CN1167153A

CN1167153A - 银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立

Info

Publication number: CN1167153A
Application number: CN 97109154
Authority: CN
Inventors: 孙天恩
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 1997-12-10

Abstract

本发明公开了一种银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，它是以银杏叶片或根皮为材料，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒的T-DNA整合到银杏细胞核DNA中，表达形成毛状根，经过多次继代培养和筛选，逐步建立起银杏发根悬浮培养无性系。银杏发根做为一种新的银杏资源，不仅可以克服人工种植银杏树生长周期长和培养细胞生长缓慢的局限性，银杏发根培养还可以工业化生产，用于提取天然银杏药物。

Description

银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立

本发明公开了一种银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，开辟了一个再生银杏资源的新途径，为用银杏发根生产天然药物提供了可能。本发明技术属生物技术领域，也属医药技术领域。

银杏(Ginkgo bilobaL.)是我国特有的、多用途的珍贵树种。银杏资源特别是银杏叶片的开发国内外均逐渐产业化，此乃是银杏及其制剂有很高的药用价值所致。如银杏黄酮有抗自由基，抑制脂质过氧化，降血脂和增加脑血流量的作用；银杏内酯是特异的血小板活化因子(PFA)拮抗剂。银杏叶片提取物制剂对于脑功能障碍，智力功能衰退，降低血清胆固醇，增加冠状动脉血流量，改善脑营养，有很好的保健作用。在治疗心血管，脑血管，抗衰老，抗痴呆等疾病中，具有目前其它药物难于替代和难于达到的功效，而且无任何副作用。研究表明，银杏内酯在治疗哮喘，内毒素休克，器官移植排异反应及多种炎症方面均有潜在应用价值；此外，还有白果内酯，聚异戊烯醇等成分都是十分珍贵的药用资源。银杏提取物不仅可做药品，还可制成保健品，食品及化妆品(刘桂霞等：国外医药》。植物药分册，1994年第9卷第一期，10～14)。

目前，国内外主要是从银杏叶片中提取银杏黄酮和银杏苦内酯等有效成分。但天然资源受气候的影响，季节性强，病虫害及霉变的侵扰都会影响银杏叶的产量和质量；扩大银杏种植，必定与粮争地，而我国的土地资源十分有限；从提取工艺来说，银杏叶的工艺提取环节多，费时费力成本高等，而且各地银杏叶的品质(即有效成分的含量)又有差异。

近些年来，随着生物技术的发展，韩国，日本，加拿大等国科学家开始了银杏细胞悬浮培养的研究，有的还申请了专利(Hah-Dok Remedia Ind.Co.LTD.KR/KR，WO93/02204，1993.2.4.)。据悉这方面的研究已引起美国，澳大利亚，德国，法国等国科学家的重视。这是因为：第一，天然银杏资源毕竟有限，并有其固有的缺陷；第二，银杏中含有无法替代的、特效的、高经济价值的药用成分；第三，时至今日，将生物技术应用于银杏上是顺理成章的事情。

本发明的目的是：为了克服人工种植银杏树的局限性，如生长周期长、一年只能采收一次、受气候及病虫害影响大，质量不稳定以及提取工艺较复杂等：为了克服培养细胞生长速度慢，遗传上不够稳定及培养较复杂等；利用银杏发根培养技术提取银杏天然药物。在多年研究工作积累的基础上，考虑到生物技术作为二十一世纪高技术的核心地位，我们拟用Ri质粒转化银杏，目前国内外均未见转化银杏发根成功的报道。

为实现本发明所采取的技术措施是：

本发明以银杏叶片或根皮等外植体为材料，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒的T-DNA整合到银杏外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，也称之为发根(hairy root)；每一根发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起银杏发根悬浮培养无性繁殖系。具体步骤如下：

1材料：

取新鲜、健康富含银杏黄酮和银杏内酯的银杏叶片或根皮和已有的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株：pRil5834，pRiA4，R1000等。

2转化：

(1)发根农杆菌的活化：将各菌株先后在酵母牛肉膏(YEB)固体或液体培养液中，26±1℃下，于暗中活化2～3次，每次培养16～24h；

(2)外植体灭菌：取当年银杏叶片或根皮，洗净，切成0.5cm²小块或0.5×1.0cm小段，用0.1％升汞灭菌10分钟，无菌水冲洗三次，每次不少于5分钟，然后吸干表面水分；

