CN104027338A - 亚甲蓝的一种抗急性脑缺血损伤用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及亚甲蓝(methylene blue，MB)的一种抗急性脑缺血新用途。亚甲蓝能够明显减小由永久性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)引起的脑缺血梗死灶，缓解神经功能的损伤。本发明的申请人采用线栓法将大鼠大脑中动脉永久性闭塞，即刻及脑缺血后不同时间点多次腹腔注射亚甲蓝后，观察大鼠永久性脑缺血梗死的程度及行为学的改变。研究发现亚甲蓝能够明显减小由脑缺血造成的梗死体积，提高大鼠在脑缺血后的行为能力。通过本发明的方法，在脑缺血后多次给予合适剂量的临床用药亚甲蓝，就能够显著减轻大鼠永久性脑缺血后的损伤程度，改善大鼠脑缺血后的行为能力。亚甲蓝的此种用途，有望为临床提供一种脑卒中后的急救治疗措施，减轻患者因为错过黄金治疗期带来的永久性神经功能损伤。

Description

亚甲蓝的一种抗急性脑缺血损伤用途

技术领域

本发明涉及亚甲蓝的一种抗急性脑缺血损伤用途。大鼠经大脑中动脉闭塞缺血后，立即腹腔注射亚甲蓝，并在缺血后多个时间点给药，能够明显减小大鼠永久性脑缺血后梗死灶的体积，提高大鼠的行为能力。 

背景技术

缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的70％-80％，它是导致成人残疾的首因。治疗缺血性脑卒中的药物多达几十种之多，但目前的用药多以溶栓为主，有些药物副作用还很大，即便如此，由于时间窗的问题(得病后6小时以内，3小时以内为黄金治疗期)，在我国仅有1.6％的患者能够得到及时的溶栓治疗，即使在美国也只有5％的病人能得到及时溶栓治疗。因此，能缓解急性期的脑缺血损伤和减轻随后的永久性脑梗死的救治药物凸显尤为重要。 

亚甲蓝(化学式C16H18ClN3S)又称亚甲基蓝、次甲基蓝、次甲蓝、美蓝、品蓝、甲烯蓝、瑞士蓝。亚甲蓝属于芳香杂环化合物，1876年由Heinrich Caro合成，自1890s起用于实验室和临床。亚甲蓝在临床上的应用包括以下几个方面：1.低浓度时，亚甲蓝能使高铁血红蛋白还原为氧合血红蛋白，故亚甲蓝可治疗高铁血红蛋白血症。2.高浓度时，亚甲蓝能将氧合血红蛋白的铁氧化为三价铁，而形成高铁血红蛋白，利用此作用可治疗氰化物中毒。3.亚甲蓝能使膀胱结石溶解，故可用于尿路结石，对草酸钙结石疗效较好。4.亚甲蓝与神经组织有较强的亲和力，可作用于神经末梢，治疗神经性皮炎。5.其他治疗：亚甲蓝还可以治疗感染性休克、闭塞性脉管炎、血管瘤等。此外，有研究报道亚甲蓝在大鼠脑缺血再灌损伤中具有保护作用，提示可能用于脑缺血溶栓治疗后的保护作用。但是目前能够及时得到溶栓治疗的患者只占缺血性脑卒中患者的2％左右，亚甲蓝对另外98％错过黄金治疗期而带来的永久性神经功能损伤的患者是否能起到保护作用尚未见研究报道。 

发明内容

本发明公开了亚甲蓝的一种抗急性脑缺血损伤用途。大鼠经大脑中动脉闭塞后即刻腹腔注射亚甲蓝((本发明中应用的亚甲蓝由Amresco公司生产，优选的用药剂量是1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，更优选的是5mg/kg)，并在缺血后多个时间点继续给药，能够明显减小大鼠永久性脑缺血造成的梗死体积，改善大鼠的行为能力。通过本发明的方法，采用在适宜时间注射合适剂量的亚甲蓝，就能够提高大鼠等动物对抗急性脑缺血损伤的能力，为临床治疗缺血性脑卒中提供了有力的实验证据。若能得以推广到人体应用，将有较好的经济效益和社会效益。 

