CN116716433B - 鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性caps分子标记及其应用 - Google Patents

鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性caps分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。该分子标记在Scaffold004的686907‑686908处存在2个连续的SNP位点，该SNP位点为T/A和T/C的碱基突变；窄菌褶杏鲍菇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，宽菌褶杏鲍菇的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的CAPS分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切电泳，成本低、通量高、特异性高，适用于杏鲍菇育种和生产实践中。

Description

鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记及其应用。
背景技术
菌褶是侧耳类食用菌子实体的重要组成部分，菌褶的宽窄也是食用菌农艺性状好坏的评判指标之一。杏鲍菇又名刺芹侧耳，学名：Pleurotus eryngii(DC.) Quél，隶属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科，具有降血脂、降胆固醇、防止动脉硬化和提高人体免疫力的功能，是一种广泛食用并工厂化生产的食用菌。和其他食用菌一样杏鲍菇也存在菌柄、菌盖和菌褶的分化。菌褶的宽窄是评判杏鲍菇子实体品质优良与否的重要依据，市面上以窄菌褶为优。因此，在品种选育过程对杏鲍菇菌褶宽窄性状的预判显得十分重要。
目前，还未见有关于杏鲍菇菌褶宽窄的分子标记报道，科研人员要判断一个新菌株或者育种材料的菌褶宽窄只能通过漫长而复杂的栽培实验，等待其子实体长大后才能知道菌褶的性状；整个过程至少需要3-4个月，且需要专业的栽培技术人员在特定的出菇环境下进行培养。因此，在育种实践中，有必要寻找快速鉴别杏鲍菇菌褶宽窄的方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记及其应用，该分子标记可对菌褶宽窄不同的杏鲍菇进行鉴定，在实际应用中，只需PCR结合酶切电泳，成本低、通量高、特异性好，适用于育种和生产实践中。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明第一个目的是提供一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记，该分子标记在Scaffold004的686907-686908处存在2个连续的SNP位点，该SNP位点为T/A和T/C的碱基突变；窄菌褶杏鲍菇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，宽菌褶杏鲍菇的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列如下：
AATACTACTCAACACCTGCCTTGACACGCTATTTCGATCACATTCAGTCACAAGCAGTCGTCCGACAAGCTGCTGGAAA TT TTTCTCCCGATTTTGCACCGGTATCATTCGATTTTGACTCTGCGCCCAAGCCCGAACGCAAAGCCGAGCTTTCAAAGAAGAAAAAGAAAGCAGATCCCGTCGCTGCCGAAGACAAACCCGCTCAGGCTAAGGAGACTGCAGCAGCCGCAGCGTCTTCATCTGCCCCACCTGAGCAAGGGAAACAGCAGAAGAAAGAGAAGAAGGAGAAAAAGAAAGATGCTGGTTCCGAGTCGGCAAAGAAGGGAGCTGCTGCAGAGCCTGCTGATGCTGGTGAACCTGTTCCGTCTATGATTGATTTGCGCGTTGGACATATAGTGGACAGTGCGTATCCGCTCGTAATCAATTCTTACATGCATGGTTCTATACTCATCACCACCCCCCCAAAAAAGTCAAAAAGCACCCAGACGCTGATAGCTTGTATGTTGAGGTGG（SEQ ID NO.1）
AATACTACTCAACACCTGCCTTGACACGCTATTTCGATCACATTCAGTCACAAGCAGTCGTCCGACAAGCTGCTGGAAA AC TTTCTCCCGATTTTGCACCGGTATCATTCGATTTTGACTCTGCGCCCAAGCCCGAACGCAAAGCCGAGCTTTCAAAGAAGAAAAAGAAAGCAGATCCCGTCGCTGCCGAAGACAAACCCGCTCAGGCTAAGGAGACTGCAGCAGCCGCAGCGTCTTCATCTGCCCCACCTGAGCAAGGGAAACAGCAGAAGAAAGAGAAGAAGGAGAAAAAGAAAGATGCTGGTTCCGAGTCGGCAAAGAAGGGAGCTGCTGCAGAGCCTGCTGATGCTGGTGAACCTGTTCCGTCTATGATTGATTTGCGCGTTGGACATATAGTGGACAGTGCGTATCCGCTCGTAATCAATTCTTACATGCATGGTTCTATACTCATCACCACCCCCCCAAAAAAGTCAAAAAGCACCCAGACGCTGATAGCTTGTATGTTGAGGTGG（SEQ ID NO.2）
