CN116686704A - 一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法，涉及扩繁技术领域。本发明所述方法包括如下步骤：将豌豆土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h，将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，从而获得大量豌豆毛状根。本发明提供一种土培苗直接诱导毛状根方法，适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过直接诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导和扩繁。
Description
技术领域
本发明属于扩繁技术领域，具体涉及一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法。
背景技术
豌豆作为重要的经济作物，目前，对豌豆的育种研究方兴未艾，利用植物遗传转化体系对豌豆进行遗传改良一直以来都是大家关注的热点。豌豆再生体系育种周期过长，而且需要各种植物激素。利用发根农杆菌直接诱导豌豆外植体，可以实现豌豆毛状根体系的快速繁殖作，能直观的观察和研究豌豆毛状根体系和相关基因的功能验证。
目前，对豌豆毛状根的诱导，多采用无菌苗的形式。其中，相关文献报道多采用无菌苗进行处理，无菌苗成本较高，且对菌体污染和烟苗生长要求很高，需要相关仪器设备，不利于研究和生产，从而制约了毛状根的诱导效率。近年来，相关文献报道了发根农杆菌(ARqua1、K599)可以诱导豌豆无菌苗发根，但并未有相关文献报道土培苗可以直接诱导豌豆毛状根方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，通过直接诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导，适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导。
为解决上述技术问题，本发明是采用下述技术方案实现的：
本发明提供一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：
将豌豆土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；
将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；
将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；
将筛选出来含有毛状根植株的毛状根进行继代培养和扩增培养；
作为一种优选实施方式，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
作为一种优选实施方式，所述发根农杆菌包括A4、R1000、R1601、K599中的任意一种。
作为一种优选实施方式，将豌豆土培苗的叶片剪成(1～2)cm×(1～2)cm，加入侵染液中，侵染5～10min后，进行共培养。
作为一种优选实施方式，将经侵染后的外植体在暗培养结束后，转移至含有50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基中，培养2～3周。
作为一种优选实施方式，所述诱导培养基组分如下：
20×大量元素母液：NH4NO333.0 g，KNO338.0 g，MgSO4·7H2O 7.4g，KH2PO43.4g；
200×微量元素母液：KI 0.166g，H3BO31.24 g，MnSO4·4H2O 4.46g，ZnSO4·7H2O1.72g，Na2MnO·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O0.005g；
200×铁盐母液：FeSO4·7H2O 5.56g，EDTA-Na2·2H2O 7.46g；
200×有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB60.1 g，VB10.1 g，甘氨酸0.4g；
20×钙盐母液：CaC126.64 g；
所述诱导培养基的制备方法如下：
组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L，之后121℃高温灭菌15min备用；
MS液体培养基的配制：
20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL；
200×铁盐母液5mL，20×Ca盐母液50mL；
200×有机母液5mL，调pH到5.8-6.2。(容到1L容量瓶中)
作为一种优选实施方式，所述豌豆土培苗为3～4周龄土培苗。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
1、本发明提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：将豌豆土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，利用发根农杆菌诱导豌豆土培苗产生毛状根。
2、本发明提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，通过研究发现，侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，并用等体积MS液体进行重悬制得，所述发根农杆菌(A4、R1000、R1601、K599)的在OD值在0.8时，能够高效诱导出毛状根，且A4农杆菌诱导效率最高，可以达到70％的诱导率，诱导的毛状根可以持续生产，作为生化反应器进行相关实验探究。
3、本发明提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导和扩繁。
通过对比MS、1/2MS、1/4MS、B5培养基发现1/2MS配养基效果最好。
附图说明
图1是本发明实施例提供的采用一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法对土培苗外植体的诱导过程示意图；图中：A：4周的豌豆幼苗；B：诱导7d发根的外植体；C：14d以后的毛状根；D：21d以后转移到筛选培养基；E：28d长出毛状根植株；F:42d以后的毛状根植株；G:60d以后的毛状根植株。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
需要说明的是，所述诱导培养基组成如下：
20×大量元素母液：NH4NO333.0 g，KNO338.0 g，MgSO4·7H2O 7.4g，KH2PO43.4g；
200×微量元素母液：KI 0.166g，H3BO31.24 g，MnSO4·4H2O 4.46g，ZnSO4·7H2O1.72g，Na2MnO·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O0.005g；
200×铁盐母液：FeSO4·7H2O 5.56g，EDTA-Na2·2H2O 7.46g；
200×有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB60.1 g，VB10.1 g，甘氨酸0.4g；
20×钙盐母液：CaC126.64 g；
具体地，所述诱导培养基的制备方法如下：
组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L，之后121℃高温灭菌15min备用；
MS液体培养基的配制：
20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL；
200×铁盐母液5mL，20×Ca盐母液50mL；
200×有机母液5mL，调pH到5.8-6.2。(定容到1L容量瓶中)
本实施例中，1/2MS培养基培养基(1L)的配制如下：
在MS液体培养基的基础上，加入3g植物凝胶，应当理解，需要先将MS液体培养基调pH至5.8后，再加入植物凝胶。
实施例1
