CN116694710A - 制备多类型胶原弹性蛋白肽的方法、由该方法制备的多类型胶原弹性蛋白肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备胶原弹性蛋白肽的方法、由该方法制备的胶原弹性蛋白肽及其用途。所述方法包括如下步骤：1)制备总蛋白粗提物；2)制备胶原弹性蛋白粗提物；3)将澄清剂加入步骤2)得到的胶原弹性蛋白粗提物中，调节pH值，搅拌均匀后静置，制得胶原弹性蛋白精制物；4)将步骤3)得到的胶原弹性蛋白精制物调节pH值，加入复合蛋白酶酶解，再加入酵母菌发酵，得到酶解液；5)将步骤4)得到的酶解液经过滤和干燥得到胶原弹性蛋白肽。所制得的胶原弹性蛋白肽安全、无毒副作用，易于消化，所含胶原蛋白肽类型相对较多，与人胶原蛋白具有类似组成，可作为药品、食品特别是保健食品、和化妆品以及食品的原料等，能够添加至酸性饮料中，可用于改善皮肤健康。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备胶原弹性蛋白肽的方法、由该方法制备的胶原弹性蛋白肽及其用途。
背景技术
胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物大分子蛋白质，广泛存在于动物体内，其含量为动物体内蛋白含量的三分之一左右，是细胞外基质的重要组成部分，对细胞、组织乃至器官行使正常功能以及损伤修复都有重大影响。
目前已发现了至少49种不同的胶原蛋白多肽链，可以形成的胶原蛋白类型已增加至28种，如表1所示。根据胶原原纤维的特征，胶原蛋白可分为带有周期性横纹的原纤胶原蛋白和没有周期性横纹的非原纤胶原蛋白两大类，其中原纤胶原蛋白约占胶原蛋白总数的90％，包括I、II、III、V、VI、XXIV和XXVII型胶原蛋白，其余种类均为非原纤胶原蛋白，非原纤胶原蛋白又可进一步分为FACIT族、网状、念珠状等6种。根据在体内的分布，胶原蛋白又可分为间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原，由于胶原蛋白多存在于细胞间质中，故间质胶原蛋白占整个机体胶原的绝大部分，包括I、II和III型胶原蛋白分子。
人体胶原蛋白根据组织部位、生理功能、分子结构不同而分为28种以上胶原蛋白，占比最多、研究最透彻的为I型、II型和III型胶原蛋白。
表1胶原蛋白分类、组成及其在组织中的分布情况
胶原蛋白本身是大分子的蛋白质，不溶于水、醇，不容易被人体消化吸收。胶原蛋白肽是将胶原蛋白通过酶解的方式降解为小分子肽，容易被人体消化吸收。据报道，胶原蛋白肽具有改善面部肤质、减少细纹、提高皮肤中水分等作用。此外，胶原蛋白肽还具有缓解骨关节炎和健康骨骼的功效。不同类型的胶原蛋白的作用不同，如I型胶原蛋白在人体中分布最广，III型胶原蛋白主要是稀疏的网状结构，IV型胶原蛋白是构成基底膜的重要成分，V型胶原蛋白可以组成复杂的交联结构，VI型胶原蛋白的主要作用是维持细胞质基质结构和功能等。目前市场上销售的胶原蛋白肽以I型胶原蛋白为主。
弹性蛋白也是人体重要的结构蛋白，胶原蛋白能够给予细胞外基质强度和韧性，而弹性蛋白特殊的交联和疏水结构赋予其良好的弹性和延展性，使组织器官维持水润弹性。随着年龄的增长，或者遗传缺陷、长期各种辐射、炎症等的影响，弹性蛋白不断损失，造成相应组织器官病变，如皮肤出现松弛和皱纹。
发明内容
本发明提供制备胶原弹性蛋白肽的方法、由该方法制备的胶原弹性蛋白肽及其用途，具体涉及以下技术方案。
方案1.一种制备胶原弹性蛋白肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备总蛋白粗提物：取动物组织为原料，以碱性溶液浸泡后，进行匀浆化得到总蛋白粗提物；
2)制备胶原弹性蛋白粗提物：将步骤1)得到的总蛋白粗提物调节pH值，加热，保温提胶，得到胶原弹性蛋白粗提物；
3)制备胶原弹性蛋白精制物：将澄清剂加入步骤2)得到的胶原弹性蛋白粗提物中，调节pH值，搅拌均匀后静置，制得胶原弹性蛋白精制物；所述澄清剂包含质量比为1:2-4:0.2-1:0.3-4的透明质酸钠、木薯淀粉、胡麻胶和刺云实胶；
