CN116676355A - 一种催化合成山莨菪碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，提供了一种催化合成山莨菪碱的方法，它是以莨菪碱为底物,以异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷为诱导表达剂，用重组菌株催化莨菪碱合成山莨菪碱，在合成过程中，加入0.1~1mmol/L水杨酸和0.02~0.1 mmol/L的硝酸银的混合溶液。本发明的有益效果是：本发明构建的重组大肠杆菌，快速高效生产山莨菪碱，添加的底物莨菪碱转化为山莨菪碱的转化率高达98%，阻断山莨菪碱继续转化为东莨菪碱，本发明是保护药用植物资源、提高生产效率和解决市场供需矛盾的一种行之有效的方法，解决我国山莨菪野生资源匮乏、有效组分含量低和生产成本高等问题，实现山莨菪碱的高效、优质生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种催化合成山莨菪碱的方法，具体地，它是利用大肠杆菌生物转化生产山莨菪碱，属于生物发酵领域。
背景技术
山莨菪碱是一种重要的生物碱药物，具有抗胆碱作用，可用于治疗多种疾病，如休克、眩晕等。现有技术中，山莨菪碱的生产主要通过植物提取和化学合成两种方法。然而，植物提取方法山莨菪碱产量低，成本高且药材资源匮乏。而化学合成方法则需要使用大量的有机溶剂，对环境不友好，如谢晶曦，等，山莨菪碱的全合成，药学学报，1980年07期，全合成是以呋喃为原料，合成6β-羟基托品酮,将羟基乙酰化后，再将3-位酮基催化还原为α-羟基,然后用乙酰托品酰氯酯化、水解而得。主要是以6β-乙酰氧基托品醇与乙酰托品酰氯的酯化反应及酯化物水解合成山莨菪碱的研究。因此，开发一种高效、环保的山莨菪碱生产方法具有重要意义。
市场对山莨菪药用植物资源需求巨大，仅靠野生资源难以解决供需矛盾，且野生资源过度采挖会造成物种濒危和环境破坏。但山莨菪人工栽种面临着繁殖系数低、生长年限长、环境复杂恶劣、土地限制使用、人工成本高等问题。
目前有文献报道东莨菪碱的合成，专利申请号201110087443.5，发明名称：一种催化合成东莨菪碱的方法和重组菌株，公开了一种重组菌株及利用该菌株催化合成东莨菪碱的方法。重组菌株中含有外源的三分三莨菪碱6β- 羟化酶基因，可将莨菪碱底物转化为东莨菪碱，转化效率达80％。但东莨菪碱和山莨菪碱的结构有明显区别，山莨菪碱的结构中2号碳上含有一个羟基（-OH），而东莨菪碱的结构中2号和3号碳之间含有一个环氧基团（-O-）。
东莨菪碱的合成相关报道较多，如 强玮，等，木本曼陀罗中催化东莨菪碱生物合成关键步骤的H6H基因克隆与表达分析，药学学报，2015, 50 (10): 1346−1355，公开了莨菪碱6β-羟化酶 (hyoscyamine 6 beta-hydroxylase, H6H) 是托品烷类生物碱 (tropanealkaloids, TAs)合成途径中的最后一个限速酶, 直接催化东莨菪碱的生物合成。
发明内容
为了解决目前山莨菪碱生产方法的缺陷，本发明提供了一种利用大肠杆菌生物转化生产山莨菪碱的方法。本发明克服了山莨菪碱在莨菪碱6 β-羟化酶的催化下继续转化为东莨菪碱的问题，得到大量山莨菪碱，解决目前市场上山莨菪药材资源匮乏的问题。
本发明是将山莨菪植物中转化莨菪碱为山莨菪碱的莨菪碱6 β-羟化酶基因转入大肠杆菌中，在重组大肠杆菌的培养基中添加莨菪碱作为底物，可快速生产大量山莨菪碱，添加水杨酸和硝酸银的混合溶液阻断生成的山莨菪碱继续转化为东莨菪碱。
本发明提供了一种催化合成山莨菪碱的方法，它是以莨菪碱为底物,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导表达剂，用重组菌株催化莨菪碱合成山莨菪碱，在合成过程中，加入0.1~1mmol/L水杨酸和0.02~0.1 mmol/L的硝酸银的混合溶液。
其中，所述的莨菪碱的浓度为200~1000mg/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为：0.02~0.1mmol/L。进一步优选地，所述的莨菪碱的浓度为400~700mg/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为：0.04~0.1mmol/L。更进一步优选地，所述的莨菪碱的浓度为500mg/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为：0.1mmol/L。
