADGDPIRFANDLDVHRNGSVFFTDTSMRYSRKDHLNILLEGEGTGRLLRYDPETSGVHVVLKGLVFPNGVQISEDHQFLLFSETTNCRIMRYWLEGPRAGEVEVFANLPGFPDNVRSNGRGQFWVAIDCCRTPAQEVFAKRPWLRTLYFKFPLSLKVLTWKAARRMHTVLALLDGEGRVVEVLEDRGHEVMKLVSEVREVGRKLWIGTVAHNHIATIPYPLED
以B73的基因组DNA为模板，参考B73基因组序列（www.maizesequence.org），设计扩增引物，以扩增恢复基因Ms45。所设计的引物如下：
Ms45F: 5'-TgaattcTGCTGAGTTCTCCTTGGGTTATCC-3'（如SEQ ID No.7所示，下划线指示的是与SEQ ID No.3的1-24位结合的序列，小写字母指示的是EcoRI酶切识别位点）；
Ms45R: 5'-TcccgggGGTTGCGCATGAAATAGGGGT-3'（如SEQ ID No.8所示，下划线指示的是与SEQ ID No.3的3483-3503位结合的序列，小写字母指示的是SmaI酶切识别位点）。
扩增的反应体系为：模板DNA 2µL，引物Ms45F 0.5µL，引物Ms45R 0.5µL，dNTP 1.6µL，10×Buffer 2µL，高保真taq酶0.3µL，ddH2O 13.1µL。
反应条件为：95℃变性5min；32个循环的（95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸3min）；72℃延伸10min。
实验结果：扩增得到的目标产物全长约为3500bp。将其回收并连接至T-easy测序载体，然后用于转化并测序。测序结果证实，扩增产物是由EcoRI酶切识别位点、SEQ IDNo.3所示序列和SmaI酶切识别位点顺序连接成的3517bp的DNA片段，称为Ms45表达元件。SEQ ID No.3所示序列含有Ms45基因的启动子和Ms45基因组序列。
SEQ ID No.3如下：
TGCTGAGTTCTCCTTGGGTTATCCATGGTGTCTCTATGAAAAAGATGAGTACAATGTGTCTATATCCGTTTTCTTAGGGTCCCTTCTTCTGCCTTATTACTGACTGAATCGGGGTTACAAAAAACTTCCACGGGTGCATGATCTCCATGTTCCACTTCTCCCACCTCGCGTTGCACATTTCTTGGATGTCGGTGGTTCCCATCTGACCGAGGCCCATCAGACACCTTTCGGGACACCCATCAAGGGCCTTTCGGATGGCCCACGAGACGTATCGGGTCGTGGTGATCCAGGGGATATATGTCCCCCACAATCGTCACCTATATTATTATTCTTTAGATATTATTTAATTTTTGGAAAAATAACAAACTTATACTTTTGTGTAGGGCCTCAGCATAGATTTTCGCTTAGGGCCCAGAAATGCGAGGACCAGCCATGTCTAGTGTCCACTATTGGCACTACCCAGAACAAGATTTAAAAAAATAACCAAAGTAACTAATCCACTCGAAAGCTATCATGTAATGTTTAAAGAAACATCTATTAAAACCACGATCCTCTTAAAAAACAAGCATATTTCGAAAGAGACAAATTATGTTACAGTTTACAAACATCTAAGAGCGACAAATTATATCGAAAGGTAAGCTATGACGTTCAGATTTTTCTTTTTCATTCTTGTTATTTTGTTATTGTTTTTATATACATTTTCTTCTCTTACAATAGAGTGATTTTCTTCCGATTTTATAAAATGACTATAAAGTCATTTTTATATAAGAGCACGCATGTCGTAGATTCTCGTTCAAAAATCTTTCTGATTTTTTTAAGAGCTAGTTTGGCAACCCTGTTTCTTTCAAAGAATTTTGATTTTTTCAAAAAAAATTAGTTTATTTTCTCTTTATAAAATAGAAAACACTTAGAAAAATAGAGTTGCCAGACTAGCCCTAGAATGTTTTCCCAATAAATTACAATCACTGTGTATAATTATTTGGCCAGCCCCATAAATTATTTAAACCGAAACTGAAATCGAGCGAAACCAAATCTGAGCTATTTCTCTAGATTAGTAAAAAGGGAGAGAGAGAGGAAGAAATCAGTTTTAAGTCATTGTCCCTGAGATGTGCGGTTTGGCAACGATAGCCACCGTAATCATAGCTCATAGGTGCCTACGTCAGGTTCGGCAGCTCTCGTGTCATCTCACATGGCATACTACATGCTTGTTCAACCGTTCGTCTTGTTCCATCGTCCAAGCCTTGCCTATTCTGAACCAAGAGGATACCTACTCCCAAACAATCCATCTTACTCATGCAACTTCCATGCAAACACGCACATATGTTTCCTGAACCAATCCATTAAAGATCACAACAGCTAGCGTTCTCCCGCTAGCTTCCCTCTCTCCTCTGCCGATCTTTTTCGTCCACCAGCATGGAGAAGAGGAACCTGCAGTGGCGGCGAGGGCGTGATGGCATCGTGCAGTACCCTCACCTCTTCTTCGCGGCCCTGGCGCTGGCCCTCCTAGTCGCGGACCCGTTCGGCCTCAGTCCGCTGGCCGAGGTCGACTACCGGCCGGTGAAGCACGAGCTCGCGCCGTACGGGGAGGTCATGGGCAGCTGGCCCAGAGACAATGCCAGCCGGCTCAGGCGCGGGAGGCTGGAGTTCGTCGGCGAGGTGTTCGGGCCGGAGTCTATCGAGTTCGATCTCCAGGGCCGCGGGCCGTACGCCGGCCTCGCCGACGGCCGCGTCGTGCGGTGGATGGGCGAGGAGGCCGGGTGGGAGACGTTCGCCGTCATGAATCCTGACTGGTAAGTGCTCGATATCGCTCCGGCGTCCACTCGTTACATGCTATAATATAGTAGTACTAAGATATTTTGATCTGATTTTTTGCATTCTTGGGAGAAACGTCATGCAAAATTTGTTGTTTCTTGGCAAAGGTCAGAAGAAGTCTGTGCCAATGGAGTGAACTCAACGACGAGGAAGCAGCACGAGAAGGAGGAGTTCTGCGGCCGGCCGCTCGGCCTGAGGTTCCACGGGGAGACCGGCGAGCTCTACGTCGCCGACGCGTACTACGGTCTCATGGTCGTTGGCCAGAGCGGCGGCGTGGCGTCCTCCGTCGCGAGGGAAGCCGACGGGGACCCCATCCGGTTCGCGAACGACCTCGATGTGCACAGGAATGGATCCGTATTCTTCACTGACACGAGCATGAGATACAGCAGAAAGTGAGCAAAGCGACGTAACAATCCGGCTTCTCATTTTCAAACGCCTCTGTATTCTCTGCTGAAAGAGTAGCTCACCAGACAAGAGCTGAATTTGCAGGGACCATCTGAACATCCTGTTAGAAGGAGAAGGCACCGGGAGGCTGCTCAGGTATGATCCAGAAACAAGCGGTGTCCATGTCGTGCTCAAGGGGCTGGTGTTCCCAAACGGCGTGCAGATCTCAGAGGACCATCAGTTTCTTCTCTTCTCCGAGACAACAAACTGCAGGTAACAAAAATACTATCTGACGATGCTCATGATTCTACCGTATCCATAGTCATGAACACAAACCACACGAATCTGGCCTTGACCAGGATAATGAGGTACTGGCTGGAAGGCCCAAGAGCGGGCGAGGTAGAGGTGTTCGCGAACCTGCCGGGCTTCCCCGACAACGTGCGCTCCAACGGCAGGGGCCAGTTCTGGGTGGCGATCGACTGCTGCCGGACGCCGGCGCAGGAGGTGTTCGCCAAGAGGCCGTGGCTCCGGACCCTGTACTTCAAGTTCCCGCTGTCGCTCAAGGTGCTCACTTGGAAGGCCGCCAGGAGGATGCACACGGTGCTCGCGCTCCTCGACGGCGAAGGGCGCGTCGTGGAGGTGCTCGAGGACCGGGGCCACGAGGTGATGAAGCTGGTGAGCGAGGTGCGGGAGGTGGGCCGCAAGCTGTGGATCGGAACCGTGGCGCACAACCACATCGCCACCATCCCCTACCCTTTAGAGGACTAACCATGATCTATGCTGTTTCAATGCCTCCTAATCTGTGTACGTCTATAAATGTCTAATGCAGTCACTGGTTGTAATCTTGTTTGTGTTTGGCAAATTGGCATAATAATGGACAGATTCAATGGGCATTGGTGCTGTAGTCGCATCACACTAATTGAATGGGATCATGTTGAGCTCTCACTTTGCTACAATTTGCTCCAGCTTGTACGGTTGTACCCTCTTGCTCGTCTATAGTAAGGGCCATCTAAAAAAAACTCAAATTAGATCTGCAATACAAGTATGATTGGGCCGAATTTGGATTGTCACGGGTCCGCGACCGCGAATTGGGCTCGGTTTGATTTAGCCGACATAGTAGTGACCGACCCGAGCCGGCGGCGAGCCAAACCGAGCGGACGCCGCCATGGATCGCGAGTGGGGCTCCAAGCCCGGCAGCGGCGGCGCCGCCTCCGCGCAGAATGAGGCCATCGACCGGCGGGAGCGCCTCCGCCGCCTGGCCCTCGAGACCATCGACCTCGCCAAGGACCCCTATTTCATGCGCAACC
1.2、调控种子颜色、植株颜色的相关基因的扩增
RUBY基因的扩增:
RUBY基因的编码序列如SEQ ID No.4所示，其编码的RUBY蛋白的氨基酸序列如SEQID No.5所示。在SEQ ID No.4的5’端添加NcoI酶切识别位点和保护碱基，3’端添加BstEII酶切识别位点和保护碱基，并将此序列进行人工合成，称为RUBY基因构建片段。
SEQ ID No.4如下：
ATGGACCACGCCACCCTGGCCATGATCCTGGCCATCTGGTTCATCAGCTTCCACTTCATCAAGCTGCTGTTCAGCCAGCAGACCACTAAGCTGCTGCCACCCGGTCCCAAGCCCCTGCCCATCATCGGCAACATCCTGGAGGTGGGCAAGAAGCCCCATCGCAGCTTCGCCAACCTGGCCAAGATCCACGGCCCCCTGATCAGCCTGAGGCTGGGCAGCGTGACCACCATCGTGGTGAGCAGCGCCGACGTGGCCAAGGAGATGTTCCTGAAGAAGGACCACCCCCTGAGCAACCGCACCATCCCCAACAGCGTGACCGCCGGTGACCACCACAAGCTGACCATGAGCTGGCTGCCCGTGAGCCCCAAGTGGCGCAACTTCCGCAAGATCACCGCCGTGCACCTGCTGAGCCCCCAGAGGCTGGACGCTTGCCAGACCTTCAGGCACGCCAAGGTGCAGCAGCTGTACGAGTACGTGCAGGAGTGCGCCCAGAAGGGCCAGGCCGTGGACATCGGCAAGGCTGCCTTCACCACCAGCCTGAACCTGCTGAGCAAGCTGTTCTTCAGCGTGGAGCTGGCCCACCACAAGAGCCACACCAGCCAGGAGTTCAAGGAGCTGATCTGGAACATCATGGAGGACATCGGCAAGCCCAACTACGCCGACTACTTCCCCATCCTGGGTTGCGTGGACCCCAGCGGCATCCGCCGCAGGCTGGCCTGCAGCTTCGACAAGCTGATCGCTGTGTTCCAGGGCATCATCTGCGAGCGCCTGGCCCCCGACAGCAGCACTACCACCACTACCACCACTGACGACGTGCTGGACGTGCTGCTTCAGCTGTTCAAGCAGAACGAGCTGACCATGGGCGAGATCAACCACCTGCTGGTGGACATCTTCGACGCCGGCACTGACACCACCAGCAGCACCTTCGAGTGGGTGATGACCGAGCTGATCAGGAACCCCGAGATGATGGAGAAGGCCCAGGAGGAGATCAAGCAGGTGCTGGGCAAGGACAAGCAGATCCAGGAGAGCGACATCATCAACCTGCCCTACCTGCAGGCCATCATCAAGGAGACCCTGCGCCTGCACCCACCCACCGTGTTCCTGCTGCCCCGCAAGGCCGACACCGACGTGGAGCTGTACGGCTACATCGTGCCCAAGGACGCCCAGATCCTGGTGAACCTGTGGGCCATCGGCCGCGACCCCAACGCCTGGCAGAACGCCGACATCTTCAGCCCCGAGCGCTTCATCGGCTGCGAGATCGACGTGAAGGGTCGCGACTTCGGCCTGCTGCCCTTCGGCGCCGGTCGCCGCATCTGCCCCGGCATGAACCTGGCCATCCGCATGCTGACCCTGATGCTGGCCACCCTGCTGCAGTTCTTCAACTGGAAGCTGGAGGGCGACATCAGCCCCAAGGACCTGGACATGGACGAGAAGTTCGGCATCGCTCTGCAGAAGACCAAGCCCCTGAAGCTGATCCCCATCCCCCGCTACGGCAGCGGCGCCACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGTCCCATGAAGATGATGAACGGCGAGGACGCCAACGACCAGATGATCAAGGAGAGCTTCTTCATCACCCACGGCAACCCCATCCTGACCGTGGAGGACACTCACCCGCTGAGGCCCTTCTTCGAGACCTGGCGCGAGAAGATCTTCAGCAAGAAGCCCAAGGCCATCCTGATCATCAGCGGCCACTGGGAGACCGTGAAGCCCACCGTGAACGCCGTGCACATCAACGACACCATCCACGACTTCGACGACTACCCCGCTGCCATGTACCAGTTCAAGTACCCCGCTCCCGGCGAGCCCGAGCTGGCCCGCAAGGTGGAGGAGATCCTGAAGAAGAGCGGCTTCGAGACTGCCGAGACCGACCAGAAGCGCGGCCTGGACCACGGTGCCTGGGTGCCCCTGATGCTGATGTACCCCGAGGCCGACATCCCCGTGTGCCAGCTGAGCGTGCAGCCCCACCTGGACGGCACCTACCACTACAACCTGGGCCGCGCCCTGGCTCCCCTGAAGAACGACGGCGTGCTGATCATCGGCAGCGGCAGCGCCACCCACCCCCTGGACGAGACTCCCCACTACTTCGACGGCGTGGCTCCCTGGGCCGCTGCCTTCGACAGCTGGCTGCGCAAGGCCCTGATCAACGGCCGCTTCGAGGAGGTGAACATCTACGAGAGCAAGGCCCCCAACTGGAAGCTGGCCCACCCCTTCCCCGAGCACTTCTACCCCCTGCACGTGGTGCTGGGCGCCGCTGGCGAGAAGTGGAAGGCCGAGCTGATCCACAGCAGCTGGGACCACGGCACCCTGTGCCACGGCAGCTACAAGTTCACCAGCGCCGGCAGCGGTGCTACCAACTTCAGCCTCCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGTCCCATGACCGCCATCAAGATGAACACCAACGGCGAGGGCGAGACCCAGCACATCCTGATGATCCCCTTCATGGCCCAGGGCCACCTGCGCCCCTTCCTGGAGCTGGCTATGTTCCTGTACAAGCGCAGCCACGTGATCATCACCCTGCTGACCACTCCCCTGAACGCTGGCTTCCTGCGCCACCTGCTGCACCACCACAGCTACAGCAGCAGCGGCATCCGCATCGTGGAGCTGCCCTTCAACAGCACCAACCACGGCCTGCCACCCGGCATCGAGAACACCGACAAGCTGACCCTGCCCCTGGTGGTGAGCCTGTTCCACAGCACCATCAGCCTGGACCCCCACCTGCGCGACTACATCAGCAGGCACTTCAGCCCCGCTCGCCCCCCACTTTGCGTGATCCACGACGTGTTCCTGGGCTGGGTGGACCAGGTGGCCAAGGACGTGGGCAGCACCGGCGTGGTGTTCACCACCGGCGGCGCCTACGGCACCAGCGCCTACGTGAGCATCTGGAACGACCTGCCCCACCAGAACTACAGCGACGACCAGGAGTTCCCACTGCCCGGCTTTCCCGAGAACCACAAGTTCCGCCGCAGCCAGCTGCACCGCTTCCTGAGATACGCTGACGGTAGCGACGACTGGAGCAAGTACTTCCAGCCCCAGCTGCGCCAGAGCATGAAGAGCTTCGGCTGGCTGTGCAACAGCGTGGAGGAGATCGAGACCCTGGGCTTCAGCATCCTGCGCAACTACACCAAGCTGCCCATCTGGGGTATCGGCCCCCTGATCGCTAGCCCCGTGCAGCACAGCAGCAGCGACAACAACAGCACCGGCGCCGAGTTCGTGCAGTGGCTGAGCCTGAAGGAGCCCGACAGCGTGCTGTACATCAGCTTCGGCAGCCAGAACACCATCAGCCCCACCCAGATGATGGAGCTGGCTGCCGGTCTGGAGAGCAGCGAGAAGCCCTTCCTGTGGGTGATCAGGGCTCCCTTCGGCTTCGACATCAACGAGGAGATGAGGCCCGAGTGGCTGCCCGAGGGCTTCGAGGAGCGCATGAAGGTGAAGAAGCAGGGCAAGCTGGTGTACAAGCTGGGCCCCCAGCTGGAGATCCTGAACCACGAGAGCATCGGTGGCTTCCTGACCCACTGCGGCTGGAACAGCATCCTGGAGAGCCTTCGCGAGGGCGTGCCCATGCTGGGCTGGCCCCTGGCTGCCGAGCAGGCCTACAACCTGAAGTACCTGGAGGACGAGATGGGTGTGGCCGTGGAGCTGGCTAGGGGTCTGGAGGGCGAGATCAGCAAGGAGAAGGTGAAGCGCATCGTGGAGATGATCCTGGAGCGCAACGAGGGTAGCAAGGGCTGGGAGATGAAGAACCGCGCCGTGGAGATGGGTAAGAAGCTGAAGGACGCCGTGAACGAGGAGAAGGAGCTGAAGGGCAGCAGCGTGAAGGCCATCGACGACTTCCTGGACGCCGTGATGCAGGCCAAGCTGGAGCCCAGCCTGCAGTGA
SEQ ID No.5如下：