4)制备胶原弹性蛋白酶解液：将步骤3)得到的胶原弹性蛋白精制物调节pH值，加入复合蛋白酶酶解，再加入酵母菌发酵，得到酶解液；所述复合蛋白酶包含质量比为1:2-5:2-3的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和风味酶，所述酵母菌包含质量比为1:1-3的面用酵母和酒用酵母；
5)制备胶原弹性蛋白肽：将步骤4)得到的酶解液经过滤和干燥得到胶原弹性蛋白肽。
方案2.根据方案1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述动物组织原料为动物的皮、鳞、骨、内脏或者壳膜中的一种或更多种。
方案3.根据方案1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述碱性溶液为0.1-2质量％氢氧化钠水溶液，所述浸泡的时间为2-8小时。
方案4.根据方案1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述原料在碱性溶液浸泡结束之后，以去离子水进行清洗，然后加入适量软化水，并在研磨机中匀浆化至糊状。
方案5.根据方案1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述调节pH值后的pH值为2-4，所述加热的温度为75-90℃，所述保温提胶的时间为3-8小时。
方案6.根据方案1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述澄清剂的加入量为以动物组织原料的重量为基准的1-10重量％，优选地为6-8重量％。
方案7.根据方案1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述调节pH值后的pH值为2-7，优选地为2-5；所述静置的时间为2-8小时，优选地为2-5小时。
方案8.根据方案1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述复合蛋白酶的加入量为以动物组织原料的重量为基准的0.1-2重量％，优选地为1-1.5重量％。
方案9.根据方案1-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述调节pH值后的pH值为5-8.5，优选地为6.5-8；所述酶解的温度为50-60℃，所述酶解的时间为2-6小时。
方案10.根据方案1-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述木瓜蛋白酶的酶活力为80-240U/g，优选地为180-240U/g；所述无花果蛋白酶的酶活力为20-80U/g，优选地为50-80U/g；所述风味酶的酶活力为3-8U/g，优选地为4-6U/g。
方案11.根据方案1-10中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述酵母菌的加入量为以动物组织原料的重量为基准的0.1-1.5重量％，优选地为0.5-1重量％。
方案12.根据方案1-11中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述酵母菌发酵的温度为30-40℃，所述酵母菌发酵的时间为1-2小时。
方案13.根据方案1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述过滤采用错流过滤系统过滤再纳滤，所述干燥采用喷雾干燥。
方案14.根据方案1-13中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述错流过滤系统采用改良聚醚砜(PSE)或陶瓷膜作为滤膜。
方案15.根据方案1-14中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述错流过滤系统的功率为4-16KW，所述错流过滤系统的过滤能力为4-40吨/小时。
方案16.通过根据方案1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽。
