CN116694489A - 一种产倍半萜瓦伦烯工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种产倍半萜瓦伦烯工程菌及其构建方法与应用。所述产倍半萜瓦伦烯工程菌通过在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合融合基因I得到；所述融合基因I从5’端至3’端，依次含有1个法尼基焦磷酸合酶基因ERG20、1个连接肽基因GGGS和1个瓦伦烯合酶基因CnVS。所述产倍半萜瓦伦烯工程菌所整合的融合基因采用了适用于融合倍半萜瓦伦烯的连接肽，同时限定了与法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的连接顺序，有效提高了倍半萜瓦伦烯的产量。

Description

一种产倍半萜瓦伦烯工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本申请涉及一种产倍半萜瓦伦烯工程菌及其构建方法与应用，属于微生物代谢工程及工业生物技术领域。
背景技术
瓦伦烯(valencene)是一种天然的倍半萜，是柑橘属的特征香气成分，用作食品和饮料中的添加剂，每年的市场量约为10,000公斤，并且在化妆品行业中也成为了一种受欢迎的香气化合物。更重要的是，瓦伦烯可以被氧化成诺卡酮，一种具有抗炎，抗菌性，抗肿瘤和神经保护作用的高附加值的化合物。从天然来源提取得到的瓦伦烯得率较低(0.2％-0.6％)，且该过程需要使用到大量的有机试剂进行萃取。从柑橘属中提取瓦伦烯也易受害虫，土地利用和气候变化等环境因素的影响。通过化学合成法生产倍半萜瓦伦烯，通常涉及有毒重金属，易污染化合物。并且倍半萜复杂的结构为化学合成带来难度。近年来生物技术和生物合成的快速发展，加速了微生物细胞工厂构建，为天然产品提供了一种替代方法。生物合成不仅更为环保和可持续性，而且还符合风味化合物的“天然”的要求。2003年，Liat等人在巴伦西亚柑橘中发现了瓦伦烯合酶Cstps1，但在野生型酵母中仅能合成0.002mg/L瓦伦烯。2014年，Beekwilder等人从阿拉斯基黄杉中发现瓦伦烯合酶CnVS，在野生型酵母中表达可合成瓦伦烯1.4mg/L。2019年，陈和锋等人通过对合成瓦伦烯的甲羟戊酸途径进行强化、弱化甾醇竞争途径以及敲除ROX1后，工程菌在3L发酵罐中通过分批补料136h合成539mg/L瓦伦烯。目前所构建工程菌株产量还比较低，难以满足市场需求。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种产倍半萜瓦伦烯工程菌，所述产倍半萜瓦伦烯工程菌所整合的融合基因采用了适用于融合倍半萜瓦伦烯的连接肽，同时限定了与法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的连接顺序，有效提高了倍半萜瓦伦烯的产量。
一种产倍半萜瓦伦烯工程菌，所述产倍半萜瓦伦烯工程菌通过在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合融合基因I得到；
所述融合基因I从5’端至3’端，依次含有1个法尼基焦磷酸合酶基因ERG20、1个连接肽基因GGGS和1个瓦伦烯合酶基因CnVS。
可选地，所述融合基因I的拷贝数为1～10。
可选地，所述融合基因的拷贝数为3～4；
可选地，所述融合基因的拷贝数为3。
可选地，所述融合基因的拷贝数为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述产倍半萜瓦伦烯工程菌通过在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合DNA片段I得到；
所述DNA片段I为PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2。
可选地，所述DNA片段I的整合位点为XI-1。
可选地，还在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合DNA片段II；
所述DNA片段II为PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2。
可选地，所述DNA片段II的整合位点为XI-8。
可选地，还在酿酒酵母出发菌株中导入DNA片段III；
DNA片段III选自PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2、TDIT1-CnVS-GGGS-ERG20-PGAL10-1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2中的任一种；
可选地，所述DNA片段II的整合位点为XI-7。
可选地，其特征在于，还敲除酿酒酵母出发菌株的转录因子ROX1。
可选地，所述瓦伦烯合酶基因CnVS的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
可选地，所述酿酒酵母出发菌株选自野生型酿酒酵母或酿酒酵母菌株CCV06中的任一种。
可选地，所述野生型酿酒酵母选自S288C菌株、CEN.PK113-11C菌株中的任一种。
根据本申请的一个方面，提供上述所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
利用CRISPR/Cas9法将融合基因I整合到酿酒酵母出发菌株的染色体上，得到所述产倍半萜瓦伦烯工程菌。
可选地，利用CRISPR/Cas9法将DNA片段I整合到酿酒酵母出发菌株的XI-1位点。
可选地，还利用CRISPR/Cas9法将DNA片段II整合到酿酒酵母出发菌株的XI-8位点。
可选地，还利用CRISPR/Cas9法将DNA片段II整合到酿酒酵母出发菌株的XI-7位点。
可选地，还利用CRISPR/Cas9法将酿酒酵母出发菌株的转录因子ROX1敲除。
根据本申请的一个方面，提供所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌、根据上述所述的构建方法得到的产倍半萜瓦伦烯工程菌在制备倍半萜瓦伦烯中的应用。
本发明从全局代谢构建酵母细胞工厂，实现瓦伦烯高效合成。首先优化瓦伦烯合酶的表达方式，提高其生物合成效率；其次增加瓦伦烯合酶的表达量，提高瓦伦烯合成的代谢流；最后敲除抑制萜类合成途径的转录因子。本发明中构建的重组工程菌进一步提高了瓦伦烯的产量，使得酿酒酵母中瓦伦烯产量在摇瓶中合成336mg/L，在摇瓶中分批补料发酵达到1.2g/L，发酵罐批式补料达到5.2g/L。
本申请公开一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用。所述方法包括以下步骤：所述重组酵母工程菌多拷贝融合表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS；所述表达是直接融合表达或使用连接肽进行融合表达；所述连接肽为GGGS或GSG；所述构建方法包括在染色体上优化表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数；所述重组酵母菌的构建是将染色体上游同源臂、启动子、ERG20、CnVS、终止子和染色体下游同源臂按照顺序融合，转化到酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母或解脂耶氏酵母中得到的；所述构建方法包括敲除宿主菌株的ROX1基因。所述构建方法优化了工程菌瓦伦烯合酶的表达量，有利于提高瓦伦烯的产率。