MDHATLAMILAIWFISFHFIKLLFSQQTTKLLPPGPKPLPIIGNILEVGKKPHRSFANLAKIHGPLISLRLGSVTTIVVSSADVAKEMFLKKDHPLSNRTIPNSVTAGDHHKLTMSWLPVSPKWRNFRKITAVHLLSPQRLDACQTFRHAKVQQLYEYVQECAQKGQAVDIGKAAFTTSLNLLSKLFFSVELAHHKSHTSQEFKELIWNIMEDIGKPNYADYFPILGCVDPSGIRRRLACSFDKLIAVFQGIICERLAPDSSTTTTTTTDDVLDVLLQLFKQNELTMGEINHLLVDIFDAGTDTTSSTFEWVMTELIRNPEMMEKAQEEIKQVLGKDKQIQESDIINLPYLQAIIKETLRLHPPTVFLLPRKADTDVELYGYIVPKDAQILVNLWAIGRDPNAWQNADIFSPERFIGCEIDVKGRDFGLLPFGAGRRICPGMNLAIRMLTLMLATLLQFFNWKLEGDISPKDLDMDEKFGIALQKTKPLKLIPIPRYGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKMMNGEDANDQMIKESFFITHGNPILTVEDTHPLRPFFETWREKIFSKKPKAILIISGHWETVKPTVNAVHINDTIHDFDDYPAAMYQFKYPAPGEPELARKVEEILKKSGFETAETDQKRGLDHGAWVPLMLMYPEADIPVCQLSVQPHLDGTYHYNLGRALAPLKNDGVLIIGSGSATHPLDETPHYFDGVAPWAAAFDSWLRKALINGRFEEVNIYESKAPNWKLAHPFPEHFYPLHVVLGAAGEKWKAELIHSSWDHGTLCHGSYKFTSAGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMTAIKMNTNGEGETQHILMIPFMAQGHLRPFLELAMFLYKRSHVIITLLTTPLNAGFLRHLLHHHSYSSSGIRIVELPFNSTNHGLPPGIENTDKLTLPLVVSLFHSTISLDPHLRDYISRHFSPARPPLCVIHDVFLGWVDQVAKDVGSTGVVFTTGGAYGTSAYVSIWNDLPHQNYSDDQEFPLPGFPENHKFRRSQLHRFLRYADGSDDWSKYFQPQLRQSMKSFGWLCNSVEEIETLGFSILRNYTKLPIWGIGPLIASPVQHSSSDNNSTGAEFVQWLSLKEPDSVLYISFGSQNTISPTQMMELAAGLESSEKPFLWVIRAPFGFDINEEMRPEWLPEGFEERMKVKKQGKLVYKLGPQLEILNHESIGGFLTHCGWNSILESLREGVPMLGWPLAAEQAYNLKYLEDEMGVAVELARGLEGEISKEKVKRIVEMILERNEGSKGWEMKNRAVEMGKKLKDAVNEEKELKGSSVKAIDDFLDAVMQAKLEPSLQ
1.3、构建重组农杆菌
使用质粒pCAMBAI3301（国际农业分子生物学应用中心 CAMBIA, Australia）来构建下述重组表达载体，该质粒上含有选择标记基因bar（其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示）。
SEQ ID No.6如下：
ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGACATCCGCCGTGCCACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACGGACGACCTCGTCCGTCTGCGGGAGCGCTATCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGACGGCGAGGTCGCCGGCATCGCCTACGCGGGCCCCTGGAAGGCACGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCGGACGGGACTGGGCTCCACGCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGTCATCGGGCTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCATGCACGAGGCGCTCGGATATGCCCCCCGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCGTCACCGAGATTTGA
载体pMs45-RUBY的构建：
以BstEII和NcoI酶切pCAMBAI3301回收载体骨架称为载体骨架1，同时以BstEII和NcoI酶切RUBY基因构建片段，将其与上述回收的载体骨架1连接，得到重组质粒pCAMBAI3301-RUBY。再以EcoRI和SmaI酶切pCAMBAI3301-RUBY回收载体骨架称为载体骨架2，同时以EcoRI和SmaI酶切Ms45表达元件，将其与上述回收的载体骨架2连接，得到重组质粒pMs45-RUBY。
根据测序结果，对重组质粒pMs45-RUBY进行结构描述如下：将质粒pCAMBAI3301的限制性内切酶BstEII和NcoI识别序列间的小片段替换为RUBY基因构建片段，并将限制性内切酶EcoRI和SmaI识别序列间的小片段替换为Ms45表达元件，保持质粒pCAMBAI3301的其它序列不变，得到的重组质粒pMs45-RUBY。重组质粒pMs45-RUBY包含Ms45基因编码序列及其启动子、RUBY基因编码序列和pCAMBAI3301载体本身的选择标记基因bar。
将上述获得的载体pMs45-RUBY转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pMs45-RUBY。
2、转基因玉米的获得
在田间种植玉米品种HiIIA和HiIIB，到散粉时将其分别套袋、授粉，进行杂交，其中，HiIIA作母本，HiIIB作父本。授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟的杂交幼胚，用获得的重组农杆菌EHA105/pMs45-RUBY对杂交幼胚进行侵染。将侵染后的幼胚放在选择培养基（溶质浓度如图5，溶剂为水）上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转基因pMs45-RUBY玉米。具体的实施步骤如下所示：
2.1、玉米幼胚的获得
1）将HiIIA和HiIIB杂交F1代的果穗顶端约1cm左右切除，用镊子从顶端插入果穗。然后把果穗放入含有消毒液的烧杯中，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗。
2）向烧杯里加入约700ml的消毒液（50%的漂白剂或5.25%的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20）用来浸泡果穗。在消毒20分钟的过程中，不时旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。