方案17.通过根据方案1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽在制备用于改善皮肤健康的制剂中的用途。
方案18.根据方案17所述的用途，其特征在于，所述改善皮肤健康的制剂是药品、食品或化妆品。
方案19.制剂，其包含通过根据方案1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽。
方案20.根据方案19所述的制剂，其为药品、食品或化妆品。
方案21.酸性饮料，其包含通过根据方案1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽。
在本发明的一些实施方式中，所制备的胶原弹性蛋白肽是多类型的胶原弹性蛋白肽，含胶原蛋白肽类型相对较多，并含有弹性蛋白肽，能发挥不同类型的胶原蛋白以及弹性蛋白的功效。
附图说明
通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中：
图1为根据实施例1制得的肽产品的质谱图。
图2为根据对比例1制得的肽产品的质谱图。
具体实施方式
除非上下文中有相反说明，否则本发明中的术语具有如下含义。
术语“具有”、“包含”和“包括”应解释为开放式的，表明存在所列举的要素但不排除未列举的任何其他一个或多个要素的存在、出现或添加。
本文叙述的所有范围包括列举两个值之间的范围的那些端点，除非另有相反说明。不管是否指出，本文所列举的所有值包括用于测量该值的给定技术的预期实验误差、技术误差和仪器误差的程度。
在本申请说明书中，术语“约”在限定数值时，表示所规定数值的±5％。
在本申请说明书中，如无特别说明，则百分率“％”表示质量％。
在本申请说明书中，如无特别说明，则在任何一个由两个以上氨基酸组成的序列中，序列的左端为N端，序列的右端为C端。
在本申请说明书中，术语“胶原”和“胶原蛋白”具有相同的含义，指胶原纤维经过部分降解后得到的具有较好水溶性的蛋白质。
术语“胶原弹性蛋白”指包含胶原蛋白和弹性蛋白的蛋白混合物。
术语“胶原弹性蛋白肽”指包含胶原蛋白肽和弹性蛋白肽的多肽混合物。术语“胶原蛋白肽”是指胶原蛋白通过蛋白酶解的作用降解而成的小分子肽。术语“弹性蛋白肽”是指弹性蛋白通过蛋白酶解的作用降解而成的小分子肽。
术语“面用酵母”是根据GB/T 20886.1-2021标准定义的面用酵母，指具有发酵力的用于米、面等食品加工的食品加工用酵母。在本发明的一些实施方式中，可以使用的面用酵母例如为来自安琪酵母股份有限公司的风味型活性干酵母。
术语“酒用酵母”是根据GB/T 20886.1-2021标准定义的酒用酵母，指具有发酵产生酒精能力或产生酒体所需特有风味，用于白酒、啤酒、葡萄酒、黄酒、果酒等饮料酒和酒精发酵的食品加工用酵母。在本发明的一些实施方式中，可以使用的酒用酵母例如为来自安琪酵母股份有限公司的黄酒高活性干酵母。
本发明的一个方面提供一种制备胶原弹性蛋白肽的方法，包括如下步骤：
1)制备总蛋白粗提物：取动物组织原料，以碱性溶液浸泡后，进行匀浆化得到总蛋白粗提物；
2)制备胶原弹性蛋白粗提物：将步骤1)得到的总蛋白粗提物调节pH值，加热，保温提胶，得到胶原弹性蛋白粗提物；
3)制备胶原弹性蛋白精制物：将澄清剂加入步骤2)得到的胶原弹性蛋白粗提物中，调节pH值，搅拌均匀后静置，制得胶原弹性蛋白精制物；所述澄清剂包含透明质酸钠、木薯淀粉、胡麻胶和刺云实胶；
4)制备胶原弹性蛋白酶解液：将步骤3)得到的胶原弹性蛋白精制物调节pH值，加入复合蛋白酶酶解，再加入酵母菌发酵，得到酶解液；所述复合蛋白酶包含木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和风味酶；和
5)制备胶原弹性蛋白肽：将步骤4)得到的酶解液经过滤和干燥得到胶原弹性蛋白肽。