本发明要解决的技术问题克服目前工程菌中代谢流不平衡的难题，全局代谢调控瓦伦烯的生物合成效率，提供了一种生产倍半萜瓦伦烯的酵母工程菌及其应用。
作为一种实施方案，提供一种工程菌的构建方法，所述构建方法增加了宿主菌株的瓦伦烯代谢流，有利于提高瓦伦烯的产量。
一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
所述重组酵母工程菌多拷贝表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS。
可选地，所述表达是直接表达或使用连接肽进行融合表达。
可选地，所述连接肽为GGGS或GSG。
可选地，所述构建方法包括在染色体上优化表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数。
可选地，所述重组酵母菌的构建是将染色体上游同源臂、启动子、ERG20、CnVS、终止子和染色体下游同源臂按照顺序融合，转化到酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母或解脂耶氏酵母中得到的。
可选地，所述构建方法包括敲除宿主菌株的ROX1基因。
作为一种实施方案，提供根据上述任一项所述的构建方法构建得到的工程菌。
作为一种实施方案，提供根据上述任一项所述的构建方法构建得到的工程菌、上述所述的工程菌中的至少一种在制备瓦伦烯中的应用。
作为一种实施方案，本申请提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用，所述融合表达是将来源于阿拉斯基黄杉中的瓦伦烯合酶基因CnVS经密码子优化后融合在来源于工程菌本身的法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的N端。
作为一种实施方案，本申请提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用，所述连接肽为GGGS或GSG。
作为一种实施方案，本申请提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用，所述构建方法包括通过在染色体XI-1，XI-8，XI-7分别对融合表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS进行了一个，两个和三个拷贝的表达。
作为一种实施方案，本申请提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用，所述重组酵母菌的构建是将染色体上游同源臂、启动子、ERG20、CnVS、终止子和染色体下游同源臂按照顺序融合，转化到酿酒酵母CEN.PK 11-11C中得到的。
作为一种实施方案，本申请提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用，所述构建方法包括敲除工程菌株本身的ROX1基因。
本申请所提供的工程菌的构建方法，提供了适用于融合倍半萜瓦伦烯的连接肽，优化了瓦伦烯合酶的表达方式，对其他萜类化合物的融合表达提供借鉴。
本申请所提供的工程菌的构建方法，找到了目前合成萜类化合物的代谢瓶颈，通过增加法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数，实现了代谢流的平衡。
本申请可产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的产倍半萜瓦伦烯工程菌，所整合的融合基因采用了适用于融合倍半萜瓦伦烯的连接肽，同时限定了与法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的连接顺序，有效提高了倍半萜瓦伦烯的产量。
2)本申请所提供的产倍半萜瓦伦烯工程菌，优化了磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数，实现了代谢流的平衡，有利于倍半萜瓦伦烯产量的提高。
附图说明
图1示出了代谢工程改造策略促进酿酒酵母瓦伦烯合成示意图。
图2示出了酿酒酵母CCV07合成瓦伦烯的气相色谱-质谱图，其中图2A为瓦伦烯标准品和CCV07菌株气相色谱图，图2B为瓦伦烯标准品气相质谱图，图2C为CCV07菌株气相质谱图。
图3示出了代谢工程改造酿酒酵母瓦伦烯产量情况。
图4示出了摇瓶批式补料发酵瓦伦烯的产量情况，其中A为基础成分发酵培养基；B为YPD培养基。
图5示出了发酵罐批式补料发酵瓦伦烯的产量情况。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请实施例中基于酿酒酵母菌株CCV06进行改造，酿酒酵母菌株CCV06通过在菌株SCX42菌株的基础上敲除MBP、TPS、LPPS基因得到。
菌株SCX42已经记载在专利202111539688.7中，具体构建方法如下：
以CEN.PK113-11C为出发菌，在XI-3位点整合MBP-Gly6-TPS-GGGS-LPPS融合基因(MBP的序列如SEQ ID NO：2所示，Gly6的序列如SEQ ID NO：3所示，TPS的序列如SEQ ID NO：4所示，LPPS的序列如SEQ ID NO：5所示)，敲除GAL80基因，获得工程菌CXM01*。在工程菌CXM01*中过表达截断型tHMG1基因于FAA4位点(供体DNA为FAA4up-FAA4-TAHD1-kanMX-PTHD3-tHMG1-FAA4dw)；过表达SpHMGR基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)于POX1位点(供体DNA为POX1up-POX1-TTDH2-kanMX-PtHXT7-SpHMGR-POX1dw)。将基因组上ERG20基因突变为ERG20F96C即将碱基TTC突变为TGT。将HMG2K6R和ERG10基因整合到XII-2位点(供体DNA为XII-2up-TENO2-HMG2K6R-PGAL10-1-ERG10-TPYK1-XII-2dw)；在XII-3位点整合两个拷贝的HMG2K6R(供体DNA为XII-3up-TPDC1-HMG2K6R-PGAL10-1-HMG2K6R-TENO2-XII-3dw)；将ERG9基因启动子替换为PHXT1；将BTS1和PaGGPPS(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)基因通过蛋白融合表达方式连接并整合到XI-2位点(供体DNA为XI-2up-PGAL7-BTS1-PaGGPPS-TTDH2-XI-2dw)，获得工程菌CXM17。