(3)感染：将灭菌后的银杏叶片或根皮段外植体，浸入活化后的发根农杆菌菌液(1×10⁷～10^-8个/ml)内，感染20min～2h。因银杏是古老的裸子植物，在分类上单科单属单种，遗传上十分保守，不易为发根农杆菌所感染，为提高感染和转化频率，我们附加了不包括银杏的植物发根浸出液，及某些二价金属离子等，感染毕，用无菌蒸馏水冲洗五次，以去除表面多余菌液，最后吸干表面水分。

(4)将感染后银杏的叶片或根皮放入无激素含抗菌素的1/2～1/4MS(系用该培养基配方发明人Murashige和Skoog两人名字字头命名，国际通用)固体培养基上，25±1℃，暗中或散射光下培养。大约20～50天即可陆续诱导出发根。

3培养：

(1)切割下外植体上长出的发根，置于1/2～1/4MS无激素培养基上培养并繁殖3～5代，10～20天继代一次；

(2)扩大繁殖：在100～1000ml三角瓶，100ml加30ml培养液，500ml三角瓶加150ml培养液，1000ml三角瓶加300ml培养液，30ml培养液中约加0.3克发根。

(3)银杏发根培养无性系的建立：经3～5代液体悬浮适应性培养后，按发根克隆来源分别建立不同的发根无性繁殖系。

与已有技术相比较，本发明已达到的技术效果：

与银杏叶片比较：银杏发根为一运用生物技术产生的新的银杏资源，它不需要占用耕地；不受自然条件(天气、病虫害等)的影响；不象叶片一年只采收1～2次，银杏发根可望工业集约化生产，可以周年不断地提供银杏资源，并能保证质量的稳定。由于银杏发根是在人工控制下的无菌培养，生长周期短，因此前处理工艺成本较低。

与银杏培养细胞比较：银杏发根生长较其细胞快5～15倍；分化程度较高既利于次生代谢产物的合成，遗传上又较稳定；由于一条发根即是一个克隆，因此进行发根优化筛选十分方便；银杏细胞培养必需添加外源生长激素，而其发根培养可不必添加任何外源激素，因外源激素可能对人体有害；鉴于上述原因银杏发根培养较银杏细胞方便，其培养成本较低。

此外，运用本发明的银杏发根产生的愈伤组织还可筛选出激素自主型银杏细胞悬浮培养无性系。

银杏发根具体生物学特征如下：

1 发根生长形态和农杆碱的鉴定：

转化的银杏发根无向地性，随机交叉‘无序’生长，多‘根毛’，多分枝，生长快，较银杏培养细胞鲜重增长快五～十五倍，具有典型的转化发根特征(见附图)。

农杆碱的鉴定表明Ri质粒的确整合到银杏细胞核DNA上，因为发根农杆菌所含冠瘿碱合成酶基因只能在真核生物中表达。

2 生长曲线：

为一典型S形曲线。在相同的条件下，银杏发根较细胞早两天进入对数生长期，14天可增长三十倍，而银杏细胞18天仅增长十倍。

3 银杏发根培养基的筛选：

在对常用的多种培养基进行比较的基础上，对银杏发根培养基进行了优化筛选。发现银杏发根在我们自行设计的银杏发根培养基(YXFG1)上生长最好，较常用的1/2MS鲜重增加高80～200％。该培养基配方(mg/L)为：KNO₃ 1200～3000；CaCl₂·2H₂O 100～500；MgSO₄·7H₂O 150～450；NH₄NO₃ 100～300；KH₂PO₄ 100～400；KI 0.5～1.5；H₃BO₃2～8；MnSO₄·H₂O 5～25；ZnSO₄·7H₂O 1～10；Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.5；CuSO₄·5H₂O 0.01～0.4；CoCl₂·6H₂O 0.01～0.4；Na·EDTA 10～40；FeSO₄·7H₂O；肌醇50～1000；烟酸0.5～5；盐酸硫胺素0.5～10；盐酸吡哆醇0.25～2.0；蔗糖1～4％；pH 4.5～6.0 。

4 培养液pH对银杏发根生长的影响

银杏培养发根对pH有较宽的适应能力：其最适范围为pH4.5～6.0，对低pH(4.0以下)较敏感。

5 蔗糖浓度对银杏发根生长的影响

在发根培养中，蔗糖的作用有二：一是作为碳源和能源，二是调节培养液渗透浓度。我们的研究表明，银杏发根培养液最适蔗糖浓度在1.0％～40％。低于1.0％对银杏发根生长不利。

6 外源激素对银杏发根生长的影响

银杏发根在无激素培养液中完全可以正常生长。若为了某种需要加适量的IAA和GA对其生长和增殖有一定的促进作用；适量的NAA对银杏发根的生长也有促进作用，鉴于NAA等外源激素对人体健康不利故不宜使用。