3）把消毒过的果穗放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部（1.5-1.8mm）。
4）用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的放置密度大约是2cm×2cm（30个/皿）。
5）用封口膜封住培养皿，28℃暗培养2-3天。
2.2、农杆菌的浸染
1）将重组农杆菌EHA105/pMs45-RUBY分别在YEP（含Kana33mg/L和Str100mg/L抗生素）培养基上提前一周培养。
2）将上述培养的重组农杆菌转移至新鲜的YEP（含Kana33mg/L，Str50mg/L）培养基上，19℃培养3天。
3）3天以后，挑取重组农杆菌放入含有5mL浸染培养基（配方参考专利申请“一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法”中的浸染培养基，申请号：201610069994.1，公开号：CN105567730A）的50ml离心管中，同时加入100uM的AS(inf+AS)，在室温（25℃）转速75rpm下培养2-4个小时。
4）浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基（2ml）的离心管中，每管约放置20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5ml特定浓度（OD550=0.3-0.4）的重组农杆菌EHA105/pMs45-RUBY，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在重组农杆菌EHA105/pMs45-RUBY液体里，整个过程避免旋涡振荡。
2.3、共培养
1）浸染后，把浸染过的玉米幼胚转移到共培养培养基（溶质浓度如图5，溶剂为水），使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时去除培养基表面多余的重组农杆菌。
2）用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。
2.4、静息培养
1）共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基（溶质浓度如图5，溶剂为水）上，同时用封口膜封住培养皿，在28℃条件下暗培养7天。
2.5、选择
1）7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基（溶质浓度如图5，溶剂为水）上（35个幼胚/每皿）培养两周，此时选择培养基含有双丙胺磷1.5mg/L。两周后再次以选择培养基（溶质浓度如图5，溶剂为水）培养，此时双丙胺磷的浓度可以上升到3mg/L。
2）浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看的见的Ⅱ型愈伤组织。
2.6、转基因植株的再生
1）将Ⅱ型愈伤组织接种在再生培养基I（溶质浓度如图5，溶剂为水）上生长3周，然后在再生培养基II（溶质浓度如图5，溶剂为水）上面发芽（置于光照培养室中），得到T0代转基因pMs45-RUBY玉米。
2）待T0代转基因pMs45-RUBY玉米生长出3-4片叶时，转移到温室，待其生长至吐丝散粉期时，采集T0代转基因pMs45-RUBY玉米的花粉对ms45雄性不育材料905I分别进行授粉，所得果穗如图1所示，其上的籽粒分为非紫色籽粒（图1中标为1）和紫色籽粒（图1中标为2），共收10个果穗，平均每个果穗278粒，且非紫色籽粒:紫色籽粒为1:1。采集获得的籽粒，即为杂交一代的种子。
2.7、分析获得的转基因植株
对步骤2.6中获得的以T0代转基因pMs45-RUBY玉米为父本与ms45纯合隐性的雄性不育材料905I杂交，得到杂交一代进行分析。
种植杂交一代种子，将非紫色籽粒（图1中标为1）和紫色籽粒（图1中标为2）种植于不同行，分别进行基因型检测和植株表型检测。
1）杂交一代的基因型检测
采集种植杂交一代种子得到的植株上的叶子作为基因型检测材料，每种颜色籽粒得到的植株检测150株，重复数为三个。
通过检测bar基因以确定杂交一代是否含有转基因元件Ms45-RUBY。bar基因检测方法为：用如下引物Bar669F和Bar669R对杂交后代的基因组进行PCR扩增，若扩增产物含有大小约为669bp的目的片段，则杂交后代为含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交一代；若扩增产物不含有大小669bp目的片段，则杂交后代为不含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交一代。
上述引物Bar669F和Bar669R序列如下：
Bar669F: 5'-TCTCGGTGACGGGCAGGAC-3'（如SEQ ID No.9所示）；
Bar669R: 5'-TGACGCACAATCCCACTATCCTT-3'（如SEQ ID No.10所示）。
经PCR和测序验证，得到含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交一代，具体图1中的2指示的紫色籽粒为含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交后代籽粒，图1中1指示的非紫色籽粒为不含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交后代籽粒，具体籽粒颜色为黄色。
2）杂交三代植株表型的检测
观察大田中栽培的杂交三代的表型（即连续与ms45纯合隐性的雄性不育材料905I杂交三代），杂交三代的植株颜色如图2所示，其中，含有转基因元件Ms45-RUBY，且为ms45/ms45的杂交三代（由图1中2指示的紫色籽粒播种后获得）如图2的2所示，植株表现为紫色，且育性检测结果为雄性可育；而不含有转基因元件Ms45-RUBY的杂交一代（由图1中1指示的非紫色籽粒播种后获得）如图2的1所示，植株表现为非紫色，且育性检测结果为雄性不育。