在CXM17的基础上，优化酿酒酵母中心代谢途径以强化前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH的供应，得到工程菌SCX38。详细过程如下所示。将ATP依赖的柠檬酸裂解酶MmACL基因、苹果酸合成酶RtME基因、去除信号肽的苹果酸脱氢酶’MDH3基因和柠檬酸转运蛋白编码基因CTP1整合到HIS3基因位点(供体DNA为HIS3up-HIS3-PTPI1-MmACL-TFBA1-PTDH3-RtME-TCYC1-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-PPGK1-CTP1-TADH1-PTEF1-‘tesA-THIS3)；将丙酮酸羧化酶基因启动子PPYC1替换为启动子PTEF1；过表达丙酮酸转运蛋白编码基因MPC1和MPC3于XI-4位点(供体DNA为XI-4up-PtHXT7-MPC3-TDIT1-TMPC1-MPC1-PTPI1-XI-4dw)；将AnACL基因(AnACLa和AnACLb)整合到X2位点(供体DNA为X2up-TCYC1-AnACLa-PGAL1-PGAL10-AnACLb-TADH1-X2dw)；将柠檬酸合成酶基因RtCIT1、异柠檬酸脱氢酶基因IDP2和柠檬酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸转运蛋白编码基因YHM2基因整合到GAL1、GAL7和GAL10位点(供体DNA为TGAL7-PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTHD3-PTEF1-YHM2-TGAL1)，即整合该DNA片段的同时敲除GAL1、GAL7、GAL10三个基因；将6磷酸葡萄糖异构酶PGI1基因启动子替换为启动子PCOX9并过表达磷酸戊糖途径GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因，供体DNA为PGI1-PCOX9-TCYC1-GND1-PTHD3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1-PGI1up；将异柠檬酸脱氢酶IDH2基因启动子PIDH2替换为启动子PGSY1。
工程菌SCX38敲除基因ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c，获得工程菌SCX42。
本申请实施例中所使用的酿酒酵母CEN.PK113-11C购自Euroscarf(Oberursel,Germany)，S288C购自Addgene。
本申请所提供的改造策略，也适用于野生型酿酒酵母菌株，例如S288C菌株。
基础成分(Delft)发酵培养基的配方：(NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 14.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，微量金属(3mg/L FeSO4·7H2O，4.5mg/L ZnSO4·7H2O，4.5mg/L CaCl2·2H2O，1mg/L MnCl2·4H2O，0.3mg/L CoCl2·6H2O，0.3mg/L CuSO4·5H2O，0.4mg/L Na2MoO4·2H2O，1mg/L H3BO3，0.1mg/L KI，19mg/L Na2EDTA·2H2O)，维生素(0.1mg/L生物素，2mg/L泛酸，2mg/L硫胺素，2mg/L吡哆酸，2mg/L烟酸，0.4mg/L氨基苯甲酸，50mg/L肌醇)，添加20g/L葡萄糖，以KOH调节初始pH为5.6)。
4ⅹDelft培养基的配方：与Delft的组分相同，除葡萄糖的浓度为500g/L外，其余组分的浓度是Delft的4倍。
丰富培养基YPD的配方：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖。
本申请代谢工程改造策略促进酿酒酵母瓦伦烯合成示意图如图1所示。
本申请的改造方法采用CRISPR/Cas9法，参考文献Yang et al.,AppliedMicrobiology and Biotechnology，2020，104：3037-3047，区别仅在于整合的染色体位置不同，使用的20bp sgRNA序列不同(XI-1:GCACTACCCTGTGCGGGGAG；XI-7:ACATGCACTGTTTTTTGT GG；XI-8:ACATGCACTGTTTTTTGTGG)。各整合位点的上、下游同源片段长度均为500bp。
本发明要解决的技术问题是克服目前工程菌中瓦伦烯合酶效率低和代谢流不平衡造成的代谢瓶颈难题，从优化瓦伦烯的合成和增加下游代谢通量出发，提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用。
作为一种实施方案，本申请提供一种提高工程菌生产倍半萜瓦伦烯的构建方法及其应用，能够显著增加瓦伦烯的产量。
所述构建方法包括：优化瓦伦烯合成酶的表达，增加融合表达法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数以及转录因子调控。
在一个具体实施方案中，分别在酿酒酵母XI-1染色体位点构建瓦伦烯合酶基因CnVS单独表达，法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS分开表达和融合表达(CnVS-GSG-ERG20,ERG20-GSG-CnVS,CnVS-GGGS-ERG20,ERG20-GGGS-CnVS)的供体DNA，融合表达的连接肽为GGGS或GSG。
进一步地，将供体DNA通过化学转化法转入工程菌CCV06，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株分别命名为CCV07，CCV14，CCV15，CCV16，CCV17，CCV18工程菌。
进一步地，经过发酵提取并检测，所得的瓦伦烯峰图如图2所示。ERG20-GGGS-CnVS融合方式最有利于瓦伦烯合成，工程菌CCV18瓦伦烯产量达到32.4mg/L(图3)。
进一步地，在工程菌CCV18的基础上，将ERG20-GGGS-CnVS在不同染色体位置进行多拷贝表达。具体实施方式如下：将ERG20-GGGS-CnVS分别在染色体XI-8和染色体XI-7位点上进行第二、第三和第四个拷贝，将供体DNA通过化学转化法转入工程菌CCV18，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株分别命名为CCV19，CCV20和CCV21。
进一步地，经过发酵提取并检测，三个拷贝ERG20-GGGS-CnVS融合最有利于瓦伦烯合成，工程菌CCV21瓦伦烯产量达到130.4mg/L(图3)。
进一步地，敲除影响萜类合成的转录因子ROX1。具体实施方式如下：构建靶向ROX1基因ORF框的sgRNA表达载体后，将供体DNA和表达载体通过化学转化法转入工程菌CCV20，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株分别命名为CCV22。
进一步地，经过发酵提取并检测，工程菌CCV22使用基础成分(Delft)培养基瓦伦烯产量达到165.7mg/L，使用YPD培养基瓦伦烯产量达到336.4mg/L(图3)。
进一步地，为了进行分批补料实验，对CCV22回补筛选标记URA3和HIS3基因获得工程菌CCV23。经过分批补料提取并检测，工程菌CCV23使用基础成分(Delft)培养基瓦伦烯产量达到0.89g/L，使用YPD培养基瓦伦烯产量达到1.2g/L(图4)。
进一步地，对工程菌CCV23生物反应器批试补料发酵，瓦伦烯产量达到5.2g/L(图5)。
实施例1合成瓦伦烯的酵母菌株构建
以酿酒酵母CEN.PK 113-11C为模板，扩增染色体上游同源臂XI-1UP，启动子GAL1，终止子TDH2t和染色体下游同源臂XI-1DOWN。瓦伦烯合酶基因CnVS经密码子优化后全基因合成获得，密码子优化后全基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。将XI-1UP，GAL1，CnVS，TDH2和XI-1DOWN融合成长片段。将XI-1sgRNA表达载体和供体DNA(XI-1UP-PGAL1-CnVS-TTDH2-XI-1DOWN)各500ng，通过化学转化法转化到酿酒酵母CCV06中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。质粒丢失后的菌株分别命名为工程菌CCV07。经过发酵提取瓦伦烯并检测确认CCV07可以从头合成倍半萜瓦伦烯。检测结果如图2所示，其中图2A为瓦伦烯标准品和CCV07菌株气相色谱图，图2B为瓦伦烯标准品气相质谱图，图2C为CCV07菌株气相质谱图。
