CN116687936A - 吩噻嗪类或其类似结构的化合物在制药中的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及吩噻嗪类化合物在制药中的新应用，其中所述吩噻嗪类化合物选自式(I)所示的化合物、其水合物、溶剂化物或其还原型形式，具体为在制备PD‑1信号传导抑制剂中的应用。本发明的吩噻嗪类化合物能够抑制PD‑1的功能，使PD‑1的信号传导受阻，从而可以作为PD‑1信号传导抑制剂。在体外实验中发现，该类化合物可以恢复被PD‑1抑制的免疫细胞的功能，从而提高CTL等免疫细胞分泌细胞因子和杀伤靶细胞的功能，从而可以提高机体的免疫功能，并且可以有效治疗肿瘤。
Description
本申请是申请号为201910792478.5、申请日为2019年08月26日、发明名称为“吩噻嗪类或其类似结构的化合物在制药中的新应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别是涉及一种吩噻嗪类或其类似结构的化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式在制药中的新应用。本发明另一方面涉及吩噻嗪类化合物与过继性细胞疗法的联合应用。本发明另一方面涉及吩噻嗪类化合物与肿瘤免疫化疗剂特别是PD-1抗体的联合应用。
背景技术
过继性细胞疗法(Adoptive cell therapy)是一种治疗方法，其包括从哺乳动物收集一种或多种不同类型的免疫细胞，离体(ex vivo)培养和/或操作收集的免疫细胞，并将经培养和/或操作的免疫细胞返回哺乳动物。对收集的免疫细胞的离体操作包括将重组核酸引入免疫细胞中。过继性细胞疗法包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，TumorInfiltrating Lymphocyte)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK，Lymphokine ActivatedKiller)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，Cytokine Induced Killer)、树突状细胞(DC，Dendritic Cell)、自然杀伤细胞(NK，Natural Killer)、T细胞受体嵌合型-T细胞(TCR-T，TCell Receptor TCR-Modified T Cell)、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)、及嵌合抗原受体T细胞(CAR-T，Chimeric Antigen Receptor Engineered T Cell)等。
人体免疫系统能对抗并清除外来入侵的病原微生物或变异的细胞，免疫细胞是执行人体免疫功能的重要细胞。其中，T细胞是人体内重要的免疫细胞，它能通过表达在其细胞表面的抗原受体(TCR)识别靶细胞上被主要组织相容性复合物(MHC)递呈的抗原，这称为第一信号。在靶细胞合适的第二信号(如B7分子)协同作用下，T细胞就被激活并执行其功能。如T细胞中的其中一个亚类，细胞毒性T细胞(简称CTL)，被激活后能直接杀伤靶细胞，从而清除被病毒感染的细胞或肿瘤细胞。
在T细胞被激活的过程中，T细胞启动表达负反馈抑制其免疫功能的一些分子，PD-1(即programmed cell death 1，程序性凋亡蛋白1)则是其中最著名的分子之一。当CTL细胞表面的PD-1蛋白受到其配体(通常是靶细胞(如肿瘤细胞)上的PD-L1)的刺激后，PD-1就启动其信号传导，抑制CTL的功能，导致T细胞凋亡或无能。这样的信号传导使得CTL失去了杀伤靶细胞的功能。以人体中的肿瘤细胞为例，这些肿瘤细胞通常在细胞表面表达PD-L1，抑制CTL对其的杀伤，从而能够逃逸免疫监控。而当用药物阻断PD-L1与PD-1相互作用后，PD-1的信号传导受阻，CTL杀伤肿瘤细胞的能力则得以恢复。除了T细胞之外，其它免疫细胞也能够表达PD-1。例如巨噬细胞、B细胞等都已被报道表达PD-1。用合适的药物抑制PD-1的功能后，这些免疫细胞的功能在一定程度上得以恢复。例如，当阻断PD-1的功能后，巨噬细胞从M2(即抑制CTL功能的类型)转变成为M1(即促进CTL功能的类型)，并清除机体中的肿瘤细胞。目前已经有生物制剂如抗体类药物获得FDA批准以用于临床治疗。但到目前为止，临床使用的针对PD-1的药物都是属于生物类制剂类的抗体，小分子化合物的PD-1信号传导抑制剂却未见相关报道。
亚甲基蓝(3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物)是一种吩噻嗪盐，广泛应用于化学指示剂、染料、生物染色剂等方面。最近有一些研究报道了其在药物方面的应用，比如，中国专利公布号CN 104027338 A公开了亚甲基蓝抗急性脑缺血的新用途；中国专利公告号CN 103417546B公开了亚甲蓝的麻醉后促清醒的新应用。另外也有一些文献中公开了亚甲基蓝作为光敏剂用于制备光敏药物进行光动力疗法。已有研究人员发现，传统的光动力疗法用于体内治疗时，生物组织对光线的吸收和散射作用造成了激发光强度的衰减，并且恶性肿瘤组织所处的乏氧状态会导致单线态氧的产量较低，由单纯的光敏剂作为光敏药物，其并不具有真正治疗肿瘤的作用(中国专利公告号CN 106668859 A)。
因此，尽管现有技术有公开亚甲基蓝在药物方面的一些应用，但并没有相关文献报道将亚甲基蓝应用于PD-1信号传导的抑制，并将其应用于肿瘤的防治或治疗。目前临床上仍然缺乏足够有效的药物来治疗癌症，因此提供一种能够有效肿瘤的药物具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的提供了一种药用组合物，包括：(a)适用于过继性细胞疗法的免疫细胞；以及(b)吩噻嗪类化合物，其选自式(I)所示的化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中，Z选自：S+、O+、C或N；
Y选自：N或N+；并且当Z选自：S+或O+时，Y为N；当Z选自C或N时，Y为N+；
X-为能够与Z+或N+成盐的一个或多个阴离子，从而实现电中性；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10分别独立地选自：氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基、硫烷氧基、胺基、硝基、氨基、卤素。