步骤一：将土培苗的豌豆外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。
具体地，将4周龄的豌豆土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将豌豆土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养48h，所述共培养的培养基为1/2MS培养基，暗培养48h后，此时，外植体分化形成毛状根。
步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪取3cm毛状根在加入50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的豌豆毛状根。
步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
步骤五：将经诱导培养产生的毛状根苗进行炼苗，栽入土中扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
本实施例中，将所述豌豆毛状根放置于50mg/mL头孢的1/2MS培养基培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的豌豆毛状根。需要说明的是，将3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。
实施例2
步骤一：将土培苗的豌豆外植体用野生型R1000发根农杆菌侵染液侵染。
具体地，将4周龄的豌豆土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将豌豆土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染10min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为1/2MS培养基，暗培养24后，此时，外植体分化形成毛状根。
步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去2cm毛状根在加入50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基上进行筛选培养，2周后，筛选出生长速度快的豌豆毛状根。
步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
步骤五：将经诱导培养产生的毛状根苗进行炼苗，栽入土中扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
本实施例中，将所述豌豆毛状根放置于50mg/mL头孢的1/2MS培养基培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的豌豆毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。
实施例3
步骤一：将土培苗的豌豆外植体用野生型R1601发根农杆菌侵染液侵染。
具体地，将4周龄的豌豆土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将豌豆土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染10min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养48h，所述共培养的培养基为1/2MS培养基，暗培养48h后，此时，外植体分化形成毛状根。
步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去2-3cm毛状根在加入50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的豌豆毛状根。
步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
步骤五：将经诱导培养产生的毛状根苗进行炼苗，栽入土中扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
本实施例中，将所述豌豆毛状根放置于50mg/mL头孢的1/2MS培养基培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的豌豆毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。
实施例4
步骤一：将土培苗的豌豆外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。
具体地，将4周龄的豌豆土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将豌豆土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为1/2MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。
步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的豌豆毛状根。
步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
步骤五：将经诱导培养产生的毛状根苗进行炼苗，栽入土中扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
本实施例中，将所述豌豆毛状根放置于50mg/mL头孢的1/2MS培养基培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的豌豆毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。
实施例5
步骤一：将土培苗的豌豆外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。
具体地，将4周龄的豌豆土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将豌豆土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为1/2MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。
步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基上进行筛选培养，2周后，筛选出生长速度快的豌豆毛状根。
步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
步骤五：将经诱导培养产生的毛状根苗进行炼苗，栽入土中扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
本实施例中，将所述豌豆毛状根放置于50mg/mL头孢的1/2MS培养基培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的豌豆毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。
实施例6
步骤一：将土培苗的豌豆外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。
具体地，将4周龄的豌豆土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将豌豆土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为1/2MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。
步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的豌豆毛状根。
步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量豌豆毛状根。