实施例2融合表达提高瓦伦烯合酶表达
以酿酒酵母菌株CCV06为出发菌，在染色体XI-1位点分开表达ERG20和CnVS供体DNA XI-1UP-TPRM9-ERG20-PGAL10-1-CnVS-TTDH2-XI-1DOWN。供体DNA所用到的元件除CnVS外，均从CEN.PK 113-11C为模板PCR扩增获得。瓦伦烯合酶基因CnVS从密码子优化后的全基因合成的瓦伦烯质粒扩增获得。融合成长片段后将XI-1sgRNA表达载体和供体DNA(XI-1UP-TPRM9-ERG20-PGAL10-1-CnVS-TTDH2-XI-1DOWN)各500ng，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。质粒丢失后的菌株命名为工程菌CCV14。
以酿酒酵母菌株CCV06为出发菌，在染色体XI-1位点连接肽融合表达ERG20和CnVS，连接肽为GGGS(基因的碱基序列为GGTGGTGGTTCT)和GSG(基因的碱基序列为GGTTCTGGT)。供体DNA分别为XI-1UP-PGAL1-CnVS-GSG-ERG20-TTDH2-XI-1DOWN，XI-1UP-PGAL1-ERG20-GSG-CnVS-TTDH2-XI-1DOWN，XI-1UP-PGAL1-CnVS-GGGS-ERG20-TTDH2-XI-1DOWN，XI-1UP-PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-1DOWN。供体DNA所用到的元件除CnVS、GSG和GGGS外，均从CEN.PK 113-11C为模板PCR扩增获得。瓦伦烯合酶基因CnVS从密码子优化后的全基因合成的瓦伦烯质粒扩增获得。融合成长片段后将XI-1sgRNA表达载体和供体DNA各500ng，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。质粒丢失后的菌株分别命名为工程菌CCV15，CCV16，CCV17，CCV18。
对CCV07，CCV14，CCV15，CCV16，CCV17，CCV18工程菌进行发酵，发酵过程采用20mL基础成分发酵培养基/100mL摇瓶，添加2mL(10％)十二烷作为萃取剂，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm条件下发酵96h，测定瓦伦烯产量。以石竹烯作为内标，利用GC检测。如图3所示，当ERG20和CnVS以连接肽GGGS融合表达(CCV18)时瓦伦烯产量最高，达到32.4mg/L，而其他菌株中产量最高的CCV16产量也仅为27.3mg/L，明显低于CCV18。
实施例3增加法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数
在ERG20和CnVS以连接肽GGGS融合表达的CCV18工程菌基础上，优化了法尼基焦磷酸合酶基因ERG20和瓦伦烯合酶基因CnVS的拷贝数，详细过程如下所示。在染色体XI-8位点表达供体DNA XI-8UP-PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-8DOWN。供体DNA所用到的元件除CnVS和GGGS外，均从CEN.PK 113-11C为模板PCR扩增获得。瓦伦烯合酶基因CnVS从密码子优化后的全基因合成的瓦伦烯质粒扩增获得。融合成长片段后将XI-8sgRNA表达载体和供体DNA(XI-8UP-PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-8DOWN)各500ng，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。质粒丢失后的菌株命名为工程菌CCV19。发酵过程采用20mL基础成分发酵培养基/100mL摇瓶，添加2mL(10％)十二烷作为萃取剂，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm条件下发酵96h，测定瓦伦烯产量。以石竹烯作为内标，利用GC检测。如图3所示，当有两个拷贝的ERG20和CnVS以连接肽GGGS融合表达(CCV19)时瓦伦烯产量提高到58.5mg/L。
在含有两个拷贝的ERG20-GGGS-CnVS的CCV19工程菌基础上，在染色体XI-7位点对ERG20-GGGS-CnVS进行了第三和第四个拷贝的表达。在染色体XI-7位点分别表达供体DNAXI-7UP-PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-7DOWN和XI-7UP-TDIT1-CnVS-GGGS-ERG20-PGAL10-1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-7DOWN。供体DNA所用到的元件除CnVS和GGGS外，均从CEN.PK113-11C为模板PCR扩增获得。瓦伦烯合酶基因CnVS从密码子优化后的全基因合成的瓦伦烯质粒扩增获得。融合成长片段后将XI-7sgRNA表达载体和供体DNA(XI-7UP-PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-7DOWN)各500ng，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。质粒丢失后的菌株命名为工程菌CCV20。以同样的方法，将XI-7sgRNA表达载体和供体DNA(XI-7UP-TDIT1-CnVS-GGGS-ERG20-PGAL10-1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2-XI-7DOWN)转化到酿酒酵母，质粒丢失后的菌株命名为工程菌CCV21。发酵过程采用20mL基础成分发酵培养基/100mL摇瓶，添加2mL(10％)十二烷作为萃取剂，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm条件下发酵96h，测定瓦伦烯产量。以石竹烯作为内标，利用GC检测。如图3所示，当有三个拷贝的ERG20和CnVS以连接肽GGGS融合表达(CCV20)时瓦伦烯产量提高到130.4mg/L，证明下游目标产物代谢途径是主要的限速步骤且通过拷贝数增加合酶表达量的方式可以增加下游代谢通量。而含有四个拷贝ERG20-GGGS-CnVS的CCV21瓦伦烯产量为83.0mg/L，并未进一步增加瓦伦烯的产量，说明三个拷贝的ERG20-GGGS-CnVS已经达到瓦伦烯合酶的表达上限，过多的拷贝会增加代谢负担反而会降低目标产物的产量。
实施例4敲除影响萜类合成的转录因子ROX1
在工程菌CCV20敲除影响萜类合成的转录因子ROX1获得工程菌CCV22。具体实施方法如下。首先，构建靶向ROX1基因的sgRNA表达载体；然后，分别扩增ROX1基因上下游各400bp序列并通过融合PCR方法获得供体DNA片段；随后，将gRNA表达载体和基因表达盒(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株命名为工程菌CCV22，保存备用。发酵过程采用20mL基础成分发酵培养基/100mL摇瓶，添加2mL(10％)十二烷作为萃取剂，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm条件下发酵96h，测定瓦伦烯产量。以石竹烯作为内标，利用GC检测。如图3所示，当敲除转录因子ROX1(CCV22)时瓦伦烯产量提高到165.7mg/L。当将(Delft)培养基换成丰富培养基YPD时，瓦伦烯产量提高到336.4mg/L。