本发明，对获取原料的动物没有特别限定。在本发明的一些实施方式中，例如可以为牛、猪、狗、羊、鸡、鸭、鹅、兔、鱼等，只要能获得所述动物的皮、鳞、骨、内脏或者壳膜中的一种或更多种即可。优选地，所述动物可以为鱼，例如可以为鲫鱼、鲟鱼、鱿鱼、吻鲈鱼、罗非鱼等，特别为罗非鱼。所述动物组织可以为例如鱼皮、鱼鳞、鱼骨和鱼内脏等中的一种或更多种。在一些实施方式中，所述动物组织为鱼皮、鱼鳞、鱼骨和鱼内脏，特别为罗非鱼的鱼皮、鱼鳞、鱼骨和内脏。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，所述碱性溶液为氢氧化钠水溶液，其浓度为约0.1-2质量％，诸如约0.1质量％、约0.5质量％、约1质量％、约1.5质量％、约2质量％，更优选为约2质量％；所述浸泡的时间为约2-8小时，诸如约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8小时，优选为约2-6小时，更优选为约2小时。所述原料在碱性溶液浸泡结束之后，以去离子水进行清洗2-3次，然后加入适量软化水，并在研磨机中匀浆化至糊状。
在本发明的一些实施方式中，对于调节pH值，使用的酸可以是有机酸或无机酸，诸如有甲酸、乙酸、乳酸和柠檬酸等，其中最常使用的为乙酸；使用的碱可以是有机碱或无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钠等，其中最常使用的为氢氧化钠。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，所述调节pH值后的pH值为约2-4，诸如约2、约3或约4，更优选地为约2；所述加热的温度为约75-90℃，诸如约75℃、约80℃、约85℃、约90℃，更优选地为约75℃；所述保温提胶的时间为约3-8小时，诸如约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时或约8小时，更优选地为约3小时。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，所述调节pH值后的pH值为约2-7，优选地为约2-5，诸如约2、约3、约4或约5，更优选地为约2；所述静置的时间为约2-8小时，优选地为约2-5小时，诸如约2小时、约3小时、约4小时、约5小时，更优选地为约4小时；所述澄清剂的加入量可为以动物组织原料的重量为基准的约1-10重量％，优选地为约6-8重量％，诸如约1质量％、约2质量％、约3质量％、约4质量％、约5质量％、约6质量％、约6.5质量％、约7质量％、约8质量％、约9质量％、约10质量％。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，所述澄清剂为透明质酸钠、木薯淀粉、胡麻胶和刺云实胶；透明质酸钠、木薯淀粉、胡麻胶和刺云实胶的质量比为约1:2-4:0.2-1:0.3-4，优选地为约1:3:0.5:2。
术语“蛋白酶”指水解蛋白质肽键一类酶的总称。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。在本发明的一些实施方式中，使用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和风味酶。术语“复合蛋白酶”指包含二种及以上的蛋白酶的酶复合体。
术语“风味酶”(Flavourzyme)也称为风味蛋白酶、复合风味酶、氨肽酶，是由米曲霉菌株发酵，经过微滤、超滤浓缩、干燥等制得，其包含了多肽外切与内切两种活性酶，主要应用于降低或避免水解过程中苦味肽的产生，或将苦味肽等降解为氨基酸，增进或改进水解物的口感风味。风味酶可以通过商购获得。在本发明的一些实施方式中，所述复合蛋白酶包含的酶的种类、加入量和酶活力可以根据实际酶解的需要合理地确定。
在本发明的一些实施方式中，步骤4)中，所述复合蛋白酶的加入量可为以动物组织原料的重量为基准的约0.1-2重量％，优选地为约1-1.5重量％，更特别地为诸如约1.2重量％；所述pH值调节可为约5-8.5，优选地为约6.5-8，诸如约6.5、约7、约7.5、约8，更优选地为约7.5；所述酶解的温度可为约50-60℃，诸如约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃，更优选地为约55℃；所述酶解的时间为约2-6小时，诸如约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时，更优选地为约4小时。