在一些实施方式中，所述X选自无机酸根阴离子和有机酸根阴离子。进一步地，所述无机酸根阴离子优选为Cl-、Br-、I-。所述有机酸根阴离子优选为甲磺酸根阴离子、乙磺酸酸根阴离子、对甲苯磺酸根阴离子、苯磺酸根阴离子、乙二磺酸酸根阴离子、丙二磺酸酸根阴离子和萘二磺酸根阴离子。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10分别独立地选自：氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基、取代或未取代的C5-C10芳基、取代或未取代的5-10元杂芳基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的芳基烷氧基、硫烷氧基、胺基、硝基、氨基、卤素。在一些实施方式中，其中所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物选自式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)其水合物、溶剂化物或还原型形式
其中X为一个或多个阴离子，从而实现电中性，并如以上所定义。
在一些实施方式中，述吩噻嗪类化合物的还原型形式为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)、其水合物或溶剂化物
其中，
X为一个或多个阴离子，从而实现电中性，并如以上所定义。
在一些实施方式中，其中所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
在一些实施方式中，其中所述免疫细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)和T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞(TCR-T)。
在一些实施方式中，其中所述免疫细胞为T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞。
在一些实施方式中，其中所述TCR能够与SIINFEKL肽结合。
本发明再一方面提供一种药盒，包括：a)上述免疫细胞中任一种，其被配制在第一剂型中；b)上述的化合物中的任一个，其被配制在第二剂型中。
本发明再一方面提供上述化合物中的任何一种在制备治疗癌症的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述癌症为黑色素瘤、胸腺肿瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、直结肠癌、胰腺癌、肝癌、淋巴癌、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非霍奇金淋巴癌、肾癌或脑瘤。
本发明的另一方面还提供上述吩噻嗪类化合物的任何一种在制备提高免疫细胞功能的药物中的应用。
本发明的另一方面提供上述吩噻嗪类化合物的任何一种在制备抑制PD-1信号传导的药物中的应用。本发明的另一方面提供上述吩噻嗪类化合物的任何一种在制备阻断PD-1下游信号通路的药物中的应用。本发明的另一方面提供上述吩噻嗪类化合物的任何一种在制备阻断PD-1招募SHP2蛋白的药物中的应用。
本发明的另一方面提供一种抑制PD-1信号传导的方法，包括阻断PD-1下游信号通路的步骤。在一些实施方式中，所述阻断是通过阻断PD-1招募SHP2蛋白来实现的。在一些实施方式中，所述阻断PD-1招募SHP2的步骤包括将细胞与有效量的本发明所述的任一种吩噻嗪类化合物接触。
本发明的另一方面提供一种治疗对象中的癌症的方法，所述方法包括抑制对象中的PD-1信号传导。在一些实施方式中，所述抑制对象中的PD-1信号传导包括阻断PD-1下游信号通路。在一些实施方式中，所述阻断PD-1下游信号通路包括阻断PD-1招募SHP2。在一些实施方式中，所述阻断PD-1招募SHP2的步骤包括向对象施用有效量的本发明所述的任一种吩噻嗪类化合物。
本发明的另一方面提供一种治疗对象中的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本发明所述的任一种吩噻嗪类化合物，以及向对象施用第二种疗法。在一些实施方式中，所述第二种疗法选自化学疗法、放射性疗法和手术治疗。在一些实施方式中，所述化学疗法是肿瘤免疫疗法。在一些实施方式中，所述肿瘤免疫疗法包括向所述对象施用PD-1抗体或PD-L1抗体或其功能性片段。在一些实施方式中，该方面所述的方法产生协同的抗肿瘤作用。
本发明的另一方面提供一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的任一种吩噻嗪类化合物，以及第二种化疗剂。在一些实施方式中，所述第二化疗剂是肿瘤免疫治疗剂。在一些实施方式中，所述肿瘤免疫治疗剂是PD-1抗体或PD-L1抗体或其功能性片段。
本发明的另一方面提供一种增强PD-1抗体或PD-L1抗体或其功能性片段在对象中的疗效的方法，所述方法包括在施用所述PD-1抗体或PD-L1抗体之前、同时或之后，向所述对象施用有效量的本发明所述的任一种吩噻嗪类化合物。在一些实施方式中，该方法产生协同的抗肿瘤作用。
本发明的发明人通过大量创造性劳动发现：本发明的吩噻嗪类及类似结构的化合物能够与免疫细胞(尤其是经过基因修饰过的免疫细胞)合用时能够显著提高免疫细胞对于靶细胞的杀伤作用，达到协同的效果。本发明的吩噻嗪类及类似结构的化合物能够抑制PD-1的功能，使PD-1的信号传导受阻，从而可以作为PD-1信号传导抑制剂。
在体外实验中发现，该类化合物可以恢复被PD-1抑制的免疫细胞的功能，从而提高CTL等免疫细胞分泌细胞因子和杀伤靶细胞的功能，从而可以提高机体的免疫功能。在动物模型中，本发明的吩噻嗪类及类似结构的化合物能够使小鼠体内的移植瘤或原位肺癌萎缩，达到治疗癌症的目的。此外，相对于PD-1抗体等大分子，小分子PD-1信号传导抑制剂具有成本较低、制备工艺较简单(如通过化学合成)、给药途径多、患者顺应性高、安全可靠等优势。本发明的实验还证实，本发明的吩噻嗪类化合物在肿瘤抑制方面具有与PD-1抗体相当或优于PD-1抗体的效果。
附图说明
图1为实施例1的实验结果图；其中，A示出了未转染和转染的Jurkat细胞表面的PD-1蛋白的表达；B示出了未转染和转染的Raji细胞表面的PD-L1蛋白的表达；C示出了经转染的Raji细胞诱导经转染Jurkat细胞中PD-1蛋白Y248磷酸化的结果；D为MTC促进Jurkat-PD-1-NFAT-luc细胞分泌IL-2的结果；E示出了MTC或LMT(N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐))促进Jurkat-PD-1-NFAT-luc细胞中荧光素酶(luciferase)活力升高。
图2示出了实施例2中MTC促进OT-1细胞的分裂；其中，A为OT1-CTL细胞表面表达PD-1蛋白的结果；B为MTC促进CTL的分裂结果。
图3示出了实施例2中MTC促进OT-1细胞分泌效应分子，MTC促进CTL细胞中IL-2、IFNγ、Perforin和GranzymeB的分泌。