实施例5回补筛选标记
在基因工程改造完成后，筛选标记便不再需要，为节约发酵成本以及促进菌株正常生长，原位回补筛选标记基因URA3和HIS3，以酿酒酵母S288C基因组为模板，扩增URA3和HIS3基因表达框(基因及其上下游400bp)，通过化学转化法转化到CCV22中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子在筛选平板上再次划线纯化后经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，正确的菌株名为CCV23，保存备用。
实施例6瓦伦烯摇瓶批式补料发酵
选取工程菌CCV23进行摇瓶批式补料发酵，采用50mL发酵液/250mL锥形瓶培养体系。批式发酵时使用Delft培养基和丰富培养基，体积为50mL，接种OD600＝0.2，pH为5.6，12h后添加5mL(10％)十二烷作为萃取剂。每当批式发酵葡萄糖消耗完添加1mL 500g/L葡萄糖溶液，并且每36h用4M氢氧化钾调pH到5.6。在30℃，220rpm条件下发酵144h，测定瓦伦烯产量。以石竹烯作为内标，利用GC检测。工程菌CCV23在Delft培养基中瓦伦烯产量为0.89g/L(图4A)。在丰富培养基YPD中瓦伦烯产量为1.2g/L(图4B)。
实施例7瓦伦烯平行生物反应器批试补料发酵
批试补料发酵采用1L的DasGip平行生物反应器系统，批试发酵体积为0.4L。批试发酵采用Delft培养基(葡萄糖浓度为20g/L)，体积为0.4L，接种OD600＝0.4，pH为5.6。补料培养基采用4ⅹDelft培养基(加入葡萄糖浓度为500g/L)。添加10％的十二烷进行两相发酵。补料方式采用指数补料，μ＝0.05。批试发酵中葡萄糖耗完，即开始指数补料。
如图5所示，批试补料发酵196小时，工程菌CCV23瓦伦烯产量为5.2g/L。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种产倍半萜瓦伦烯工程菌及其构建方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccgaaa tgtttaatgg aaattctagt aacgacggtt cttcttgcat gccagttaag 60
gacgccctta ggaggaccgg aaaccaccat ccaaacttgt ggactgacga ttttattcaa 120
tctttgaata gtccatattc tgactcttct taccataaac atagagaaat ccttattgat 180
gaaattagag acatgttcag taatggagag ggagatgagt tcggtgtctt ggagaacatc 240
tggttcgtcg atgtcgttca gaggcttggt atcgatagac actttcaaga agagattaaa 300
actgcccttg attacattta taaattctgg aaccatgatt ctatctttgg tgatcttaac 360
atggtcgccc ttggttttag aattttgagg cttaacagat acgtcgccag ttctgacgtc 420
ttcaaaaaat tcaagggaga ggagggtcag ttctctggtt ttgagtcttc tgatcaagat 480
gccaagcttg agatgatgtt gaacctttac aaggcctctg agttggactt cccagatgaa 540
gacatcctta aggaggctag agcctttgcc agtatgtacc ttaaacatgt cattaaagag 600
tacggtgata tccaagaatc taaaaatcct ttgttgatgg agattgagta cacctttaag 660
tacccttgga ggtgcagact tcctaggttg gaggcttgga atttcatcca catcatgagg 720
caacaagatt gtaacattag tttggctaac aatttgtata aaattcctaa aatttatatg 780
aaaaaaatct tggaattggc tatccttgat ttcaatatcc ttcaaagtca acatcagcac 840
gagatgaaac ttatttctac ttggtggaag aacagtagtg ccatccagtt ggacttcttt 900
agacacagac acatcgaaag ttacttctgg tgggcctctc ctcttttcga gccagagttc 960
tctacttgta gaattaactg taccaaactt tctaccaaga tgttccttct tgatgatatt 1020
tatgacacct acggaaccgt cgaggagctt aagcctttca ccaccacctt gactaggtgg 1080
gatgtttcta ccgtcgacaa ccacccagat tacatgaaga tcgccttcaa tttctcttat 1140
gaaatctaca aggagatcgc cagtgaagcc gagaggaagc acggtccatt cgtctacaag 1200
tatcttcaga gttgctggaa gagttacatc gaggcctaca tgcaagaggc cgaatggatc 1260
gcctctaacc atattcccgg ttttgatgaa tacttgatga atggtgttaa gagtagtggt 1320
atgagaattt tgatgatcca cgccttgatc ttgatggaca ccccattgag tgacgaaatc 1380
cttgagcagt tggatattcc aagttctaag agtcaagctt tgctttcttt gatcactaga 1440
ttggtcgacg acgtcaagga tttcgaggac gagcaagctc acggagagat ggccagttct 1500
atcgaatgct atatgaaaga caatcatggt agtactagag aagacgctct taactacttg 1560
aaaattagaa ttgagtcttg cgtccaagaa cttaacaagg agttgcttga gccatctaac 1620
atgcacggta gtttcagaaa tctttatttg aatgtcggaa tgagagttat tttctttatg 1680
ttgaacgacg gagacctttt cacccacagt aatagaaagg aaatccaaga tgccatcacc 1740
aagttctttg tcgaacctat cattccataa 1770
<210> 2
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctaaaa ttgaagaagg taaattggtt atttggatca acggagacaa aggatacaac 60
ggtttggccg aggtcggaaa gaagttcgag aaggataccg gtatcaaggt caccgtcgag 120