优选地，在合成过程中，加入0.6mmol/L水杨酸和0.04mmol/L的硝酸银的混合溶液。
所述的重组菌株来源于植物山莨菪中的莨菪碱6 β-羟化酶H6H的CDS序列构建表达载体，pET30a作为表达载体完成重组质粒构建，构建含有H6H的重组大肠杆菌RosettaDE3的宿主细胞。
本发明合成方法，包括如下步骤：
a、获得山莨菪植物中莨菪碱6 β-羟化酶全序列及CDS序列；
b、根据a步骤的目标序列设计引物，进行PCR扩增；
c、提取pET30a质粒：质粒提取试剂盒提取含有pET30a质粒的大肠杆菌中的pET30a质粒；
d、重组质粒pET30a-AtaH6H的构建：对目的基因和pET30a质粒分别用限制性内切酶BamHI和NotI进行处理，将酶切回收后的目的基因和线性化载体按照比例进行连接反应；
e、制备大肠杆菌感受态细胞，然后导入构建有H6H目标序列的pET30a表达载体的质粒，培养纯化；
f、取重组大肠杆菌于LB+Kan 200 mg/L的培养基中活化、扩大培养到OD600为0.8~1.5时；同时添加莨菪碱和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，设置初始发酵pH值为4.0~7.0，发酵温度为16~36℃；24h后添加水杨酸和硝酸银的混合溶液；48h后12000 rpm离心1 min，收集上清液。
进一步优选地，步骤f中发酵pH值为6.0；发酵温度为28℃。
本发明的有益效果是：本发明构建的重组大肠杆菌，快速高效生产山莨菪碱，添加的底物莨菪碱转化为山莨菪碱的转化率高达98%，阻断山莨菪碱继续转化为东莨菪碱，本发明是保护药用植物资源、提高生产效率和解决市场供需矛盾的一种行之有效的方法，解决我国山莨菪野生资源匮乏、有效组分含量低和生产成本高等问题，实现山莨菪碱的高效、优质生产。
附图说明
图1是山莨菪重组大肠杆菌生长的菌落。
图2是高效液相色谱法测定培养液中莨菪碱和山莨菪碱的含量。
实施方式
实施例1 制备含有山莨菪植物莨菪碱6 β-羟化酶基因的重组大肠杆菌
1、通过NCBI官网查找获得山莨菪植物中莨菪碱6 β-羟化酶全序列及CDS序列。
2、根据所查找的目标序列设计引物，进行PCR扩增。
3、pET30a质粒的提取：质粒提取试剂盒提取含有pET30a质粒的大肠杆菌中的pET30a质粒。
4、重组质粒pET30a-AtaH6H 的构建：对目的基因和pET30a质粒分别用限制性内切酶BamHI和NotI进行处理，将酶切回收后的目的基因和线性化载体按照合适的比例进行连接反应，连接温度为16℃，时间14 h。
5、制备大肠杆菌感受态细胞，然后加入构建有H6H目标序列的pET30a表达载体的质粒，金属浴上热激，培养纯化，设计引物进行PCR，再进行核酸琼脂糖凝胶电泳，验证PET30a表达载体成功转入目标大肠杆菌，得到的山莨菪重组大肠杆菌转化菌落如图1。
实施例2 重组大肠杆菌莨菪碱转化为山莨菪碱的最佳转化条件筛选试验
一、高效液相色谱测定莨菪碱和山莨菪碱的含量
取重组大肠杆菌发酵离心后的液体培养基，0.22um滤膜过滤，进行莨菪碱和山莨菪碱含量测定。测定条件如下：岛津LC-2030plus，色谱柱:Inertsil ODS-3 5μm C18 4.6×250mm(UP)，以20mmol/L KH2PO4溶液(含0.05%三乙胺，用磷酸调节至6.0)-乙腈(80:20)为流动相。流速:0.8m1/min。柱温:30℃，检测波长:210nm。
二、底物莨菪碱浓度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度、转化温度、转化pH值对山莨菪碱产量及转化率的影响
取重组大肠杆菌于LB+200mg/L Kan的培养基中活化、扩大培养，通过单因素试验分别筛选得到底物莨菪碱最佳添加浓度为500mg/L、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷最佳添加浓度为0.1mmol/L、最佳初始转化pH值为6.0、最佳转化温度为28℃，具体筛选试验见表1-表4。
表1 底物莨菪碱浓度对山莨菪碱产量的影响
表2 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度对山莨菪碱产量的影响
表3 转化温度对山莨菪碱产量的影响
表4 转化pH值对山莨菪碱产量的影响
实施例3 本发明合成工艺中阻断剂的选择实验
一、水杨酸对山莨菪碱产量的影响