7 银杏发根中的无机元素

我们利用原子吸收光谱法分析了K、Na、Ca、Mg、Mn、Cu、Fe、Zn、Cr、sr、se、Li、Co、Ni、Ag、Cd、Pb和Hg等18种无机元素。发现：银杏发根对K、Na、Ca、Mg、Mn、Zn、Se等元素有较强的富集作用，一般较银杏叶片中高2～20余倍，而Cd、pb、As、Hg等有害元素的含量均在影响人类健康水平以下。

8 银杏发根次生代谢物质

我们先后用硅胶层析、聚酰胺薄层层析和HPLC对银杏发根、银杏细胞及银杏叶片进行了对比分析。结果表明，银杏发根保留了合成银杏黄酮和银杏内酯的功能。

(1)银杏黄酮：银杏发根中银杏黄酮的含量为4.89～84.7×10^-3％，银杏细胞中为2.87～8.83×10^-3％，银杏叶片中为0.28～0.65％(均为干重)。

(2)银杏内酯：银杏发根中银杏内酯的含量为2.52～51.3×10^-3％，银杏细胞中为2.15～24.1×10^-3％，银杏叶片中为0.05～0.20％(均为干重)。

(3)抗菌试验：试验表明银杏发根的培养液和提取液都有很强的抗污染能力。

附图说明：

附图是转化银杏发根培养的实物照片。

下面结合实施例对本发明作进一步详细叙述：

实施例：

取新鲜健康银杏树上的幼叶，洗净。切成0.5cm²小块，在0.1％HgCl₂灭菌10分钟，无菌水洗三次；然后放入已活化了的发根农杆菌pRil5834菌液中(其中加入胡罗卜发根浸出液和Mn⁺²)，感染60分钟，无菌水洗三次；将感染后的叶片放入含抗菌素(氨苄青霉素0.5g/L)无激素的1/2MS培养基上，25±1℃、黑暗或散射光下培养。大约20～50天即可陆续长出银杏发根。将长发根切成1cm的小段，置于上述含抗菌素的无激素1/2MS固体培养基上进行除菌培养。然后在无抗菌素无激素1/2MS培养基上继代培养3～5代，再转入无激素的1/2MS培养液中，继代培养3～5次，经过适当筛选即可逐步建立起银杏发根悬浮培养无性系。培养条件均为：温度25±1℃，自然散射光下。

Claims

1.一种银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，其特征在于：本发明是以包括银杏叶片或根皮的外植体为材料，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒的T-DNA整合到银杏外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，也称之为发根；每一根银杏发根即为一个单克隆，经过继代培养和多次筛选，逐步建立起银杏发根悬浮培养无性系。

2.按权利要求1所述银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，其特征在于：灭菌后的银杏叶片或根皮外植体的感染，是将外植体浸入活化了的发根农杆菌菌液(≥1×10⁶个/ml到1×10⁸个/ml)中，感染时间为20分钟到2小时；并加入适量不包括银杏的植物发根浸出液和二价金属离子。

3.按权利要求1所述银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，其特征在于：被感染的外植体培养在含抗菌素无激素≥0.25到0.5MS固体培养基上，在≥24℃到26℃，于暗中或散射光下，培养时间为≥20天到50天，诱导银杏出发根。

4.按权利要求1所述银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，其特征在于：诱导出的发根需继代扩增，≥10到20天继代一次；对各发根克隆进行反复比较选择；并经≥3～5代液体悬浮适应性培养，再按银杏发根克隆来源分别建立不同的发根无性繁殖系。

5.按权利要求1所述银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，其特征在于；筛选出新的银杏发根培养基(YXFGl)配方，较MS培养基的效果好≥100～300％。YXFGl成分(mg/L)如下：KNO₃1200～3000；CaCl₂·2H₂O100～500；MgSO₄·7H₂O150～450；NH₄NO₃ 100～300；KH₂PO₄ 100～400；KI0.5～1.5； H₃BO₃ 2～8；MnSO₄·H₂O 5～25； ZnSO₄·7H₂O 1～10； Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.5；CuSO₄·5H₂O 0.01～0.4；CoCl₂·6H₂O 0.01～0.4；Na·EDTA 10～40；FeSO₄·7H₂O；肌醇50～1000；烟酸0.5～5；盐酸硫胺素0.5～10；盐酸吡哆醇0.25～2.0；蔗糖1～4％；pH4.5～6.0。

6.按权利要求1所述银杏发根的转化及其无性繁殖系建立的原理，运用银杏发根产生愈伤组织可制备和筛选出激素自主型银杏细胞悬浮培养无性系。