本发明的申请人采用线栓法对成年大鼠进行大脑中动脉闭塞造成局灶性脑缺血，栓塞后即刻经腹腔注射不同剂量的亚甲蓝，并在缺血后多个时间点给予上述剂量的亚甲蓝注射，在缺血24小时后观察大鼠的行为能力和脑梗死程度，评价亚甲蓝对急性脑缺血损伤的保护作用。 

具体实施方式

材料： 

1)戊巴比妥钠，德国进口，北京试剂公司分装。 

2)1％戊巴比妥钠注射液：取1g戊巴比妥钠粉末，溶于100ml生理盐水中，充分混匀，制成1％戊巴比妥钠注射液100ml，用于动物麻醉，以大鼠体重为依据，按照0.5ml/100g用量使用。 

3)亚甲蓝(methylene blue，MB)分子式C16H18ClN3S是杂环芳香族染料，属于噻嗪类染料家族，无臭深蓝色晶体，溶于水和氯仿，但不溶于酒精，避光保存，Amresco公司生产，效期安全。其水溶液呈蓝色，现用现配。 

4)10mg/kg亚甲蓝腹腔注射液：称取90mg亚甲蓝粉末，溶于30ml生理盐水中，充分混匀，制成3mg/ml亚甲蓝腹腔注射液30ml，以大鼠体重为依据，按照0.33ml/100g用量使用，即得10mg/kg的实际用量。 

5)5mg/kg亚甲蓝腹腔注射液：取上述配制的10mg/kg亚甲蓝腹腔注射液10ml，溶于10ml生理盐水 中，充分混匀，制成1.5mg/ml亚甲蓝腹腔注射液20ml，以大鼠体重为依据，按照0.33ml/100g用量使用，即得5mg/kg的实际用量。 

6)1mg/kg亚甲蓝腹腔注射液：取上述配制的10mg/kg亚甲蓝腹腔注射液2ml，溶于18ml生理盐水中，充分混匀，制成0.3mg/ml亚甲蓝腹腔注射液20ml，以大鼠体重为依据，按照0.33ml/100g用量使用，即得1mg/kg的实际用量。 

7)氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，分子式C19H15C1N4，白色至浅黄色结晶粉末，用作分析试剂和色谱分析试剂，sigma公司进口，避光保存。 

8)1％TTC溶液：取0.1gTTC粉末，溶于10ml纯水中，充分混匀，制成1％TTC溶液10ml，用于脑片的染色，用时避光，37℃。 

9)成年雄性SD大鼠，体重280-320g，由军事医学科学院实验动物中心提供，饲养在室温22-25℃，12h昼夜循环交替，自由饮食。所有动物实验流程均符合动物实验伦理委员会的规定。 

10)大脑中动脉闭塞性缺血模型的制备：选用体重范围在280～350g的雄性SD大鼠，于术前12h禁食，自由饮水，以1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g)腹腔注射实施麻醉后，将大鼠固定于操作台上，腹面朝上，从颈部正中剪开皮肤，剥离暴露出颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)，和颈外动脉(ECA)。经ECA将线栓插入至大脑中动脉，系紧结扎线，即刻给予腹腔注射亚甲蓝，消毒并缝合皮肤。 

效果验证： 

应用神经功能评分和脑梗死体积测定作为亚甲蓝治疗效果验证的方法，具体实施如下： 

1)神经功能评分 

手术后24h实施神经功能评分，采取三种评分方法：Longa评分法、爬格实验、肢体放置测验对大脑中动脉闭塞性缺血后的大鼠神经功能进行评价。分值越大，神经功能损伤越严重。采用单因素方差分析，用P值判断统计学差异。 