在本发明的一些实施方式中，步骤4)中，所述木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和风味酶的质量比可为1:2-5:2-3，诸如1:2:2，1:2:3，1:3:2，1:3:3，1:4:2，1:4:3，1:5:2，1:5:3；优选地为1:2:3；80-240U/g，优选地为180-240U/g；所述无花果蛋白酶的酶活力可为20-80U/g，优选地为50-80U/g；所述风味酶的酶活力可为3-8U/g，优选地为4-6U/g。
在本发明的一些实施方式中，所述酵母菌包含的酵母的种类、加入量和活力可以根据实际发酵的需要合理地确定。
在本发明的一些实施方式中，步骤4)中，所述酵母菌的加入量可为以动物组织原料的重量为基准的约0.1-1.5重量％，优选地为约0.5-1重量％，更特别地为诸如约0.6重量％；所述酵母菌发酵的温度可为约30-40℃，诸如约30℃、约31℃、约32℃、33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃，优选地为约35℃，所述酵母菌发酵的时间可为约1-2小时。
在本发明的一些实施方式中，步骤4)中，所述酵母菌为面用酵母和酒用酵母中的一种或两种。优选地，所述酵母菌为面用酵母和酒用酵母的组合。在本发明的一些实施方式中，所述面用酵母和酒用酵母的质量比可以为约1:1-3，优选为约1:2。在本发明的一些实施方式中，所述面用酵母为来自安琪酵母股份有限公司的风味型活性干酵母；所述酒用酵母为来自安琪酵母股份有限公司的黄酒高活性干酵母。更特别地，所述风味型活性干酵母的活细胞数为10亿/个。更特别地，所述黄酒高活性干酵母的发酵度数为15.5-20％(v/v)，优选17-20％(v/v)，活细胞率为80％以上，活细胞数为2.0×1010个/g。
在本发明的一些实施方式中，步骤5)中，所述过滤和干燥的步骤为：先采用错流过滤系统过滤，再纳滤以去除无机盐和水溶性游离氨基酸，最后喷雾干燥。
在本发明的一些实施方式中，步骤5)中，所述错流过滤系统采用改良聚醚砜(PSE)或陶瓷膜。特别地，所述错流过滤系统的功率为4-16KW，所述错流过滤系统的过滤能力为4-40吨/小时。
本发明的另一方面提供由根据本发明方法制备的胶原弹性蛋白肽。
本发明人在将上述制备的胶原弹性蛋白肽进行深入检测分析并归纳之后发现，根据本发明的方法制备的胶原弹性蛋白肽含有多种类型的由特定序列组成的肽。
在本发明的一些实施方式中，通过本发明的方法得到的胶原弹性蛋白肽可采用质谱方法进行鉴定所含胶原蛋白肽对应的胶原蛋白类型。例如，液相色谱-质谱可以由美国Thermo Fisher公司Vanquish液相和Orbitrap Exploris 480质谱组成；数据采集与处理软件为Xcalibur 4.4。例如，检测条件如下：
色谱条件：色谱柱：Peptide BEH C18流动相：A-水(0.1％甲酸)；B-60％乙腈(0.1％甲酸)；梯度：0-60min，5-40％B；60-85min，40-90％B；85-98min，90％B；98-100min，90-5％B；100-110min，5％B；流速：0.2mL/min；柱温：60℃；进样量：5μL。质谱条件：ESI电离；喷雾电压：4.5kV；壳气流速：60arb(约400kPa)；扫描范围(m/z)：400-2000；正离子监测模式；二级质谱扫描(MS/MS)均为数据依赖性扫描；二级质谱碰撞能量为35％。
通过本发明方法得到的胶原弹性蛋白肽中，所含弹性蛋白肽可采用检测弹性蛋白特征性的氨基酸锁链素和异锁链素的方法进行鉴定。例如，检测方法如下：
色谱条件：Agilent LC(1200系列)系统，流速0.3mL/min，自动进样室温度4℃；C18(3μm，2.1mm*150mm)柱，柱温箱温度40℃。流动相A：5mM乙酸铵和7mM HFBA的水溶液，流动相B：5mM乙酸铵、7mM HFBA和5％乙腈的水溶液。柱子使用流动相A平衡，进样量20μL，洗脱程序：0-9min 100％流动相B，9-16min 100％流动相A。分析完成后使用80％乙腈清洗系统。质谱条件：三种四级杆质谱检测仪(Agilent G6410B)SRM，正离子模式。定量526.3→481.3(DES)，526.3→397.3(IDS)，碰撞能：DES37eV，IDS33eV，碰撞电压150V，氮气流速12L/min，氮气温度350℃，毛细管电压3.5kV，保留时间200ms。