综上，选择T0代转基因pMs45-RUBY玉米时在双丙胺磷的筛选下，紫色种子、植株仍能够正常生长，表明选择标记基因bar正常行使功能。在T0代转基因植株与雄性不育系植株ms45杂交产生的后代中，非紫色籽粒:紫色籽粒数量为1:1。其中，非紫色籽粒基因检测结果基本均不含有转基因元件Ms45-RUBY，种植得到的基本均为绿色幼苗，去除可能的异雄核授精产生的紫色幼苗后均表现为雄性不育；紫色籽粒基因检测结果基本均含有转基因元件Ms45-RUBY，种植得到的基本均为紫色幼苗，去除可能的异雄核授精产生的绿色幼苗后均表现为雄性可育。上述检测结果表明，含有转基因元件Ms45-RUBY的植株，由于Ms45基因在植株中的表达拯救了隐性纯合ms45基因导致的雄性不育表型，表现为雄性可育。同时，含有Ms45-RUBY的转基因植株和籽粒均表现为紫色，这说明RUBY基因在转基因植株中均能正常行使功能。将上述获得的紫色籽粒及非紫色（黄色）籽粒播种到田间，这些籽粒均能够正常发芽，且出芽率没有显著差异。以上结果表明，含有转基因元件Ms45-RUBY的植株中，选择标记基因bar、Ms45基因及RUBY基因均能正常行使功能，并且这三个基因连锁遗传，可利用其进行后续雄性不育系的扩繁。
3、利用雄性不育保持系对雄性不育系进行大规模扩繁
3.1、雄性不育系的制备
以ms45雄性不育材料905I（ms45/ms45）为母本，与郑58（河南省农科院粮作所品种，Ms45/Ms45）杂交，获得的F1（Ms45/ms45）继续与玉米自交系郑58回交。对获得的BC1（回交一代）群体进行基因型分析，分子标记筛选其中Ms45位点为杂合（Ms45/ms45）的植株继续与郑58回交。如此回交5-6代后，利用分子标记筛选Ms45位点为杂合（Ms45/ms45），农艺性状表型与郑58接近的单株进行自交，筛选获得的ms45纯合隐性自交系（ms45/ms45），称为郑58A，该自交系即可作为雄性不育系植株。
上述筛选Ms45位点的基因型的方法如下：用如下引物Ms45F1和Ms45R1对植物基因组进行PCR扩增，并对扩增结果进行测序。Ms45目的片段大小为859bp，ms45目的片段大小为811bp。若扩增产物同时包含859bp和811bp目的片段，则该位点的基因型为杂合的Ms45/ms45；若扩增产物不含811bp片段，则该位点的基因型为Ms45/Ms45显性纯合；若扩增产物不含859bp目的片段，则该位点的基因型为ms45/ms45隐性纯合。
Ms45F1:5' -CTTGAGCGACAGCGGGAACT-3'（如SEQ ID No.11所示）；
Ms45R1:5' -TGTTGTTTCTTGGCAAAGGTCAG-3'（如SEQ ID No.12所示）。
3.2、保持系的制备
（1）制备Ms45-RUBY杂合且ms45纯合的保持系植株
以步骤2中获得的T0代转基因pMs45-RUBY玉米作为父本，与上述得到的作为母本的不育系郑58A（ms45/ms45）杂交，从杂交后代中挑选紫色籽粒（含有转基因元件Ms45-RUBY）播种到田间后喷施200mM的双丙胺磷进行标记基因bar筛选。将存活的植株继续与母本不育系郑58A（ms45/ms45）回交。在回交过程中一直选择紫色籽粒及植株与母本不育系郑58A（ms45/ms45）回交，如此回交5-6代后，后代中紫色籽粒及植株的转基因位点（Ms45-RUBY）均为杂合，利用紫色籽粒及植株的花粉给母本不育系郑58A授粉，得到的正常籽粒（黄色籽粒）或正常植株（绿色植株）基本均为不育，则提供花粉的植株转基因位点Ms45-RUBY为杂合且ms45位点为隐形纯合，即为得到的保持系植株，称为郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45/ms45）。
验证其作为保持系的效果如下：
将获得的保持系植株郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45ms45）作为父本，与作为母本的郑58A（ms45/ms45）进行杂交，产生的果穗见图3，不但有雄性不育系籽粒郑58A（ms45/ms45），而且还有保持系籽粒郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45/ms45）。并且雄性不育系郑58A（ms45/ms45）的籽粒显现正常（图3中1所示籽粒），而其保持系郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45/ms45）籽粒为紫色（图3中2所示籽粒）。
3.3、使用雄性不育保持系对雄性不育系进行大规模扩繁
将步骤3.1获得的雄性不育系郑58A（ms45/ms45）和步骤3.2获得的保持系步骤郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45/ms45）进行播种。两个材料相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，并确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系与保持系田间自然授粉。
保持系郑58B只能接受自己的花粉，会产生两种后代：一种为表现出转基因元件外在性状的后代（例如，紫色籽粒和紫色植株），这些后代的转基因元件可能是纯合的，可能是杂合的，较难辨别。因此，这些籽粒或植株予以丢弃。而第二种外在性状正常的后代，不含有转基因元件，可以作为不育系郑58A并保留。
不育系材料接受了保持系的花粉，会产生两种后代：一种为表现出转基因元件外在性状的后代（例如，紫色籽粒和紫色植株），这些后代的转基因元件是杂合的，可以作为保持系郑58B并保留。另一种为外在性状正常的后代（例如，黄色籽粒，绿色植株），不含有转基因元件，可以作为不育系郑58A并保留。保持系郑58B可用于下一年继续扩繁不育系郑58A和保持系郑58B，而不育系郑58A中大部分用于生产商品种，剩余的小部分用于下一年继续扩繁不育系郑58A和保持系郑58B。
4、利用雄性不育系大规模生产杂交种
在步骤3中生产的不育系郑58A为细胞核控制的隐性纯合不育系，该不育系可以被任意的野生型植株（Ms45/Ms45）恢复育性。因此只要选择一个与雄性不育系郑58A配合力高的自交系（例如，昌7-2）进行杂交，便可以生产出农艺性状优良的杂交种。
为了达到以上目的，将郑58A与昌7-2隔行播种于田间，并确保繁种周边300米内无其他玉米播种。使得不育系郑58A的果穗只能接受野生型自交系的花粉，而野生型自交系只能自交。如此，不育系郑58A果穗上所产生的种子即为杂交种。
之前，中国专利ZL201210406155.6已利用同时含有Ms45基因和编码CWI-2基因的干扰RNA的核苷酸序列的载体，创建了以籽粒大小标记的雄性不育保持系，然而，由于异雄核受精现象（双受精过程中同一个种子的胚和胚乳由2个不同的雄配子体形成的精子受精获得）的存在，利用此类雄性不育保持系生产的雄性不育系子代群体无法实现100%的不育性。具体来说，利用中国专利ZL201210406155.6中描述的方法，扩繁制备了大量不育系玉米种子；随后，将其播种于田间，并在散粉期观测记录散粉植株的数量。结果显示，10万株中共观测到348株散粉植株（此类植株含有源自保持系的转基因成分）。这表明，所获得的不育系种子中，混杂了少量具有雄性可育的个体（约占所生产的不育系后代群体的3.48‰）。进一步，将此类混有雄性可育个体（即保持系个体）的不育系植株群体与目标玉米品系植株进行杂交，制备杂交种。然后，将所生产的杂交种播种于田间，随机挑选了10000株进行基因检测。结果显示，含有源自保持系的转基因成分的杂交种有236株，占比达到2.36%。该结果表明，所述生产的杂交种的种子纯度仍然有待提高，不能完全满足生产要求。这对杂交种市场化带来了不良影响和潜在风险。