2)脑梗死的测定 

以大脑视交叉为中心，做冠状切片6片，每片2mm，脑切片置于1％TTC溶液中避光室温孵育20min，然后用4％多聚甲醛室温固定2h，置换清水后，平铺扫描仪上扫描入电脑。用image J软件计算梗塞百分比。采用单因素方差分析，用P值判断统计学差异。 

结果发现：应用本发明公开的浓度的亚甲蓝溶液在大鼠行MCAO手术后即刻、5h、10h给予腹腔注射后，能显著降低大鼠的脑梗死体积，改善神经功能，提高大鼠的行为能力。 

实施实例一： 

亚甲蓝(1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg)腹腔注射对MCAO大鼠急性脑缺血损伤的保护作用 

1、材料： 

1)戊巴比妥钠(Pelltobarbitalum Natricum)：德国进口，北京试剂公司分装，批号020402，有效期2015年3月。 

2)1％戊巴比妥钠注射液制备：以德国Merck公司生产的戊巴比妥钠为基础，取1g戊巴比妥钠粉末，溶于100ml生理盐水中，充分混匀，制成1％戊巴比妥钠注射液100ml，用于动物麻醉，以大鼠体重为依据，按照0.5ml/100g用量使用。 

3)0.9％生理盐水：石家庄四药有限公司生产，国药准字H13023200，有效期至2015年1月29日。 

4)亚甲蓝(methylene blue，MB)分子式C16H18C1N3S是杂环芳香族染料，属于噻嗪类染料家族，无臭深蓝色晶体，溶于水和氯仿，但不溶于酒精，避光保存，Amresco公司生产，有效期至2015年1月。 

5)10mg/kg亚甲蓝腹腔注射液：以Amresco公司生产的亚甲蓝为基础，称取90mg亚甲蓝粉末，溶于30ml生理盐水中，充分混匀，制成3mg/ml亚甲蓝腹腔注射液30ml，以大鼠体重为依据，按照0.33ml/100g用量使用，即得10mg/kg的实际用量。 

6)5mg/kg亚甲蓝腹腔注射液：取上述配制的10mg/kg亚甲蓝腹腔注射液10ml，溶于10ml生理盐水中，充分混匀，制成1.5mg/ml亚甲蓝腹腔注射液20ml，以大鼠体重为依据，按照0.33ml/100g用量使用，即得5mg/kg的实际用量。 

7)1mg/kg亚甲蓝腹腔注射液：取上述配制的10mg/kg亚甲蓝腹腔注射液2ml，溶于18ml生理盐水中，充分混匀，制成0.3mg/ml亚甲蓝腹腔注射液20ml，以大鼠体重为依据，按照0.33ml/100g用量使用，即得1mg/kg的实际用量。 

8)氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，分子式C19H15ClN4，白色至浅黄色结晶粉末，用作分析试剂和色谱分析试剂，sigma公司生产，避光保存，有效期至2015年8月。 

9)1％TTC溶液：以sigma公司生产的TTC为基础，取0.1gTTC粉末，溶于10ml纯水中，充分混匀，制成1％TTC溶液10ml，用于脑片的染色，用时避光，37℃。 

10)成年雄性SD大鼠，体重280-320g，由军事医学科学院实验动物中心提供，饲养在室温22-25℃，12h昼夜循环交替，自由饮食。所有动物实验流程均符合动物实验伦理委员会的规定。 

11)大脑中动脉闭塞性缺血模型的制备： 

A.动物选择：选用体重范围在280～350g的雄性SD大鼠，于术前12h禁食，自由饮水。 

B.手术操作：以1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g)腹腔注射实施麻醉后，将大鼠固定于操作台上，腹面朝上，从颈部正中剪开皮肤，剥离暴露出颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)，和颈外动脉(ECA)。经ECA将线栓插入至大脑中动脉，系紧结扎线消毒并缝合皮肤。 

C.给药方式与剂量：于模型制作后即刻、5h、10h三次给予腹腔注射亚甲蓝溶液(1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg)。 