本发明的再一方面提供通过本发明方法制备的所述胶原弹性蛋白肽在制备用于改善皮肤健康的制剂中的用途。
本发明中，对所述制剂的形式没有特别限制。例如，所述制剂可以是药品，例如经胃肠道给药的剂型如常用的散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂等，或者所述制剂可以是非经胃肠道给药的剂型如注射剂、贴剂等。所述制剂也可以是食品、特别是保健食品。所述食品可以是例如速溶食品、方便食品、酸奶、乳饮料、蛋白饮料、营养棒(例如蛋白质棒)、强化口香糖、糖果、零食等。所述制剂也可以是化妆品，例如面霜、面膜等。优选地，所述制剂是适合口服的制剂。
另外，所述制剂可以中至高剂量施用，例如以15-120mg/kg体重/天、更优选以20-100mg/kg体重/天、进一步优选以30-80mg/kg体重/天的剂量施用。
相应地，本发明的再一方面提供制剂，其包含通过本发明方法制备的胶原弹性蛋白肽。
在本发明的一些实施方式中，通过本发明方法制备的所述胶原弹性蛋白肽可添加至酸性饮料中，而不产生絮凝和沉淀。在本文中，术语“酸性饮料”指pH值为约5.0以下的饮料。例如，所述酸性饮料可以是pH值为约2.5-5.0的饮料，诸如pH值为约2.5-4.3的饮料。
相应地，本发明的再一方面提供酸性饮料，其包含通过本发明方法制备的胶原弹性蛋白肽。
在本发明的一些实施方式中，所制得的胶原弹性蛋白肽是多类型的胶原弹性蛋白肽，所含胶原蛋白肽类型相对较多，并含有弹性蛋白肽，因此能发挥多种不同类型的胶原蛋白以及弹性蛋白的功效，从而有益于改善皮肤健康，诸如可用于延缓组织老化。所制得的胶原弹性蛋白肽特别可用于药品，食品特别是保健食品，化妆品，食品原料等。在一些实施方式中，所制得的胶原弹性蛋白肽安全、无毒副作用，易于消化。在一些实施方式中，所制得的胶原弹性蛋白肽能够添加至酸性饮料中，不易产生絮凝和沉淀。
实施例
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
实施例中，原料和试剂的来源如下：
透明质酸钠由华熙生物提供，木薯淀粉由济南亿博化工提供，胡麻胶由上海味庆生物科技有限公司提供，刺云实胶由上海味庆生物科技有限公司提供，所有酶制剂(包括木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、风味酶)均由广西东恒华道生物技术有限公司提供，所有酵母(包括面用酵母、酒用酵母)均由安琪酵母股份有限公司提供。
实施例1
由如下步骤制备胶原弹性蛋白肽：
1)称取罗非鱼鱼皮30g、鱼鳞20g、鱼骨20g和内脏30g共计100g原料,加入2％氢氧化钠溶液浸泡2小时，清洗2次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
2)将总蛋白粗提物调节pH值为2，加热至75℃，保温提胶3小时，制得胶原弹性蛋白粗提物，为溶液460g，其固形物含量为6.5％；
3)将澄清剂(透明质酸钠1g、木薯淀粉3g、胡麻胶0.5g和刺云实胶2g)混合加入所得胶原弹性蛋白粗提物中，调节pH值为2，搅拌均匀后静置4小时，制得胶原弹性蛋白精制物，为溶液380g，其固形物含量为6.2％；
4)向所得胶原弹性蛋白精制物中加入复合蛋白酶(木瓜蛋白酶0.2g、无花果蛋白酶0.4g和风味酶0.6g)，pH值为7.5，酶解温度为55℃，酶解时间为4小时。然后调整温度到35℃，加入0.2g面用酵母(风味型活性干酵母)和0.4g酒用酵母(黄酒高活性干酵母)，发酵1小时，得到胶原弹性蛋白酶解液；
5)将所得酶解液采用错流过滤系统过滤，所述错流过滤系统的滤膜采用改良聚醚砜(PSE)或者陶瓷膜，所述错流过滤系统功率为约16KW，过滤能力为约40吨/小时，再纳滤去除小分子物质如盐和游离氨基酸，纳滤的滤膜孔径为1-10nm，喷雾干燥后得到胶原弹性蛋白肽。
实施例1的胶原弹性蛋白肽的质谱图见附图1。其中对应于各类型胶原蛋白的胶原蛋白肽的情况见表2。
表2对实施例1胶原弹性蛋白肽检测的各类型胶原多肽峰面积及比例