图4示出了MTC恢复OT-1T细胞杀伤靶细胞的能力；其中，A示出了MTC促进CTL对EL4-OVA(PD-L1)的杀伤；B示出了IFNγ诱导B16-F10表达PD-L1蛋白；C、D示出了MTC或LMT协同地增加了CTL对B16-OVA细胞的杀伤；E示出了MTC或LMT对于B16-WT细胞没有杀伤作用，即使与CTL细胞联合对于细胞仍无杀伤作用。
图5为MTC促进细胞毒性T细胞(CTL)清除靶细胞形成的肿瘤的结果图；其中，A为移植瘤模式图；B、C、D示出了MTC抑制Rag1-/-小鼠移植瘤的生长；E示出了MTC抑制C57BL/6J小鼠移植瘤的生长。
图6为MTC治疗原发肿瘤的结果图；其中，A为治疗原位瘤实验模式图示；B为MTC通过CD8+T细胞清除肿瘤的结果。
图7为MTC阻断PD-1招募SHP2的结果图；其中，A证明了MTC减少PD1与SHP2的结合；B示出了MTC抑制PD1招募SHP2的结合；C示出了MTC抑制PD1与SHP2的结合。
具体实施方式
术语“过继性细胞疗法”或“adoptive cell therapy”涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到癌症患者中。在一些实施例中，ACT是一种治疗方法，该方法涉及使用具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞在体外扩增至大量并将这些细胞输注到携带癌症的宿主中。
术语“肿瘤浸润淋巴细胞”或TIL是指已离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。术语“CAR-T”为“嵌合抗原受体T细胞”的简写形式，其中，嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别靶细胞(如肿瘤)抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。
术语“TCR-T(T细胞受体(TCR)嵌合型-T细胞)”是指表达有工程化T细胞受体(engineered TCR)或称人造T细胞受体(artificial TCR)的T细胞。所述工程化T细胞受体或人造T细胞受体经过了基因改造，具有靶向目的抗原的结构，同时也保留了TCR信号传导通路中的结构域和/或辅助分子。在某些实施例中，TCR-T保留了TCR信号传导通路中的全部辅助分子因此，在少量抗原刺激时，就可以发生全激活的状态，引起对靶细胞的杀伤效应。相对于CAR-T而言，这些TCR-T保持并应用了TCR信号传导通路上的所有辅助分子，因此TCR-T对低浓度，少拷贝数抗原的识别敏感性高于某些CAR-T，治疗潜力非常大。
酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11型(PTPN11)也称为蛋白酪氨酸磷酸酶1D(PTP-1D)，Src同源区2含有结构域磷酸酶-2(SHP-2)或蛋白酪胺酸性磷酸酶2C(PTP)-2C)，是由人类PTPN11基因编码的酶。SHP-2在各种组织和细胞类型中普遍表达，涉及多种信号传导途径，包括由生长因子如PDGF，EGF和IGF-1等，细胞因子如IL-3，GM-CSF和EPO等，以及胰岛素和干扰素。SHP-2具有化合物信号传导功能。它似乎涉及多种信号转导过程，例如Ras-Raf-MAP-ERK途径，Jak-Stat途径和PI3K-Akt途径。它还被证明可与多种信号中间体结合，如Grb2，FRS2，Jak2，PI3激酶的p85亚基，IRS-1和Gab1和Gab2。作为PD-1受体的下游分子，SHP-2参与T细胞抑制性信号的传导。已有研究表明，SHP-2是PD-1信号传导的下游分子，它不仅抑制T细胞活化而且促进T细胞的失能。已有研究还表明，T淋巴细胞上敲除SHP2可引发抗肿瘤免疫，抑制小鼠结肠炎相关癌症的发生。
甲硫堇(MT)是氧化还原分子，并且取决于环境条件(例如，pH、氧、还原剂)，以还原型形式的10H-吩噻嗪化合物(即N,N,N',N'-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二胺(LMT))和氧化形式(MT+)之间的平衡状态存在。
氧化形式的盐MTX如式II所示，
当LMT以其盐形式存在时，被称为LMTX盐，如式III所示。
X-选自无机酸根阴离子和有机酸根阴离子；合适的有机酸阴离子的实例包括但不限于衍生自以下有机酸的那些有机酸阴离子：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙酸、羟马来酸、羟萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸(pamoic)、泛酸(pantothenic)、苯乙酸、苯磺酸、丙二磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸和戊酸。合适的高分子有机阴离子(polymeric organic anion)包括但不限于衍生自以下高分子酸(polymeric acid)的那些高分子有机阴离子：鞣酸、羧甲基纤维素。进一步地，所述无机酸根阴离子优选为Cl-、Br-、I-。所述有机酸根阴离子优选为甲磺酸根阴离子。
其中亚甲蓝(MTC)(本文也称之为3，7-二(二甲基氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物)，它是甲硫堇(MT)的氧化形式(即MT+)的氯化物盐为具有如下结构式的低分子量(319.86)的水溶性的三环有机化合物：以及N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)结构如下所示，
本申请使用的术语“溶剂化物”取其常规意义，其是指溶质(如化合物、化合物的盐)和溶剂的复合物(complex)。如果溶剂是水，则可方便地将溶剂化物称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。除非另有说明，当提到具体化合物时，该具体化合物也包括其溶剂化物形式。
本文使用的“治疗”包括给予本申请的化合物或本申请的组合物，以减轻疾病或病症的症状或并发症，或消除疾病或病症。本文使用的术语“减轻”用于描述病症的迹象或症状的严重性降低的过程。症状可减轻而没有消除。在一种实施方案中，给予本申请的组合物导致消除迹象或症状。
用途和疗法
本发明的一个方面涉及吩噻嗪类化合物在制备PD-1信号传导抑制剂中的应用，该吩噻嗪类化合物选自式(I)所示的化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中，Z选自：S+、O+、C或N；