上述有下划线部分为酶切位点序列，斜体加粗为SNP位点。
本发明第二个目的是提供一种用于检测上述CAPS分子标记的引物组，该引物组的序列为：
正向引物：5’-AATACTACTCAACACCTGCC-3’（SEQ ID NO.3）；
反向引物：5’-CCACCTCAACATACAAGCTA-3’（SEQ ID NO.4）。
本发明第三个目的是提供一种应用，将上述CAPS分子标记或引物组用于鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状。
本发明第四个目的是提供一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。
本发明第五个目的是提供一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样本的基因组DNA；
（2）采用上述引物组对基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（3）将PCR扩增产物进行酶切，然后电泳，若得到512bp、435bp、77bp三个条带，则说明样本为窄菌褶杏鲍菇；若仅得到512bp一个条带，说明样本为宽菌褶杏鲍菇。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，PCR扩增体系为：2×Mix 10μL，F引物1μL，R引物1μL，模版DNA 0.5μL，双蒸水7.5μL。
进一步，PCR扩增程序为：95℃预热3min；30个循环：95℃ 15s，55℃ 15s，72℃30s；最后72℃延伸5min。
进一步，酶切体系为：10×Buffer 2μL，内切酶Apo I 0.4μL，PCR产物1μL，双蒸水16.6μL。
进一步，酶切程序为：37℃ 15min，80℃ 20min。
进一步，电泳程序为：1%琼脂糖凝胶电泳，恒压：150v、200A，跑胶时间30分钟。
本发明第六个目的是提供一种筛选或辅助筛选具有宽/窄菌褶性状的杏鲍菇的方法，包括：按照上述鉴别方法来筛选或辅助筛选具有宽/窄菌褶性状的杏鲍菇。
本发明第七个目的是提供一种窄菌褶杏鲍菇的分子标记育种方法，包括：将上述筛选得到的具有窄菌褶性状的杏鲍菇作为亲本进行育种，同时可以采用上述方法快速鉴别育种所获杂交子的褶性状，筛选具备窄菌褶性状的潜在优质杂交子。
本发明具有以下有益效果：
酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）分子标记技术是基于SNP的PCR技术与RFLP技术结合的分子标记技术，简单理解就是某SNP恰好位于酶切位点上，通过对该SNP位点设计引物，经PCR扩增后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性。CAPS属于共显性标记，能够获得其它分子标记技术不能显示的更加丰富的多态性，检测周期只需要6-8小时，不依赖传统检测中人的主观经验，可以在短时间内获得准确的检测鉴别结果。
本发明将杏鲍菇Scaffold004的686907-686908处存在2个连续的SNP位点开发成CAPS分子标记，并根据该分子标记开发引物，进而用于鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状。
采用本发明提供的引物对菌褶宽窄不同的杏鲍菇进行鉴定，结果显示只有窄菌褶杏鲍菇的PCR扩增产物经内切酶Apo I酶切后呈现特异条带，而宽菌褶杏鲍菇的PCR扩增产物经内切酶Apo I酶切后则不会有特异条带，说明本发明设计的引物能将杏鲍菇的特异性基因片段扩增出来，并经过酶切加以区分。
本发明提供的CAPS分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于杏鲍菇育种和生产实践中。
附图说明
图1为PCR扩增产物经酶切后的电泳结果图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记和引物的开发
鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记和引物的开发，具体过程如下：
对杏鲍菇样品按宽菌褶性状和窄菌褶性状进行分类（以菌褶最宽处的宽度为测量标准，小于3mm记为窄菌褶，大于等于3mm记为宽菌褶），然后获取对这些杏鲍菇样品的菌丝，进行二代基因组建库测序，测序数据经过软件FastQC质控后，使用软件BWA（Burrows-Wheeler Aligner）与参考菌株组“183”的全基因组序列（GCA_001717165.1）进行逐一比对，然后通过GATK（Genome Analysis Toolkit，4.2.6.1）软件筛选和过滤变异信息，剔除置信度低的变异位点，最后通过可视化软件IGV（Integrative Genomics Viewer，2.6.3）明确宽窄菌褶两种性状杏鲍菇各自特有的变异位点，以及两种性状杏鲍菇的不同变异位点，利用两种性状杏鲍菇在Scaffold004的686907-686908处存在的SNP位点和酶切位点开发引物。