取重组大肠杆菌于LB+200mg/L Kan的培养基中活化、扩大培养到OD600为1.0时，添加500mg/L莨菪碱和1.0mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；设置初始发酵pH值为6.0，发酵温度为28℃；24h后分别添加0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L的水杨酸溶液作为阻断剂，处理48h后收获，12000 rpm离心1 min，收集上清液，得到实验数据如表5。
转化率（%）=（山莨菪碱产量/莨菪碱添加量）×100%。
表5水杨酸对山莨菪碱产量的影响
根据表5的数据，可以得出以下结论：与对照组相比，添加水杨酸显著提高了山莨菪碱的产量。在0~1.0mmol/L的水杨酸浓度范围内，随着水杨酸浓度的增加，山莨菪碱的产量呈现出先增加后降低的趋势。当水杨酸浓度为0时，山莨菪碱的产量最低，仅为89.6mg。而在水杨酸浓度为0.6mmol/L时，山莨菪碱的产量达到最高，为431.5mg。然而，当水杨酸浓度继续增加时，山莨菪碱的产量开始逐渐降低。水杨酸的最佳处理浓度为0.6mmol/L。
二、硝酸银对山莨菪碱产量的影响
取重组大肠杆菌于LB+200mg/L Kan的培养基中活化、扩大培养到OD600为1.0时，添加500mg/L莨菪碱和1.0mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；设置初始发酵PH值为6.0，发酵温度为28℃；24h后分别添加0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L的硝酸银溶液作为阻断剂，处理48h后收获，12000 rpm离心1 min，收集上清液，得到实验数据如表6。
表6硝酸银对山莨菪碱产量的影响
由表6可知，与对照组相比，添加硝酸银显著提高了山莨菪碱的产量。在0~0.1mmol/L的硝酸银浓度范围内，随着硝酸银浓度的增加，山莨菪碱的产量呈现出先增加后降低的趋势。当硝酸银浓度为0时，山莨菪碱的产量最低，仅为79.2mg。而在硝酸银浓度为0.04mmol/L时，山莨菪碱的产量达到最高，为263.8mg。然而，当硝酸银浓度继续增加时，山莨菪碱的产量开始逐渐降低。硝酸银的最佳处理浓度为0.04mmol/L。
三、水杨酸和硝酸银混合溶液处理时间对山莨菪碱产量的影响
取重组大肠杆菌于LB+200mg/L Kan的培养基中活化、扩大培养到OD600为1.0时，添加500mg/L莨菪碱和1.0mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；设置初始发酵PH值为6.0，发酵温度为28℃；24h后添加0.6mmol/L水杨酸和0.04mmol/L的硝酸银混合溶液作为阻断剂，分别处理12、24、36、48、60、72、84和96h后收获，12000 rpm离心1 min，收集上清液，得到实验数据如表7。
表7水杨酸和硝酸银混合溶液处理时间对山莨菪碱产量的影响
由表7可知，当添加0.6 mmol/L水杨酸和0.04 mmol/L的硝酸银混合溶液处理时间为12h时，山莨菪碱的产量最低为65.8mg，转化率仅为13.2%；处理 48h后山莨菪碱的产量最高，达到了490.1mg，莨菪碱的转化率为98%，此后随着处理时间的增加，山莨菪碱产量变化不大。水杨酸和硝酸银混合溶液的最佳处理时间为48h。
在生物体内合成的路线中，山莨菪碱只是合成东莨菪碱的中间产物，添加莨菪碱后作为底物后，依次转化为山莨菪碱，山莨菪碱再转化为东莨菪碱，目的产物山莨菪碱的收获量很少。而通过添加特定浓度的水杨酸和硝酸银的混合溶液，可以阻断重组大肠杆菌继续将山莨菪碱转为东莨菪碱的途径，获得大量目的产物山莨菪碱，解决了目前市场上山莨菪药材资源匮乏的问题。
实施例4 催化合成山莨菪碱的方法
按实施例1制备重组大肠杆菌；取重组大肠杆菌于LB+Kan 200 mg/L的培养基中活化、扩大培养到OD600为0.8~1.5时；同时添加莨菪碱500mg/L和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.1mmol/L，设置初始发酵pH值为6.0，发酵温度为28℃；24h后添加水杨酸0.6mmol/L和硝酸银0.04mmol/L的混合溶液；48h后12000 rpm离心1 min，收集上清液。检测上清液中山莨菪碱的含量如图2所示。
实施例5 催化合成山莨菪碱的方法