Y选自：N或N+；并且当Z选自：S+或O+时，Y选自N；当Z选自C或N时，Y选自N+；X-为能够与Z+或N+成盐的一个或多个阴离子，从而实现电中性；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10分别独立地选自：氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基、硫烷氧基、胺基、硝基、氨基、卤素。
在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物选自式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)其水合物、溶剂化物或还原型形式
其中X为一个或多个阴离子，从而实现电中性，并如以上所定义。
在一些实施方式中，述吩噻嗪类化合物的还原型形式为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)、其水合物或溶剂化物：
其中，
X为一个或多个阴离子，从而实现电中性，并如以上所定义。
在一些实施方式中，该吩噻嗪类化合物类为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)，优选地所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
本发明的另一方面涉及式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式在制备治疗癌症的药物中的应用。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
本发明的另一个方面涉及式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式在制备提高免疫细胞功能的药物中的应用。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
本发明的另一个方面涉及式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式在制备预防或治疗癌症复发的药物中的应用。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
本发明的另一方面涉及式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式在制备阻断PD-1下游信号通路的药物中的应用。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
本发明的另一方面涉及式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式在制备阻断PD-1招募SHP2蛋白的药物中的应用。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
本发明的另一个方面提供一种治疗癌症方法，所述方法包括向患有所述癌症的对象施用治疗有效量的本发明的式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。在一些实施方式中，所述癌症为黑色素瘤、胸腺肿瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、直结肠癌、胰腺癌、肝癌、淋巴癌、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非霍奇金淋巴癌、肾癌或脑瘤。在一些实施方式中，所述癌症为黑色素瘤。在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，优选是人。
本发明的另一方面提供一种提高免疫细胞功能的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的本发明的式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。在一些实施方式中，所述提高免疫细胞功能能够达到抗病毒的效果。在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，优选是人。
本发明的另一方面提供一种预防或治疗癌症复发的方法，所述方法包括向患有所述癌症的对象施用治疗有效量的式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)、其水合物、溶剂化物或还原型形式。在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)。在该方面，优选地，所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。在一些实施方式中，所述对象经历过手术、放疗或化疗。
在一些实施方式中，所述方法能够与其他癌症的疗法联合应用。例如，所述方法能够与手术、放疗或化疗联合应用。因此，在一些实施方式中，本发明的治疗癌症方法进一步包括向患有所述癌症的对象施用治疗有效量的第二种治疗剂。
在一些实施方式中，所述第二种治疗剂为适用于过继性细胞疗法的免疫细胞。在这些实施方式中，所述第二种治疗剂在施用式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式之前、同时或之后施用。
在一些实施方式中，所述第二种治疗剂为化疗剂，优选地，所述化疗剂为肿瘤免疫化疗剂，更优选地，所述化疗剂为PD-1抗体、PD-L1抗体或其片段。在一些实施方式中，所述第二种治疗剂在施用式I的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式之前、同时或之后施用。
当第二种治疗剂与本发明的吩噻嗪类化合物、其水合物或溶剂化物不同时施用时，两者施用间隔约0.1小时至约72小时，例如间隔约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、72h施用。
当第二种治疗剂与本发明的吩噻嗪类化合物、其水合物或溶剂化物同时施用时，在一些实施方式中，本发明的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式与该第二种治疗剂分别以单独的药物组合物形式提供。在一些实施方式中，所述单独的药物组合物被提供在同一个药盒中。当第二种治疗剂与本发明的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式同时施用时，在另一些实施方式中，本发明的吩噻嗪类、其水合物、溶剂化物或还原型形式与该第二种治疗剂以单一的药物组合物形式提供。
药用组合物及药盒