杏鲍菇宽菌褶和窄菌褶菌株在Scaffold004的686907-686908处存在2个连续的SNP位点，该SNP位点为T/A和T/C的碱基突变，突变后的位点失去被限制性内切酶Apo I酶切识别的特征序列。其中，在窄菌褶菌株中表现为杂合基因型，同时具备SEQ ID NO.1和SEQID NO.2两条不同序列；在宽菌褶菌株中表现为纯合基因型，仅具备SEQ ID NO.2序列；SEQID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列均为512bp。推测可利用上述分子标记去鉴定杏鲍菇窄菌褶和宽菌褶菌株。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2具体序列如下：
AATACTACTCAACACCTGCCTTGACACGCTATTTCGATCACATTCAGTCACAAGCAGTCGTCCGACAAGCTGCTGGAAA TT TTTCTCCCGATTTTGCACCGGTATCATTCGATTTTGACTCTGCGCCCAAGCCCGAACGCAAAGCCGAGCTTTCAAAGAAGAAAAAGAAAGCAGATCCCGTCGCTGCCGAAGACAAACCCGCTCAGGCTAAGGAGACTGCAGCAGCCGCAGCGTCTTCATCTGCCCCACCTGAGCAAGGGAAACAGCAGAAGAAAGAGAAGAAGGAGAAAAAGAAAGATGCTGGTTCCGAGTCGGCAAAGAAGGGAGCTGCTGCAGAGCCTGCTGATGCTGGTGAACCTGTTCCGTCTATGATTGATTTGCGCGTTGGACATATAGTGGACAGTGCGTATCCGCTCGTAATCAATTCTTACATGCATGGTTCTATACTCATCACCACCCCCCCAAAAAAGTCAAAAAGCACCCAGACGCTGATAGCTTGTATGTTGAGGTGG（SEQ ID NO.1）
AATACTACTCAACACCTGCCTTGACACGCTATTTCGATCACATTCAGTCACAAGCAGTCGTCCGACAAGCTGCTGGAAA AC TTTCTCCCGATTTTGCACCGGTATCATTCGATTTTGACTCTGCGCCCAAGCCCGAACGCAAAGCCGAGCTTTCAAAGAAGAAAAAGAAAGCAGATCCCGTCGCTGCCGAAGACAAACCCGCTCAGGCTAAGGAGACTGCAGCAGCCGCAGCGTCTTCATCTGCCCCACCTGAGCAAGGGAAACAGCAGAAGAAAGAGAAGAAGGAGAAAAAGAAAGATGCTGGTTCCGAGTCGGCAAAGAAGGGAGCTGCTGCAGAGCCTGCTGATGCTGGTGAACCTGTTCCGTCTATGATTGATTTGCGCGTTGGACATATAGTGGACAGTGCGTATCCGCTCGTAATCAATTCTTACATGCATGGTTCTATACTCATCACCACCCCCCCAAAAAAGTCAAAAAGCACCCAGACGCTGATAGCTTGTATGTTGAGGTGG（SEQ ID NO.2）
上述有下划线部分为酶切位点序列，斜体加粗为SNP位点。
针对上述分子标记开发的引物序列如下：
正向引物：5’-AATACTACTCAACACCTGCC-3’（SEQ ID NO.3）；
反向引物：5’-CCACCTCAACATACAAGCTA-3’（SEQ ID NO.4）。
SEQ ID NO.1序列在两个SNP位点旁邻序列具有限制性内切酶Apo I酶切识别位点：RAATTY；SEQ ID NO.2在该酶切识别位点的SNP突变为RAAACY，造成无法被限制性内切酶Apo I酶切识别，因此，根据上述序列信息，通过酶切检测条带，可判断杏鲍菇的菌褶宽窄性状。
实施例2：利用上述CAPS分子标记鉴定杏鲍菇菌褶宽窄性状
一、提取待测杏鲍菇基因组DNA
杏鲍菇菌丝培养8天后，收集菌丝，用改良CTAB法提取其基因组DNA。
二、PCR扩增
以待测杏鲍菇基因组DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。
其中，引物序列如下：
正向引物：5’-AATACTACTCAACACCTGCC-3’（SEQ ID NO.3）；
反向引物：5’-CCACCTCAACATACAAGCTA-3’（SEQ ID NO.4）。
PCR扩增体系为：2×Mix 10μL，F引物1μL，R引物1μL，模版DNA 0.5μL，双蒸水7.5μL；
PCR扩增程序为：95℃预热3min；30个循环：95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s；最后72℃延伸5min。
三、酶切鉴定