按实施例1制备重组大肠杆菌；取重组大肠杆菌于LB+Kan 200 mg/L的培养基中活化、扩大培养到OD600为0.8~1.5时；同时添加莨菪碱200mg/L和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.02mmol/L，设置初始发酵pH值为4.0，发酵温度为16℃；24h后添加水杨酸0.1mmol/L和硝酸银0.02mmol/L的混合溶液；48h后12000 rpm离心1 min，收集上清液。
实施例6 催化合成山莨菪碱的方法
按实施例1制备重组大肠杆菌;取重组大肠杆菌于LB+Kan200mg/L的培养基中活化、扩大培养到OD600为0.8~1.5时;同时添加莨菪碱1000mg/L和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.1mmol/L，设置初始发酵pH值为7.0，发酵温度为32°C; 24h后添加水杨酸1 mmol/L和硝酸银0.1 mmol/L的混合溶液;48h后12000rpm离心1 min，收集上清液。
Claims (8)
1.一种催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：它是以莨菪碱为底物,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导表达剂，用重组菌株催化莨菪碱合成山莨菪碱，在合成过程中，加入0.1~1mmol/L水杨酸和0.02~0.1mmol/L的硝酸银的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：所述的莨菪碱的浓度为200~1000mg/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.02~0.1mmol/L。
3.根据权利要求2所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：所述的莨菪碱的浓度为400~700mg/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.04~0.1mmol/L。
4.根据权利要求3所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：所述的莨菪碱的浓度为500mg/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.1mmol/L。
5.根据权利要求1所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：在合成过程中，加入0.6mmol/L水杨酸和0.04mmol/L的硝酸银的混合溶液。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：所述的重组菌株来源于植物山莨菪中的莨菪碱６β-羟化酶H6H的CDS序列构建表达载体，pET30a作为表达载体完成重组质粒构建，构建含有H6H的重组大肠杆菌Rosetta DE3的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、获得山莨菪植物中莨菪碱6 β-羟化酶全序列及CDS序列；
b、根据a步骤的目标序列设计引物，进行PCR扩增；
c、提取pET30a质粒：质粒提取试剂盒提取含有pET30a质粒的大肠杆菌中的pET30a质粒；
d、重组质粒pET30a-AtaH6H的构建：对目的基因和pET30a质粒分别用限制性内切酶BamHI和NotI进行处理，将酶切回收后的目的基因和线性化载体进行连接反应；
e、制备大肠杆菌感受态细胞，然后导入构建有H6H目标序列的pET30a表达载体的质粒，培养纯化；
f、取重组大肠杆菌于LB+Kan 200 mg/L的培养基中活化、扩大培养到OD600为0.8~1.5时；同时添加莨菪碱和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，设置初始发酵pH值为4.0~7.0，发酵温度为16~36℃；24h后添加水杨酸和硝酸银的混合溶液；48h后12000 rpm离心1 min，收集上清液。
8.根据权利要求7所述的催化合成山莨菪碱的方法，其特征在于：步骤f中发酵pH值为6.0；发酵温度为28℃。
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