*表示被羟基化修饰的氨基酸
/表示未测出
表3对实施例1胶原弹性蛋白肽检测的锁链素和异锁链素的检测结果
| 名称 | 百分含量％ |
| 锁链素 | 0.02 |
| 异锁链素 | 0.01 |
如表2和表3结果所示，根据本发明方法制得的胶原弹性蛋白肽含有对应于多达十五种胶原蛋白的胶原蛋白肽，对应胶原蛋白类型较齐全，且包含弹性蛋白肽。
对比例1
由如下步骤制备胶原弹性蛋白肽：
1)罗非鱼鱼皮30g、鱼鳞20g、鱼骨20g和内脏30g共计100g原料，加入2％氢氧化钠溶液浸泡2小时，清洗2次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
2)将所得总蛋白粗提物调节pH值为2，加热至75℃，保温提胶3小时，制得胶原弹性蛋白粗提物；
3)将澄清剂(透明质酸钠1g、木薯淀粉0.5g、胡麻胶1.5g和刺云实胶2g)混合加入所得胶原弹性蛋白粗提物中，调节pH值为2，搅拌均匀后静置4小时，制得胶原弹性蛋白精制物；
4)加入复合蛋白酶(木瓜蛋白酶0.2g、无花果蛋白酶0.2g和风味酶0.2g)，pH值为7.5，酶解温度为55℃，酶解时间为4小时。然后调整温度到35℃，加入0.2g面用酵母(风味型活性干酵母)和0.1g酒用酵母(黄酒高活性干酵母)，发酵1小时，得到胶原弹性蛋白酶解液。
5)将所得酶解液采用错流过滤系统过滤，所述错流过滤系统的滤膜采用改良聚醚砜(PSE)或者陶瓷膜，再通过纳滤去除小分子物质如盐和游离氨基酸，喷雾干燥后得到肽产品。对比例1的肽产品的质谱图见附图2。
表4对对比例1制得的产品检测的各类型胶原多肽峰面积及比例
/表示未测出
表5对对比例1制得的产品检测的锁链素和异锁链素的检测结果
| 名称 | 百分含量％ |
| 锁链素 | / |
| 异锁链素 | / |
/表示未测出
如表4和表5所示，对比例1制得的产品只包含对应于很有限类型的胶原蛋白的胶原蛋白肽，且所含弹性蛋白肽低至未能有效测出。
实验例-皮肤实验
实验方法：征集年龄在30-40岁之间，体重45-60kg的女性12人为志愿者，将志愿者随机分为对照组和实验组两组，每组各6人，进行双盲随机实验。对照组每人每天口服3g对比例1得到的产品，实验组每人每天口服3g实施例1得到的产品，以1个月为实验周期，期满后检测实验前后志愿者皮肤的水分、油分、弹性指标以及进行皮肤皱纹评分。
水分油分检测方法采用德国soft5.5；弹性指标采用MPA580；皱纹评分采用RolandBazin提出的皮肤皱纹分级标准。实验结果见表6。
表6皮肤实验
由表6中的数据可见，对照组志愿者实验前后皮肤状态差别不明显，实验组志愿者实验后的皮肤状态明显好于实验前。
综上所述，根据本发明方法制得的胶原弹性蛋白肽，具有胶原蛋白类型更多、更齐全的胶原蛋白肽，以及弹性蛋白肽，从而能发挥多种不同类型的胶原蛋白以及弹性蛋白的功效，因此可有利地用于改善皮肤健康。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
Claims (21)
1.一种制备胶原弹性蛋白肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备总蛋白粗提物：取动物组织为原料，以碱性溶液浸泡后，进行匀浆化得到总蛋白粗提物；
2)制备胶原弹性蛋白粗提物：将步骤1)得到的总蛋白粗提物调节pH值，加热，保温提胶，得到胶原弹性蛋白粗提物；
3)制备胶原弹性蛋白精制物：将澄清剂加入步骤2)得到的胶原弹性蛋白粗提物中，调节pH值，搅拌均匀后静置，制得胶原弹性蛋白精制物；所述澄清剂包含质量比为1:2-4:0.2-1:0.3-4的透明质酸钠、木薯淀粉、胡麻胶和刺云实胶；
4)制备胶原弹性蛋白酶解液：将步骤3)得到的胶原弹性蛋白精制物调节pH值，加入复合蛋白酶酶解，再加入酵母菌发酵，得到酶解液；所述复合蛋白酶包含质量比为1:2-5:2-3的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和风味酶，所述酵母菌包含质量比为1:1-3的面用酵母和酒用酵母；