本发明的一个方面提供一种用于治疗癌症的药用组合物，其包含式I所示的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中，Z选自：S+、O+、C或N；
Y选自：N或N+；并且当Z选自：S+或O+时，Y选自N；当Z选自C或N时，Y选自N+；X-为能够与Z+或N+成盐的一个或多个阴离子，从而实现电中性；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10分别独立地选自：氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基、硫烷氧基、胺基、硝基、氨基、卤素。
在一些实施方式中，所述X选自无机酸根阴离子和有机酸根阴离子。进一步地，所述无机酸根阴离子优选为Cl-、Br-、I-。所述有机酸根阴离子优选为甲磺酸根阴离子、乙磺酸酸根阴离子、对甲苯磺酸根阴离子、苯磺酸根阴离子、乙二磺酸酸根阴离子、丙二磺酸酸根阴离子和萘二磺酸根阴离子。
在一些实施方式中，所述吩噻嗪类化合物选自式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中X为一个或多个阴离子，从而实现电中性，并如以上所定义。
在一些实施方式中，述吩噻嗪类化合物的还原型形式为式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐(LMTX)、其水合物或溶剂化物：
其中，
X为一个或多个阴离子，从而实现电中性，并如以上所定义。
在一些实施方式中，该吩噻嗪类化合物类为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐(MTX)，优选地所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物(MTC)。
在一些实施方式中，该吩噻嗪类化合物类为N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
本发明的另一个方面提供一种用于治疗癌症的药用组合物，其包含：式I所示的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式，以及适用于过继性细胞疗法的免疫细胞，其中式I及其取代基如以上所定义。
在一些实施方式中，其中所述免疫细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)和T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞。
在一些实施方式中，其中所述免疫细胞为T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞。
在一些实施方式中，其中所述TCR能够与SIINFEKL肽结合。
本发明的另一个方面提供一种用于治疗癌症的药用组合物，其包含：式I所示的吩噻嗪类化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式，以及用于癌症化疗的免疫治疗剂，其中式I及其取代基如以上所定义。
在一些实施方式中，所述用于癌症化疗的免疫治疗剂是PD-1抗体、PD-L1抗体或其功能性片段。
因此，本发明的药用组合物可以包含一种有效成分(例如式I的任何一种化合物)，其与药学上可接受的载体以混合形式存在于组合物中。本发明的组合物还可以同时包含两种有效成分(例如式I的任何一种化合物及过继性疗法免疫细胞，或式I的任何一种化合物及PD-1抗体)，它们以适当形式被包含在同一药物组合物中，当施用该药物组合物时，对象同时或按顺序被施用所述两种有效成分。例如，式I化合物、适用于过继性细胞疗法的免疫细胞和载体按预定比例以混合物形式存在于药物组合物中。或者，式I化合物与载体以预定比例组成该药物组合物的一部分，适用于过继性细胞疗法的免疫细胞与载体以预定比例组成该药物组合物的另一部分，两个部分组合构成所述药物组合物，例如以核壳结构组合。药剂学或制药工程上可用的其他方法也可被用来将两种有效成分组合在一起而不影响在被施用后各活性成分的作用发挥。
本发明的另一个方面提供一种药盒，其包含独立存在的第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含治疗有效量的适用于过继性细胞疗法的免疫细胞，所述第二药物组合物包含治疗有效量的式I的吩噻嗪类化合物或其水合物或溶剂化物。因此，在所述药盒的一些实施方式中，所述第一药物组合物能够以单独剂型存在，所述第二药物组合物能够以另一单独剂型存在，两者剂型可以相同或不同。在一些实施方式中，所述药盒中的第一药物组合物和第二药物组合物分别被容纳于单独的容器中。
本发明的另一方面提供一种药盒，其包含独立存在的第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含治疗有效量的式I的吩噻嗪类化合物或其水合物或溶剂化物，所述第二药物组合物包含治疗有效量的第二种化疗剂(例如免疫治疗剂，如PD-1抗体)。因此，在所述药盒的一些实施方式中，所述第一药物组合物能够以单独剂型存在，所述第二药物组合物能够以另一单独剂型存在，两者剂型可以相同或不同。在一些实施方式中，所述药盒中的第一药物组合物和第二药物组合物分别被容纳于单独的容器中。
通过标准程序可以确定待施用的有效成分的治疗或预防有效量，考虑的因素可以包括例如化合物IC50、生物半衰期、对象的年龄、大小和体重以及与对象有关的病症。这些因素和其它因素的重要性对本领域普通技术人员而言是熟知的。一般而言，剂量为被治疗的对象的大约0.01mg/kg至50mg/kg之间，优选在0.l mg/kg至20mg/kg之间。
载体或赋形剂可以被用于生产药物组合物。所述载体或赋形剂可以被选择为促进化合物的给药。载体的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)、或淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理相容性溶剂。生理上相容性溶剂的例子包括注射用水(WFI)无菌溶液、盐溶液和葡萄糖。
合适的剂型部分地取决于给药途径，例如经口、经皮、经粘膜、吸入或通过注射(肠胃外)。此类剂型应当使有效成分能够到达靶细胞。可以通过不同的路径施用本发明的药物或药物组合物，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经口、经粘膜、直肠、经皮或吸入。在一些实施方式中，优选口服。对口服而言，例如，化合物可以被配制为常规口服剂型，例如胶囊、片剂，以及液体制剂，例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。
实施例
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