而在本实施例1中，本申请发明人利用RUBY基因对植株进行了双重标记（种子颜色和植株颜色），解决了异雄核受精所引发的问题，显著提高了所生产的杂交种的种子纯度（达到100%）。
简言之，将本实施例1获得的保持系植株郑58B（Ms45-RUBY杂合且ms45/ms45）和不育系植株郑58A（ms45/ms45）相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系植株与保持系植株田间自然授粉。收集不育系植株的后代种子，并根据种子的颜色进行首次的筛选，即，区分不育系子代（种子为黄色）和保持系子代（种子为紫色）。
然后，将获得的不育系种子郑58A（作为母本）和目标玉米品系种子（作为父本，昌7-2自交系）相隔播种，每播种1行目标玉米品系种子，相应的播种5行不育系种子，并且，确保繁种周边300米内无其他玉米播种。在玉米生长的苗期，观察不育系植株的外在性状，并且，从不育系植株中去除显示紫色植株颜色的植株。经统计，10万株中不育系植株中，有311株紫色苗被去除，即，扩繁的不育系的纯度为99.689%。
筛选后，让不育系植株郑58A与目标玉米品系植株昌7-2田间自然授粉。收集不育系植株上结出的杂交种子。然后，将所生产的杂交种子播种于田间，并随机挑选10000株进行基因检测，以确定杂交种子中含有源自保持系的转基因成分（pMs45-RUBY）的种子比例，评估杂交种子的质量（纯度）。实验结果显示，在利用种子颜色和植株颜色进行双重筛选后，所产生的杂交种子的纯度达到100%，即，所有杂交种子均不含有源自保持系的转基因成分（pMs45-RUBY）。
基于这一结果可以确定：通过利用本发明的雄性不育保持系，借助于双重筛选（种子筛选和苗期筛选），可在苗期实现子代不育系植株和子代保持系植株各自100%的纯度。本发明的雄性不育保持系以及种子繁育方法可用于产生高纯度的不育系后代种子以及高纯度的杂交种子。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.颜色标记扩繁玉米细胞核雄性不育系的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
a）提供保持系B，所述保持系B是包含与不育系A中相同的纯合的隐性雄性不育基因，并且含有以杂合状态存在的核酸分子的自交系；所述核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸；所述第一多核苷酸包含恢复基因，所述恢复基因能够恢复因所述隐性雄性不育基因导致的雄性不育的植物的雄性能育性；所述第二多核苷酸包含能够调控种子和/或植株的外在性状的筛选基因，所述外在性状包含种子颜色和/或植株颜色；所述不育系A为包含纯合的隐性雄性不育基因的不育系；
b）用所述保持系B的雄性配子与所述不育系A的雌性配子受精，依据所述筛选基因的外在性状将所得种子区分为所述不育系A的种子以及所述保持系B的种子，完成雄性不育系及相应保持系的扩繁。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述隐性雄性不育基因选自ms1，ms2，ms3，ms4，ms5，ms6，ms7，ms8，ms9，ms10，ms11，ms12，ms13，ms14，ms15，ms16，ms17，ms18，ms19，ms20，ms21，ms22，ms23，ms24，ms25，ms26，ms27，ms28，ms29，ms30，ms31，ms32，ms33，ms34，ms35，ms36，ms37，ms38，ms43，ms45，ms47，ms48，ms49，ms50和ms52中的至少一种；
所述恢复基因选自Ms1，Ms2，Ms3，Ms4，Ms5，Ms6，Ms7，Ms8，Ms9，Ms10，Ms11，Ms12，Ms13，Ms14，Ms15，Ms16，Ms17，Ms18，Ms19，Ms20，Ms21，Ms22，Ms23，Ms24，Ms25，Ms26，Ms27，Ms28，Ms29，Ms30，Ms31，Ms32，Ms33，Ms34，Ms35，Ms36，Ms37，Ms38，Ms43，Ms45，Ms47，Ms48，Ms49，Ms50和Ms52中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述隐性雄性不育基因为ms45，所述恢复基因为Ms45；所述恢复基因Ms45编码Ms45蛋白，所述Ms45蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：
A1、氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2、将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3、在A1或A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述第二多核苷酸包括：能够调控种子的外在性状的第一筛选基因，以及能够调控植株的外在性状的第二筛选基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一筛选基因和第二筛选基因相同，均为RUBY基因；所述RUBY基因编码RUBY蛋白，所述RUBY是如下C1、C2或C3的蛋白质：
C1、氨基酸序列是SEQ ID No.5所示的氨基酸序列的蛋白质；
C2、将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3、在C1或C2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一筛选基因和所述第二筛选基因不相同。
7.保持系的构建方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1-6中任一所述的核酸分子导入包含纯合的隐性雄性不育基因的不育系，得到所述核酸分子以杂合状态存在且所述隐性雄性不育基因纯合的保持系。
8.分离的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸；所述第一多核苷酸包含恢复基因，所述恢复基因能够恢复因隐性雄性不育基因导致雄性不育的植物的雄性能育性；所述第二多核苷酸包含能够调控种子和/或植株的外在性状的筛选基因，所述外在性状包含种子颜色和/或植株颜色。