5)制备胶原弹性蛋白肽：将步骤4)得到的酶解液经过滤和干燥得到胶原弹性蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述动物组织原料为动物的皮、鳞、骨、内脏或者壳膜中的一种或更多种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述碱性溶液为0.1-2质量％氢氧化钠水溶液，所述浸泡的时间为2-8小时。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述原料在碱性溶液浸泡结束之后，以去离子水进行清洗，然后加入适量软化水，并在研磨机中匀浆化至糊状。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述调节pH值后的pH值为2-4，所述加热的温度为75-90℃，所述保温提胶的时间为3-8小时。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述澄清剂的加入量为以动物组织原料的重量为基准的1-10重量％，优选地为6-8重量％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述调节pH值后的pH值为2-7，优选地为2-5；所述静置的时间为2-8小时，优选地为2-5小时。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述复合蛋白酶的加入量为以动物组织原料的重量为基准的0.1-2重量％，优选地为1-1.5重量％。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述调节pH值后的pH值为5-8.5，优选地为6.5-8；所述酶解的温度为50-60℃，所述酶解的时间为2-6小时。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述木瓜蛋白酶的酶活力为80-240U/g，优选地为180-240U/g；所述无花果蛋白酶的酶活力为20-80U/g，优选地为50-80U/g；所述风味酶的酶活力为3-8U/g，优选地为4-6U/g。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述酵母菌的加入量为以动物组织原料的重量为基准的0.1-1.5重量％，优选地为0.5-1重量％。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述酵母菌发酵的温度为30-40℃，所述酵母菌发酵的时间为1-2小时。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述过滤采用错流过滤系统过滤再纳滤，所述干燥采用喷雾干燥。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述错流过滤系统采用改良聚醚砜(PSE)或陶瓷膜作为滤膜。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述错流过滤系统的功率为4-16KW，所述错流过滤系统的过滤能力为4-40吨/小时。
16.通过根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽。
17.通过根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽在制备用于改善皮肤健康的制剂中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述改善皮肤健康的制剂是药品、食品或化妆品。
19.制剂，其包含通过根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽。
20.根据权利要求19所述的制剂，其为药品、食品或化妆品。
21.酸性饮料，其包含通过根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的胶原弹性蛋白肽。
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