以下实施例中的MTC是指PD-1信号传导抑制剂：3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物，其结构式如下：
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以下实施例中的LMT为N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)，结构式如下：
实施例1.MTC提高人的T细胞的功能
一、实验方法：
(1)用Jurkat细胞构建高表达PD-1的稳转细胞系。将pCAGin-PD-1质粒电转到Jurkat细胞中，然后用900μg/mL G418抗生素筛选，用流式分选单克隆。然后在Jurkat-PD-1细胞中电转入一个DNA片段，该片段由NFAT结合位点控制荧光素酶(luciferase)的基因(记作NFAT-LUC)。然后流式分选出单克隆，命名为5号克隆。利用这个细胞，可通过测定luciferase的活力来反映IL-2的表达量。构建稳定表达PD-L1的Raji细胞，将pCDNA-PD-L1质粒电转Raji细胞，用2μg/mL puromycin抗性筛选，然后流式分选单克隆，命名为1号克隆。
(2)稳定表达PD-L1的Raji细胞用来刺激Jurkat-PD-1上的PD-1分子。Raji细胞是人源的B淋巴细胞，表达B7分子，能提供T细胞激活所需的第二信号。将Jurkat-PD-1-NFAT-LUC细胞在2μg/mL CD3抗体/2μg/mL CD28抗体刺激下，然后与Raji-PD-L1细胞以1:1的比例共培养6小时，再通过免疫印迹检测PD-1的Y248位的磷酸化。
(3)在96孔板中，用10μg/mL CD3抗体/10μg/mL CD28抗体包板，4℃过夜，然后用PBS洗掉多余的抗体，将Raji细胞或者Raji-PD-L1细胞以1:1的比例与Jurkat-PD-1-NFAT-LUC细胞共培养；或者在Raji-PD-L1细胞与Jurkat-PD-1-NFAT-LUC细胞以1:1的比例混合的细胞中加入1μM MTC或者10μg/mL的PD1抗体进行共培养；共培养6小时后取上清，用ELISA测IL-2的分泌。
(4)在96孔板中，用10μg/mL CD3抗体/10μg/mL CD28抗体包板，4℃过夜，然后用PBS洗掉多余的抗体，将Raji细胞或者Raji-PD-L1细胞以1:1的比例与Jurkat-PD-1-NFAT-LUC细胞共培养；或者在Raji-PD-L1细胞与Jurkat-PD-1-NFAT-LUC细胞以1:1的比例混合的细胞中加入4.86μM MTC或LMT，共培养6小时后加入luciferase底物，酶标仪测定Luciferase读值。
二、实验结果及分析：
(1)稳定表达PD-1的Jurkat细胞通过FACS测试表明，5号克隆正确表达PD-1分子(图1A)。构建的稳定表达PD-L1的Raji细胞，通过FACS表明1号克隆正确表达PD-L1(图1B)。
(2)将Raji-PD-L1细胞与Jurkat-PD-1细胞共培养6小时后，免疫印迹检测发现PD-1的Y248位被磷酸化(图1C)。由此可知，在表达PD-1的Jurkat与稳定表达PD-L1的Raji细胞的共培养中，PD-1与PD-L1进行了结合。
(3)IL-2的分泌情况结果表明：Jurkat-PD-1-NFAT-LUC在PD1抗体(anti-PD1，百时美施贵宝Nivolumab)或Raji细胞加入后能够显著刺激IL-2的分泌；与未加入任何刺激的Jurkat-PD-1-NFAT-LUC组相比，加入Raji PDL1的实验组的IL-2分泌量降低，而加入MTC或PD1抗体后，IL-2的分泌量急剧增强(图1D)；并且与PD1抗体组相比，MTC能够更显著地改善被PD-1抑制的Jurkat细胞的功能。
(4)Jurkat-PD-1-NFAT-LUC在CD3抗体/CD28抗体/Raji细胞的刺激下，luciferase的活力升高有限，而加入Raji-PD-L1的细胞luciferase的活力下降。在加入Raji-PD-L1的细胞的同时加入4.86μM MTC或LMT，luciferase的活力急剧升高(图1E)，说明MTC或LMT能改善被PD-1抑制的Jurkat细胞的功能。
实施例2.MTC能够促进OT-1细胞的分裂和分泌效应分子
OT-1转基因小鼠的CD8+T细胞表达的TCR能识别鸡卵清蛋白的SIINFEKL-H-2Kb复合体。所以体外培养OT-1小鼠的脾脏细胞时，在SIINFEKL肽段的刺激下，脾脏中的CD8+T细胞能被激活并剧烈扩增，我们称之为CTL细胞。
一、实验方法：
(1)CTL细胞制备：取OT1小鼠的脾脏，研磨后加入红细胞裂解液裂解红细胞，制成单细胞悬液，培养液为1640+10％FBS+50μMβME+10nM IL-2，调节细胞密度约2-4million/mL,加入10nM OVA257-264，37℃、5％CO2细胞培养箱进行培养，从CTL制备当天起，每天用FITC标记的PD-1抗体染色，然后流式检测此细胞表面PD-1表达变化。
(2)取上述CTL细胞用5nM CFSE标记，加入10nM SIINFEKL和10nM IL-2的刺激，同时加入10μg/mL小鼠的PD-L1蛋白，实验组还加入100nM的MTC小分子化合物，分别刺激24、48、72小时后，流式观察PD-L1蛋白及MTC对CTL细胞分裂的影响。
(3)将CTL细胞与靶细胞EG7(表达鸡卵清蛋白的EL4淋巴瘤细胞)按1:1的浓度混合培养，用1μM蛋白转运抑制剂GolgiPlugTM处理6小时后，4％多聚甲醛固定细胞，0.1％saponin对细胞进行打孔，然后用各效应分子的抗体进行染色，流式检测MTC对CTL效应分子的分泌情况的影响。
二、实验结果及分析：
(1)在诱导CTL细胞的整个过程中，随着诱导时间增加，其细胞表面PD-1的量逐渐增加(图2A)。
(2)当CTL用SIINFEKL和IL-2刺激，且加入PD-L1蛋白后，PD-L1蛋白能抑制CTL细胞的分裂，而加入100nM的MTC后则能逆转这种抑制(图2B)。
(3)EG7是表达鸡卵清蛋白的EL4淋巴瘤细胞，因此，CTL细胞能识别并执行其杀伤功能。当激活的OT-1小鼠脾细胞和EG7细胞按照1:1的比例混合后，CTL细胞开始分泌效应分子，如IL-2、IFNγ、穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)。加入蛋白转运抑制剂GolgiPlugTM(PTI)，然后用FACS进行检测。我们发现表面过表达PD-L1的EG7细胞(EG7-PD-L1细胞稳株)能强烈地抑制CTL分泌IL-2、IFNγ、Perforin、Granzyme B。而当我们用MTC处理后，CTL细胞IL-2、IFNγ、Perforin、Granzyme B的分泌量急剧升高(图3)；这说明MTC能够改善PD-1的抑制，促进CTL细胞分泌IL-2、IFNγ、Perforin、Granzyme B。