D.模型成功入选标准：大鼠麻醉苏醒后按Zea Longa(0-4分)5分制评分标准进行神经功能缺失程度评分。 

a)0分：无神经功能缺失症状，活动正常者； 

b)1分：不能伸展对侧前爪者； 

c)2分：爬行时出现向左转圈者； 

d)3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒者； 

e)4分：不能自发行走，意识丧失者。 

E.模型排除标准 

a)依据Zea Longa5分制评分法，神经功能缺失体征评分低于1分者； 

b)开颅发现并发蛛网膜下腔出血者； 

c)脑组织切片HE染色无缺血病理改变者； 

d)TTC染色未见缺血灶者； 

e)缺血24h内死亡者。 

2、方法： 

(1)大脑中动脉闭塞性缺血模型的制备：体重280～320g的雄性SD大鼠，称重，1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(0.5ml/100g)，仰卧位固定在鼠手术板上，充分暴露颈部。颈前正中切口，分离筋膜，暴露右侧颈动脉，向近心端游离颈总动脉(CCA)约0.2cm，向远心端游离颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。在ECA上穿两条结扎线，一根在分叉处打松结，一根尽量靠近远心端结扎，ICA上夹动脉夹，在已分离的CCA近心段夹动脉夹。提起ECA上远心端结扎线，电凝器熔断ECA，于ECA靠近远心端处(约距离动脉分叉3mm处)剪一小口，将尼龙线栓从剪好的小口置入ECA，向前推进经CCA到ICA动脉夹处扎紧ECA上原来松结的结扎线，放开ICA上的动脉夹，继续向前推进线栓，至标记处(1.8-2.0cm)，此时大鼠呼吸可有短暂加速，提示模型成功。再次扎紧ECA上的结扎线，剪断线栓，放开CCA上动脉夹，即刻腹腔注射给予亚甲蓝(Methylene blue，MB)治疗(A组：l mg/kg，B组：5mg/kg，C组：10mg/kg)，对照组(N组)给予相同量的生理盐水。确认大鼠无活动出血后，消毒皮肤、缝合切口。将大鼠放置于干净通风的鼠笼内单笼饲养，维持笼内温度25℃左右。观察大鼠一般情况至麻醉苏醒。期间于手术后5h、10h两次腹腔注射追加给药，剂量同前。 

(2)神经功能缺损检测：手术后24h实施神经功能评分，采取三种评分方法：Longa评分法、爬格实验、肢体放置测验对大脑中动脉闭塞性缺血大鼠神经功能进行评价。 

Zea Longa(0-4分)5分制评分标准进行神经功能缺失程度评分。0分：无神经功能缺失症状，活动正常者；1分：不能伸展对侧前爪者；2分：爬行时出现向左转圈者；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒者：4分：不能自发行走，意识丧失者。 

肢体放置测验：肢体放置于三种独立刺激(视觉、触觉、本体感觉)以评测运动感觉完整性。具体实验有：前肢放置实验，包括(1)视觉亚实验，即前方刺激：实验者将动物握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10cm处向桌面缓慢斜线靠近(此时桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反应为前肢即刻抓向桌面，损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。0分-动物肢体放置反应正常；1分-反应延迟但不超过2s；2分-反应延迟且超过2s。侧方刺激，此时桌子位于动物侧方，其余实验方法及评分标准同前方刺激。(2)触觉亚实验，将动物置于桶状凹陷实验器内，使其前爪悬空，此时大鼠应该既看不见，也不能用胡须触及桌面，用其前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅达皮肤和毛发，动物反应及评分同视觉亚实验，触觉刺激同样分前方及侧方刺激。(3)本体觉亚实验，操作及评分同触觉亚实验，仅刺激深度不同，本体觉亚实验给予前爪较大压力，刺激深达肌肉及关节，该亚实验只有前方刺激。动物前肢放置实验总分范围为0～10分，功能损伤越重，得分越高。 