cacccagaca agttggagga gaaattccca caagttgctg ccactggtga cggtccagac 180
attatcttct gggcccatga tagatttggt ggatacgccc aatctggatt gttggccgag 240
attaccccag ataaggcctt ccaagataag ttgtacccat ttacttggga cgccgtcaga 300
tacaacggta agttgatcgc ctatcctatc gccgtcgagg ccttgagttt gatctacaac 360
aaagatttgt tgcctaaccc accaaagact tgggaagaga tcccagcttt ggacaaggag 420
ttgaaggcca agggaaagtc tgcccttatg ttcaacttgc aagaaccata cttcacttgg 480
ccacttatcg ctgctgacgg tggttacgcc ttcaagtacg agaacggtaa atacgacatc 540
aaggacgtcg gtgtcgataa tgctggtgcc aaggctggat tgaccttctt ggtcgacctt 600
attaaaaata agcacatgaa tgccgatacc gactactcta tcgccgaagc cgccttcaac 660
aagggtgaaa ccgccatgac catcaacggt ccatgggctt ggtctaacat cgacaccagt 720
aaggtcaact acggtgtcac cgtccttcct accttcaagg gtcagccaag taagcctttc 780
gtcggtgtcc tttctgccgg tatcaatgcc gcttctccta acaaagagct tgccaaagag 840
ttcttggaga attacttgtt gaccgacgag ggattggagg ccgtcaacaa agataagcca 900
cttggtgccg tcgcccttaa gtcttacgag gaggagttgg ccaaggatcc aagaatcgcc 960
gctactatgg agaacgccca gaagggagaa atcatgccaa acatcccaca gatgtctgcc 1020
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gaggccttga aggatgccca aactagaatt accaaatga 1119
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggtggtg gtggtggt 18
<210> 4
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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tgtatcatcg acactttgca aagattgggt gttgaccaat tcttccaata cgaaatcaac 300
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atgatcatcg aattgtacag agctgctaac gaaagaatct acgaagaaga aagatctttg 540
gaaaagatct tggcttggac tactatcttc ttgaacaagc aagttcaaga caactctatc 600
ccagacaaga agttgcataa gttggttgaa ttctacttga gaaactacaa gggtatcact 660
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aagtctacta acagattctc taacttgtgt aacgaagact tcttggtttt cgctaagcaa 780
gacttcgaca tccatgaagc tcaaaaccaa aagggtttgc aacaattgca aagatggtac 840
gctgactgta gattggacac tttgaacttc ggtagagacg ttgttatcat cgctaactac 900
ttggcttctt tgatcatcgg tgaccatgct ttcgactacg ttagattggc tttcgctaag 960
acttctgttt tggttactat catggacgac ttcttcgact gtcatggttc ttctcaagaa 1020
tgtgacaaga tcatcgaatt ggttaaggaa tggaaggaaa acccagacgc tgaatacggt 1080
tctgaagaat tggaaatctt gttcatggct ttgtacaaca ctgttaacga attggctgaa 1140
agagctagag ttgaacaagg tagatctgtt aaggaattct tggttaagtt gtgggttgaa 1200
atcttgtctg ctttcaagat cgaattggac acttggtcta acggtactca acaatctttc 1260
gacgaataca tctcttcttc ttggttgtct aacggttcta gattgactgg tttgttgact 1320
atgcaattcg ttggtgttaa gttgtctgac gaaatgttga tgtctgaaga atgtactgac 1380
ttggctagac atgtttgtat ggttggtaga ttgttgaacg acgtttgttc ttctgaaaga 1440
gaaagagaag aaaacatcgc tggtaagtct tactctatct tgttggctac tgaaaaggac 1500
ggtagaaagg tttctgaaga cgaagctatc gctgaaatca acgaaatggt tgaataccat 1560
tggagaaagg ttttgcaaat cgtttacaag aaggaatcta tcttgccaag aagatgtaag 1620
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acttctccac aacaatctaa ggaagacatg aagtctttcg ttttctga 1728
<210> 5
<211> 2358
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacttctg ttaacttgtc tagagctcca gctgctatca ctagaagaag attgcaattg 60
caaccagaat tccatgctga atgttcttgg ttgaagtctt cttctaagca tgctccattg 120
actttgtctt gtcaaatcag accaaagcaa ttgtctcaaa tcgctgaatt gagagttact 180
tctttggacg cttctcaagc ttctgaaaag gacatctctt tggttcaaac tccacataag 240
gttgaagtta acgaaaagat cgaagaatct atcgaatacg ttcaaaactt gttgatgact 300