本实施例中，将所述豌豆毛状根放置于50mg/mL头孢的1/2MS培养基培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的豌豆毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。
本领域技术人员应当理解，所述豌豆土培苗也可以选用3周龄，本发明在此不做限制。
本发明实施例1～3为采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，发根农杆菌(A4、R1000、R1601、K599)直接诱导豌豆土培苗的结果。其中，不同菌种的总侵染株数均为100株，诱导结果请参见表1。
表1实施例1～3中发根农杆菌(A4、R1000、R1601、K599)直接诱导豌豆土培苗的结果
| 菌种 | 总侵染株数/株 | 发根数量/株 | 诱导率/％ |
| A4 | 100 | 77 | 77 |
| R1000 | 100 | 76 | 76 |
| R1601 | 100 | 60 | 60 |
| K599 | 100 | 84 | 84 |
根据表格1可知，发根农杆菌A4、R1000、R1601、K599直接诱导豌豆土培苗的诱导率均达到60％以上，具有较好的诱导效果。
本发明实施例4～6为采用A4发根农杆菌，在不同OD值(600)0.8时，对豌豆土培苗的诱导及扩繁的测试结果。不同OD值(600)下，A4发根农杆菌的总侵染株数均为100株，其诱导结果请参见表2。
表2不同OD值(600)0.8时，对豌豆土培苗的诱导及扩繁的测试
| OD值(600) | 总侵染株数/株 | 发根数量/株 | 诱导率/％ |
| 1.0 | 100 | 57 | 57 |
| 0.9 | 100 | 60 | 60 |
| 0.8 | 100 | 76 | 76 |
| 0.7 | 100 | 60 | 60 |
| 0.7 | 100 | 50 | 54 |
通过研究发现，侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，并用等体积MS液体进行重悬制得，所述发根农杆菌A4在OD值在0.8时，能够高效诱导出毛状根，且A4农杆菌诱导效率最高，可以达到70％的诱导率，诱导的毛状根可以持续生产，作为生化反应器进行相关实验探究。
由此可知，本发明提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，能够利用发根农杆菌诱(A4、R1000、R1601、K599)导豌豆土培苗产生毛状根，其适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过直接诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：以豌豆土培幼苗的嫩组织为外植体，经发根农杆菌侵染后，于共培养基上暗培养24～48h；将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，得毛状根植株；
所述共培养基为改良1/2MS培养基；
所述发根诱导培养基为含头孢的1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述豌豆土培幼苗为3～4周龄苗；
所述嫩组织包括叶片。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用发根农杆菌制备得到的侵染液进行侵染，所述侵染液的制备方法：包括利用OD600为0.8的发根农杆菌的菌液进行离心，菌体与等体积MS液体混合重悬，得所述侵染液。
4.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述侵染的时间为5～10min。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述发根农杆菌的种类包括A4、K599、R1601、R1000中的任意一种。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每L所述MS培养基由20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL，200×铁盐母液5mL，20×Ca盐母液50mL和200×有机母液5mL组成，调pH到5.8-6.2；
每L所述20×大量元素母液包括以下组成：NH4NO3 33.0g，KNO3 38.0g，MgSO4·7H2O7.4g，KH2PO4 3.4g；
每L所述200×微量元素母液包括以下组成：KI 0.166g，H3BO3 1.24g，MnSO4·4H2O4.46g，ZnSO4·7H2O 1.72g，Na2MnO·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O0.005g，CoCl2·6H2O 0.005g；
每L所述200×铁盐母液包括以下组成：FeSO4·7H2O 5.56g，EDTA-Na2·2H2O 7.46g；
每L所述200×有机母液包括以下组成：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB6 0.1g，VB1 0.1g，甘氨酸0.4g；
每L所述20×钙盐母液包括以下组成：CaC12 6.64g。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将经侵染后的外植体在暗培养结束后，转移至含有50mg/mL含有头孢的改良的1/2MS培养基培养基中，培养2～3周。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，得毛状根植株后，还包括将筛选出来含有毛状根植株的毛状根进行继代培养和扩增培养。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述继代培养在MS培养基中进行，扩增培养在土中进行。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，在经所述继代培养后，还包括将最终诱导产生的毛状根苗进行炼苗，栽入土中进行扩增培养。
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| CN202310301760.5A CN116686704A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法 |
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CA2840550A1 (en) * | 2011-07-22 | 2013-01-31 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plant transformation method |
| CN111513084A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-11 | 郑州轻工业大学 | 一种复合根瘤菌剂及其制备方法和应用 |
| CN113832178A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-12-24 | 浙江省农业科学院 | 一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法 |
-
2023
- 2023-03-24 CN CN202310301760.5A patent/CN116686704A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| Title |
|---|
| 梅错;刘志鹏;: "发根农杆菌介导的箭?豌豆毛状根遗传转化体系的建立", 中国草地学报, no. 05, 25 September 2020 (2020-09-25), pages 1 - 7 * |
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