实施例3.MTC能够恢复OT-1T细胞杀伤靶细胞
一、实验方法：
(1)CTL细胞的制备见实施例2。
(2)将EG-7-PD-L1细胞用5nM CFSE标记，然后将CTL细胞与EG-7-PD-L1按照5:1的比例混合后，分别用1μM、5μM、10μM MTC处理4小时后再用10μg/mL的PI染色，流式检测靶细胞EG-7-PD-L1的凋亡情况，进而判断CTL细胞对靶细胞的杀伤能力。
(3)将黑色素瘤细胞B16-OVA(表达OVA基因的B16细胞)用10μg/mL IFN-γ处理24小时后，与CTL细胞按照1：5的比例混合培养4小时，同时用MTC(1μM)处理，将未经IFN-γ处理仅分别给予DMSO和MTC处理的B16-OVA细胞作为对照。显微镜观察B16-OVA的凋亡情况，进而判断CTL细胞对靶细胞的杀伤能力。
(4)将黑色素瘤细胞B16-OVA(表达OVA基因的B16细胞)其中B16-OVA组不做任何处理，Water组则将培养基更换为水；而其余各组用10μg/mL IFNγ处理，24小时后，除B16-OVA组之外各组均与CTL细胞按照1：5的比例混合培养4小时，同时用MTC(1μM)、LMT(1μM)或anti-PD1(PD-1抗体，10μg/mL，Nivolumab，BMS)处理，显微镜观察各组B16-OVA的死亡情况，进而判断CTL细胞对靶细胞的杀伤能力。我们还提供未经基因工程改造的黑色素瘤B16-WT，其中B16-WT组不做任何处理；IFN-γ+MTC组与IFN-γ+LMT组用10μg/mL IFN-γ处理，24小时后，与CTL细胞按照1：5的比例混合培养4小时同时用MTC(1μM)或LMT(1μM)处理；而MTC组和LMT组则仅给予MTC(10μM)和LMT(10μM)处理，观察对靶细胞的杀伤能力。
二、实验结果及分析：
(1)激活的OT-1细胞(CTL细胞)表面表达PD-1，因此其杀伤EG-7-PD-L1细胞(OVA基因修饰的小鼠T淋巴瘤细胞EG7中过表达了小鼠的PD-L1)的能力有限(图4A)。在这个系统中，MTC却能显著地恢复CTL细胞对EG-7-PD-L1的杀伤能力(图4A)。
(2)如图4E所示，MTC和LMT对B16-WT细胞并无杀伤作用，而且由于OT-1细胞不能识别B16-WT细胞，因此在MTC/LMT与CTL细胞的联用对于B16-WT并无杀伤作用。而B16-OVA细胞低表达MHC-I分子，其SIINFEKL肽段平时没有被递呈出来，因此OT-1细胞不能识别并杀伤B16-OVA细胞(图4C和4D)。当B16-OVA细胞用IFNγ处理后，SIINFEKL肽段被递呈后，CTL细胞具有杀伤作用(图4C和4D)。但IFNγ处理后，诱导了B16-OVA的PD-L1表达(图4B)。因为CTL对于B16-OVA的这种杀伤作用被PD-1与PD-L1相互作用减弱，所以单独使用CTL时杀伤作用并不显著。我们通过同时加入MTC或LMT则能显著地增强上述条件下CTL细胞对B16-OVA细胞的杀伤量(图4C和4D)；此外，如图4D所示，MTC与CTL细胞的联合杀伤作用与LMT与CTL的联合杀伤作用相当，并且它们的杀伤作用明显强于anti-PD-1组。因此，通过MTC或LMT与CTL细胞联合能够协同地加强对于B16-OVA的杀伤作用。
实施例4.MTC帮助细胞毒性T细胞清除靶细胞形成的肿瘤上述实施例1-3的实验结果已证实MTC能强烈恢复细胞毒性T细胞杀伤过表达PD-L1的靶细胞。本实施例进一步考察了MTC体内治疗肿瘤的能力。
一、实验方法：
(1)将过表达了鸡的卵清白蛋白OVA和小鼠的PD-L1的淋巴瘤细胞即EL4-OVA-mPDL1细胞重悬于BD Matrigel基质胶中(按照一只小鼠一侧需要2×106细胞重悬于100μlBD Matrigel基质胶中)。
(2)将上述细胞和基质胶的混合物接种到Rag1-/-小鼠左右侧腰背部皮下各100μl。
(3)待接种5天左右肿瘤固定后，我们通过尾静脉输入激活的OT-1T细胞(即2×106CTL细胞/只)，同时将小鼠分为3组，即单独CTL细胞组，CTL细胞+10mg/kg/2days PD-1抗体组，CTL细胞+40mg/kg/day MTC组。
(4)从尾静脉注射CTL细胞当天开始测量各组小鼠的移植瘤的长和宽，隔一天测量一次，以长×宽2/2来计算肿瘤的体积大小(图5A)。
二、实验结果及分析：
(1)与只尾静脉注射CTL细胞的对照组相比，同时腹腔注射PD-1抗体组的小鼠的肿瘤生成受到抑制，肿瘤的体积和重量的增速均受到抑制。由此可知，PD-1抗体组的肿瘤生长受到抑制。
(2)给带有移植瘤的小鼠灌胃给药MTC同样也能强烈地抑制肿瘤的生长(图5B、C、D)。在治疗结束之后，仅输入CTL细胞组无论是肿瘤重量还是肿瘤体积都表明该组小鼠的肿瘤生长迅速，由此可知单独给予CTL不能有效抑制肿瘤的生长。而CTL+PD-1抗体治疗组和CTL+MTC治疗组却都能够显著抑制肿瘤的生长，并且CTL+MTC治疗组治疗效果上是优于CTL+PD-1抗体治疗组。
以与本实施例相似的方法用EG7-mPDL1细胞在C57BL/6J小鼠中得到了相同的结果(图5E)，未给予CTL(CTL free)的小鼠肿瘤生长迅速，而仅给予CTL虽然与CTL free相比能够抑制肿瘤的生长，但其抑制作用仍然弱于给予CTL+PD-1抗体或CTL+MTC联用组的效果。说明MTC能够有效的帮助细胞毒性T细胞清除靶细胞形成的皮下肿瘤。
实施例5.MTC能有效治疗原位瘤
移植瘤的优点是T细胞识别的抗原表位非常清晰，而且体系单一，能清晰地说明问题。缺点是该模型不能模拟原发癌症复杂的癌变、肿瘤形成过程以及肿瘤和基质细胞的相互作用。因此，鼠的移植瘤模型对于药物在人类患者体内的效果的预测性较差。因此，本实施例利用转基因肺癌小鼠模型进一步考察了本发明MTC治疗肿瘤的作用。通过给EGFR-L858R转基因小鼠喂以含四环素(DOX)食物，就能诱导小鼠肺上皮细胞表达人的EGFR-L858R突变体(该突变体常见于人的肺癌)，在1-2个月后，小鼠的肺癌已经能被计算机断层扫描(Computer Tomography,CT)检测并记录。
一、实验方法：
(1)将EGFR-L858R突变的小鼠给予DOX粮食诱导原位肿瘤模型，诱导时间约为40天左右。
(2)计算机断层扫描(Computer Tomography,CT)记录肿瘤的大小及严重程度。
(3)将荷瘤小鼠随机分组，分别给以安慰剂(HKI solution)、MTC(40mg/kg/day inHKI solution)。治疗2周后，CT再次记录肿瘤大小。
(4)为了证明MTC在清除肿瘤的过程中是通过CD8+T细胞达到目的的，本实施例还进行了以下实验：先用CD8抗体腹腔注射(200mg/只/3天)提前处理一周，将荷瘤小鼠中的CD8+细胞清除掉，再用MTC和CD8抗体共同治疗2周，CT再次记录肿瘤大小。
二、实验结果及分析：