tctggtgacg gtagaatctc tgtttctcca tacgacactg ctgttatcgc tttgatcaag 360
gacttgaagg gtagagacgc tccacaattc ccatcttgtt tggaatggat cgctcatcat 420
caattggctg acggttcttg gggtgacgaa ttcttctgta tctacgacag aatcttgaac 480
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caagacttgc catacgacca tccattgatc aaggaaatcg ctgacactaa gcaacaaaga 720
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gaaggtttgg gtgacttgga atgggaaaga ttgttgaagt tgcaatctgg taacggttct 840
ttcttgactt ctccatcttc tactgctgct gttttgatgc atactaagga cgaaaagtgt 900
ttgaagtaca tcgaaaacgc tttgaagaac tgtgacggtg gtgctccaca tacttaccca 960
gttgacatct tctctagatt gtgggctatc gacagattgc aaagattggg tatctctaga 1020
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caagacggta agttctcttg ttacatcggt caatctgttg aatctgcttc tccaatgtac 1260
aacttgtaca gagctgctca attgagattc ccaggtgaag aagttttgga agaagctact 1320
aagttcgctt tcaacttctt gcaagaaatg ttggttaagg acagattgca agaaagatgg 1380
gttatctctg accatttgtt cgacgaaatc aagttgggtt tgaagatgcc atggtacgct 1440
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tggatcggta agtctttcta cagaatgcca gaaatctcta acgacactta caaggaattg 1560
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tcttacttct tggctgctgc tactatcttc gaaccagaaa gaactcaaga aagattgttg 1740
tgggctaaga ctagaatctt gtctaagatg atcacttctt tcgttaacat ctctggtact 1800
actttgtctt tggactacaa cttcaacggt ttggacgaaa tcatctcttc tgctaacgaa 1860
gaccaaggtt tggctggtac tttgttggct actttccatc aattgttgga cggtttcgac 1920
atctacactt tgcatcaatt gaagcatgtt tggtctcaat ggttcatgaa ggttcaacaa 1980
ggtgaaggtt ctggtggtga agacgctgtt ttgttggcta acactttgaa catctgtgct 2040
ggtttgaacg aagacgtttt gtctaacaac gaatacactg ctttgtctac tttgactaac 2100
aagatctgta acagattggc tcaaatccaa gacaacaaga tcttgcaagt tgttgacggt 2160
tctatcaagg acaaggaatt ggaacaagac atgcaagctt tggttaagtt ggttttgcaa 2220
gaaaacggtg gtgctgttga cagaaacatc agacatactt tcttgtctgt ttctaagact 2280
ttctactacg acgcttacca tgacgacgaa actactgact tgcatatctt caaggttttg 2340
ttcagaccag ttgtttga 2358
<210> 6
<211> 1302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgactggta aaacaggtca tattgatggt ttaaattcta ggattgaaaa aatgagagat 60
ttagacccag cacaaagatt agttagagtt gctgaagcgg caggtttgga accagaagct 120
atttcagctt tggcaggtaa tggtgctttg cctttgtctt tggctaatgg tatgattgaa 180
aatgttattg gtaaatttga attaccattg ggtgttgcaa caaattttac tgttaatggt 240
agggattatt taattccaat ggcagttgaa gaaccatctg ttgttgcagc tgcatcttat 300
atggctagga ttgcaagaga aaatggtggt tttactgctc atggtactgc tcctttaatg 360
agggctcaaa ttcaagttgt tggtttgggt gatccagaag gtgcaagaca aagattatta 420
gcacataaag cagcatttat ggaagcagct gatgcagttg atcctgtttt agttggtttg 480
ggtggtggtt gtagggatat tgaagttcat gtttttagag atactcctgt tggtgctatg 540
gttgttttac atttaattgt tgatgttaga gatgcaatgg gtgctaatac agttaatact 600
atggcagaaa gattggctcc agaagttgaa aggattgctg gtggtacagt tagattaagg 660
attttgtcta atttagctga tttaagatta gttagggcta gagttgaatt ggctccagaa 720
actttaacaa ctcaaggtta tgatggtgca gatgttgcta ggggtatggt tgaagcatgt 780
gcattagcaa ttgttgatcc ttatagggca gctacacata ataaaggtat tatgaatggt 840
attgatcctg ttgttgttgc tacaggtaat gattggaggg ctattgaagc aggtgcacat 900
gcttatgctg ctaggacagg tcattatact tctttaacta gatgggaatt agcaaatgat 960
ggtaggttag ttggtactat tgaattacca ttagctttgg gtttagttgg tggtgcaact 1020
aaaactcatc caacagcaag ggcagctttg gcattaatgc aagttgaaac tgcaacagaa 1080