爬格实验：主要检测实验动物的视觉、触觉以及前肢对感觉及运动的整合能力。整个空格的面积为10cm×ll0cm，由许多正方形小网格组成(面积9cm²)，小网格网丝的直径为1.0mm，放置在离地面1m的高度。大鼠自由从空格的一端爬向另一端，行进中脑缺血对侧前肢掉入网格一次，记为失误一分，失误是由脑组织缺血损伤导致的运动功能失调。 

(3)脑梗死体积检测：神经功能评分结束后，大鼠行颈椎脱臼处死，快速分离出脑组织，腹面向上，放入脑模，以大脑视交叉为中心，做冠状切片6片(视交叉前面取两片，视交叉后面四片)，每片2mm，脑切片置于1％TTC溶液中避光室温孵育20min，然后用4％多聚甲醛室温固定2h，置换清水后，平铺扫描仪上扫描入电脑。用image J软件计算梗塞百分比，公式如下： 

矫正脑梗死体积(％)＝[LT-(RT-RI)]/LT×100％(LT：左侧大脑半球体积，RT：右侧大脑半球体积，RI：梗死部分体积)。 

(4)数据统计：以神经功能评分和脑梗死率的测定作为定量考察指标，分析亚甲蓝组与对照组大鼠的差别。采用单因素方差分析，用P值判断统计学差异。 

3、结果： 

神经功能评分 

亚甲蓝的三个剂量组(A，B，C)与对照组(N)相比，神经功能总评分分数均显示下降，表明经不同剂量亚甲蓝治疗后，大鼠的神经功能得到不同程度的改善(如下表所示)。 

表.亚甲蓝对永久性脑缺血大鼠神经功能的影响 

N：生理盐水组；A：1mg/kgMB；B：5mg/kgMB；C：10mg/kg.n＝15 

脑梗死的测定 

假手术组(sham)大鼠脑组织未见到梗死区域，由大脑中动脉局灶性脑缺血24h后，对照组(N)大鼠出现了明显的脑梗死灶，经三个剂量(A，B，C)的亚甲蓝治疗后，虽然仍可见清晰的脑梗死灶，但与对照组相比，脑梗死体积均显著降低，其中，以B组(5mg/kg)降低最为显著(图1)。 

4、结论 

采用本发明的方法，在适宜时间注射合适剂量的亚甲蓝，可以提高大鼠等动物对抗急性脑缺血损伤的能力，该发明有望为临床提供一种脑卒中后的急救措施，减轻患者因为得不到及时救治带来的永久性神经功能损伤。 

附图说明

图.亚甲蓝对永久性脑缺血大鼠脑梗死体积的影响.a)大鼠大脑中动脉闭塞性缺血24h后TTC染色的结果；b)脑梗死体积的统计分析结果。*：P＜0.05，**：P＜0.01，与生理盐水组比较，n＝25.N：生理盐水组；A：1mg/kg MB；B：5mg/kg MB；C：10mg/kg。 

Claims (4)

1.亚甲蓝在制备增强人或动物对抗急性脑缺血损伤的药物和保健品方面的应用。

2.亚甲蓝作为添加剂或辅料在制备增强人或动物对抗急性脑缺血损伤的食品和保健品方面的应用。

3.根据权利要求1和2所述的应用，其中所说的急性脑缺血损伤为由脑动脉粥样硬化造成的栓塞，或由纤维素、血小板、白细胞、胆固醇结晶所组成的微栓子形成的微栓塞，或由血液粘度和凝固性的血液成分改变以及由心脏病引起的血流动力学改变造成的脑供血不足，在一定时间(脑缺血3天)内得不到溶栓治疗，或错过黄金治疗期对脑组织造成的损伤。该损伤既包括神经功能的改变，也包括脑组织的病变。

4.根据权利要求1和2所述的应用，其中所说对抗急性脑缺血损伤为对抗急性脑缺血后引起的永久性缺血(非缺血再灌注)损伤的能力。包括神经功能的改善，以及脑组织病变的减缓。