9.与权利要求8所述的核酸分子相关的生物材料，为下述B1）至B8）中的任一种：
B1）含有所述核酸分子的表达盒；
B2）含有所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B3）含有所述核酸分子的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2）所述重组载体的重组微生物；
B4）含有所述的核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系；
B5）含有所述的核酸分子的转基因植物组织、或含有B1）所述表达盒的转基因植物组织；
B6）含有所述的核酸分子的转基因植物器官、或含有B1）所述表达盒的转基因植物器官。
10.权利要求1-6任一所述的方法、和/或权利要求7所述的构建方法、和/或权利要求8所述的核酸分子、和/或权利要求9所述的生物材料在植物杂交制种中的应用。
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Citations (8)
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|---|---|---|---|---|
| US6743968B2 (en) * | 2000-02-28 | 2004-06-01 | Yale University | Methods and compositions to reduce or eliminate transmission of a transgene |
| CN101545006A (zh) * | 2003-12-16 | 2009-09-30 | 先锋高级育种国际公司 | 显性基因抑制性转基因及其使用方法 |
| CN102965391A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-03-13 | 中国农业大学 | 扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法 |
| CN102960234A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-03-13 | 中国农业大学 | 扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法 |
| WO2013138309A1 (en) * | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| CN103805630A (zh) * | 2012-11-12 | 2014-05-21 | 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 | 一种新型植物育性调控构建体及其用途 |
| CN104805115A (zh) * | 2008-02-14 | 2015-07-29 | 先锋国际良种公司 | Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法 |
| CN110178721A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-30 | 中国农业大学 | 形态标记法扩繁植物核雄性不育系 |
-
2023
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6743968B2 (en) * | 2000-02-28 | 2004-06-01 | Yale University | Methods and compositions to reduce or eliminate transmission of a transgene |
| CN101545006A (zh) * | 2003-12-16 | 2009-09-30 | 先锋高级育种国际公司 | 显性基因抑制性转基因及其使用方法 |
| CN104805115A (zh) * | 2008-02-14 | 2015-07-29 | 先锋国际良种公司 | Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法 |
| WO2013138309A1 (en) * | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| CN102965391A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-03-13 | 中国农业大学 | 扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法 |
| CN102960234A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-03-13 | 中国农业大学 | 扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法 |
| CN103805630A (zh) * | 2012-11-12 | 2014-05-21 | 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 | 一种新型植物育性调控构建体及其用途 |
| CN110178721A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-30 | 中国农业大学 | 形态标记法扩繁植物核雄性不育系 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "RUBY[Cloning vector pCambia2300-RUBY]", 《NCBI》 * |
| DONG WANG等: "The RUBY reporter enables efficient haploid identification in maize and tomato", 《PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL》, vol. 21, pages 1708 * |
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| Publication number | Publication date |
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