本实验原理为当给这些小鼠喂养含DOX的食物后，肺上皮细胞中的rtTA结合DOX后发生构象变化，结合到TetO这个序列上，启动TetO控制的EGFR突变体的表达。这些小鼠在喂养四环素40天后形成原位肺腺癌。这些肺腺癌真实的模拟了肺上皮细胞在EGFR突变体的作用下发生癌变、癌症发展，最后机体死于癌症的整个临床过程。本实施例的实验结果显示安慰剂治疗组的肿瘤快速生长，而通过MTC治疗14天后的小鼠肿瘤的影像学显示肿瘤已基本被清除(图6B)，而在CD8+T细胞清除情况下的小鼠中的肿瘤在MTC治疗后仍肿瘤的生长并未受到抑制(图6B)。由此可知，MTC能通过激活体内的CTL有效地治疗EGFR-L858R突变的原位肿瘤。
实施例6.MTC阻断PD-1招募SHP2
本实施例初步探究了MTC抑制PD-1传导信号的机理，考察了MTC影响PD-1招募SHP2的能力。PD-1与配体结合可以将SHP2蛋白募集到T细胞受体周围，从而抑制T细胞受体近端激酶的激活，降低Lck所介导的ZAP-70蛋白的磷酸化以及下游信号通路的启动。Luciferase可以拆分为N端和C端两个片段，当这两个片段分别与其他蛋白融合后，如果N端和C端的luciferase片段因为他们的融合蛋白相互作用而靠近后，luciferase的活力就能被检测到，因此，可以通过检测luciferase的活力来间接反映所融合的蛋白的相互作用的强度。
一、实验方法：
(1)首先在293T细胞中脂质体转入PD-1-Cluc和Nluc-SHP2这两个融合基因，构建稳转细胞系，用此细胞加入不同浓度的MTC培养6小时，观察MTC对luciferase读值的影响。
(2)在293T细胞中脂质体转PD-1-GFP和SHP2-mCherry这两个融合基因，构建稳转细胞系，在此细胞中加入不同浓度的MTC培养6小时后再加入1μM PVD(去磷酸化酶抑制剂)处理5分钟，4％多聚甲醛固定后Confocal观察MTC对GFP和mCherry即PD-1和SHP2定位的影响。
(3)在293T细胞中共转染PD-1-Flag质粒和SHP2质粒,然后加入不同浓度的MTC处理，Co-IP检测PD-1招募SHP2的能力。
二、实验结果及分析：
(1)在293T稳转PD-1-Cluc和Nluc-SHP2的稳株中加入不同浓度的MTC，发现MTC能减少luciferase的读值。显示MTC能阻止PD-1招募SHP2(图7A)。
(2)为了进一步证明上步结论，我们用293T稳转PD-1-GFP和SHP2-mCherry的细胞验证。Confocal结果显示，在磷酸酶的抑制剂PVD的处理下，GFP和mCherry有很好的共定位，显示磷酸化的PD-1招募了SHP2(图7B)。
(3)在上述(2)这个系统中，我们加入MTC后，mCherry从膜上解离下来，呈现细胞质分布(图6B)。
(4)Co-IP结果显示MTC阻止PD-1和SHP2的结合，出人意料地阻断了PD-1的下游信号传导，从而提高了免疫细胞的功能，进而增强了与过继性细胞疗法或其他肿瘤免疫疗法联合应用时的肿瘤细胞杀伤效果(图7C)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.吩噻嗪类化合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其中所述癌症为肺癌或淋巴癌，所述吩噻嗪类化合物选自式(I)所示的化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中，Z选自：S+、O+、C或N；
Y选自：N或N+；并且当Z选自：S+或O+时，Y为N；当Z选自C或N时，Y为N+；
X-为能够与Z+或N+成盐的一个或多个阴离子，从而实现电中性；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10分别独立地选自氢和C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述X-选自Cl-、Br-、I-、甲磺酸根阴离子、乙磺酸酸根阴离子、对甲苯磺酸根阴离子、苯磺酸根阴离子、乙二磺酸酸根阴离子、丙二磺酸酸根阴离子和萘二磺酸根阴离子。
3.根据权利要求1所述的应用，其中R1、R2、R5、R6、R9和R10为氢，R3、R4、R7和R8为甲基。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述吩噻嗪类化合物选自式II的3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓盐、其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中，X-为一个或多个阴离子，从而实现电中性。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述吩噻嗪类化合物选自式III的N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵盐、其水合物或溶剂化物：
其中，X-为一个或多个阴离子，从而实现电中性。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述吩噻嗪类化合物为N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
8.药用组合物在制备治疗癌症的药物中的应用，其中所述癌症为肺癌或淋巴癌，所述药用组合物包括：
(a)作为第一活性成分的适用于过继性细胞疗法的免疫细胞；以及
(b)作为第二活性成分的游离的吩噻嗪类化合物，其选自式(I)所示的化合物、其水合物、溶剂化物或还原型形式：
其中，Z选自：S+、O+、C或N；
Y选自：N或N+；并且当Z选自：S+或O+时，Y为N；当Z选自C或N时，Y为N+；
X-为能够与Z+或N+成盐的一个或多个阴离子，从而实现电中性；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10分别独立地选自氢和C1-C6烷基。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述免疫细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞、嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞和T细胞受体嵌合型T细胞。
10.根据权利要求8所述的应用，其中所述吩噻嗪类化合物为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓氯化物或N3,N3,N7,N7-四甲基-10H-吩噻嗪-3,7-二铵双(甲磺酸盐)。
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