ttagctcaag ttacagctgc tgttggtttg gcacaaaata tggctgcaat tagagcatta 1140
gctactgaag gtattcaaag gggtcacatg actttacatg caaggaatat tgcaattatg 1200
gcaggtgcta caggtgctga tattgatagg gttactagag ttattgttga agcaggtgat 1260
gtttcagttg ctagagctaa acaagttttg gaaaatacat aa 1302
<210> 7
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgctttcta ccggtctttc tttgtctcca gtccactcta acgagggaaa ggaccttcag 60
agggtcgata ctgaccacat cttcttcgag aaggccgtct tggaggctcc ttacgactac 120
atcgcctcta tgccttctaa gggagttaga gaccaattca tcgacgcctt gaacgactgg 180
ttgagggtcc cagatgtcaa ggtcggtaaa atcaaggacg ccgttagagt cttgcataac 240
tcttctttgt tgttggacga cttccaagat aactctcctt tgaggagggg taagccatct 300
acccacaata tcttcggttc tgcccagacc gttaacaccg ccacctacag tatcattaag 360
gccatcggtc agatcatgga gttctctgct ggtgagtctg tccaagaagt catgaacagt 420
atcatgattt tgttccaagg tcaagctatg gacttgttct ggacctacaa cggacacgtc 480
ccttctgagg aggagtacta tagaatgatc gaccagaaga ccggacagtt gttcagtatc 540
gccaccagtt tgcttcttaa cgccgctgac aacgagatcc caaggaccaa gatccagagt 600
tgcttgcaca gattgactag attgcttggt aggtgcttcc agattagaga cgactatcag 660
aacttggtca gtgccgacta caccaagcag aagggtttct gcgaagactt ggacgaggga 720
aagtggtctt tggccttgat ccacatgatc cacaaacaaa gaagtcacat ggccttgctt 780
aacgtcttgt ctaccggtag gaagcacggt ggtatgactt tggagcagaa gcaatttgtt 840
ttggatatta ttgaagaaga aaagtctttg gattatacta ggagtgtcat gatggacttg 900
cacgtccagc ttagggctga gatcggtagg atcgagatct tgcttgactc tcctaaccca 960
gctatgaggt tgttgttgga gcttttgagg gtccaccatc accaccacca ttaa 1014

Claims (10)

1.一种产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，所述产倍半萜瓦伦烯工程菌通过在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合融合基因I得到；
所述融合基因I从5’端至3’端，依次含有1个法尼基焦磷酸合酶基因ERG20、1个连接肽基因GGGS和1个瓦伦烯合酶基因CnVS。
2.根据权利要求1所示的产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，所述融合基因I的拷贝数为1～10；
优选地，所述融合基因的拷贝数为3～4；
优选地，所述融合基因的拷贝数为3。
3.根据权利要求1所示的产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，所述产倍半萜瓦伦烯工程菌通过在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合DNA片段I得到；
所述DNA片段I为PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2；
优选地，所述DNA片段I的整合位点为XI-1。
4.根据权利要求3所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，还在酿酒酵母出发菌株的染色体上整合DNA片段II；
所述DNA片段II为PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2；
优选地，所述DNA片段II的整合位点为XI-8。
5.根据权利要求4所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，还在酿酒酵母出发菌株中导入DNA片段III；
DNA片段III选自PGAL1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2、TDIT1-CnVS-GGGS-ERG20-PGAL10-1-ERG20-GGGS-CnVS-TTDH2中的任一种；
优选地，所述DNA片段II的整合位点为XI-7。
6.根据权利要求1所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，其特征在于，还敲除酿酒酵母出发菌株的转录因子ROX1。
7.根据权利要求1所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌，其特征在于，所述瓦伦烯合酶基因CnVS的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述酿酒酵母出发菌株选自野生型酿酒酵母或酿酒酵母菌株CCV06中的任一种；
优选地，所述野生型酿酒酵母选自S288C菌株、CEN.PK113-11C菌株中的任一种。
8.权利要求1～7任一项所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
利用CRISPR/Cas9法将融合基因I整合到酿酒酵母出发菌株的染色体上，得到所述产倍半萜瓦伦烯工程菌。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9法将DNA片段I整合到酿酒酵母出发菌株的XI-1位点；
优选地，还利用CRISPR/Cas9法将DNA片段II整合到酿酒酵母出发菌株的XI-8位点；
优选地，还利用CRISPR/Cas9法将DNA片段II整合到酿酒酵母出发菌株的XI-7位点；
优选地，还利用CRISPR/Cas9法将酿酒酵母出发菌株的转录因子ROX1敲除。
10.权利要求1～7任一项所述的产倍半萜瓦伦烯工程菌、根据权利要求8～9任一项所述的构建方法得到的产倍半萜瓦伦烯工程菌在制备倍半萜瓦伦烯中的应用。
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