将上述扩增得到的PCR产物用内切酶Apo I进行酶切，酶切体系为：10×Buffer 2μL，内切酶0.4μL，PCR产物1μL，双蒸水16.6μL；酶切程序为：37℃ 15min，80℃ 20min。将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统检测结果，电泳结果见图1。
现从多种待测样品检测结果中选择部分检测结果来进行说明，其电泳检测结果见图1，该电泳结果对应的样品说明见表1。
表1 样品来源
由图1可知，当用Apo I酶对2个SNP位点所在序列进行酶切后，窄菌褶菌株的SEQID NO.1序列会被酶切为77bp和435bp大小的DNA片段，SEQ ID NO.2序列则不被酶切，通过凝胶电泳可看到512bp、435bp、77bp处的三个条带；而宽菌褶菌株仅具备SEQ ID NO.2序列，无法被酶切，凝胶电泳仅有512bp处1个条带。由此来鉴定杏鲍菇的段菌褶和宽菌褶菌株。最终鉴定结果为：Pe005、Pe006、Pe008、Pe009、Pe011、Pe014、Pe020、Pe024为窄菌褶的杏鲍菇菌株，Pe015、Pe016、Pe019、Pe025为宽菌褶的杏鲍菇菌株。
实施例3：
为了验证实施例2中鉴定结果的准确性，我们对上述待测样本Pe005、Pe006、Pe008、Pe009、Pe011、Pe014、Pe020、Pe024、Pe015、Pe016、Pe019、Pe025的菌褶宽窄进行测量。测量前，上述待测样本均是在相同的工厂化栽培条件下栽培，在生长至菌盖平展但未完全展开时进行测量，测量结果见表2。
表2 待测样本菌褶宽度
由表2可知，Pe005、Pe006、Pe008、Pe009、Pe011、Pe014、Pe020、Pe024的菌褶宽度均小于3mm，为窄菌褶，Pe015、Pe016、Pe019、Pe025的菌褶宽度均大于3mm，为宽菌褶。该结果与实施例2中采用分子标记鉴定结果一致，说明本发明提供的分子标记、引物和鉴别方法可特异性鉴别杏鲍菇的长/窄菌褶性状，为杏鲍菇育种提供实用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的共显性CAPS分子标记，其特征在于，所述CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，该分子标记在Scaffold004的686907-686908处存在2个连续的SNP位点，该SNP位点为T/A和T/C的碱基突变；窄菌褶杏鲍菇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，宽菌褶杏鲍菇的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种用于检测权利要求1所述的CAPS分子标记的引物组，其特征在于，该引物组的序列为：
正向引物：5’-AATACTACTCAACACCTGCC-3’；
反向引物：5’-CCACCTCAACATACAAGCTA-3’。
3.权利要求1所述的CAPS分子标记或权利要求2所述的引物组在鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状方面的应用。
4.一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组。
5.一种鉴别杏鲍菇菌褶宽窄性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样本的基因组DNA；
（2）采用权利要求2所述的引物组对基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（3）将PCR扩增产物进行酶切，然后电泳，若得到512bp、435bp、77bp三个条带，则说明样本为窄菌褶杏鲍菇；若仅得到512bp一个条带，说明样本为宽菌褶杏鲍菇。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系为：2×Mix 10μL，F引物1μL，R引物1μL，模板DNA 0.5μL，双蒸水7.5μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：95℃预热3min；30个循环：95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s；最后72℃延伸5min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，酶切体系为：10×Buffer 2μL，内切酶ApoI 0.4μL，PCR产物1μL，双蒸水16.6μL。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，酶切程序为：37℃ 15min，80℃ 20min。
10.一种窄菌褶杏鲍菇的分子标记育种方法，其特征在于，按照权利要求5-9任一项方法筛选得到具有窄菌褶性状的杏鲍菇作为亲本进行育种。
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Title
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