CN116660550A - 一种dgat2的抑制剂pf-06424439用于缓解疼痛的方法 - Google Patents

一种dgat2的抑制剂pf-06424439用于缓解疼痛的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种DGAT2的抑制剂PF‑06424439用于缓解疼痛的方法，涉及生物医学技术领域，本申请中提供了DGAT2作为缓解疼痛的靶点在制备缓解疼痛相关疾病中的应用，所述DGAT2是脂滴中重要成分甘油三酯合成的关键限速酶。通过体内外实验探究甘油三酯合成的关键限速酶二酯酰甘油酰基转移酶2(DiacylglycerolAcyltransferase2,DGAT2)的抑制剂PF‑06424439减少小胶质细胞中脂滴形成后对疼痛的影响及其可能的机制，从脂质代谢角度为缓解疼痛提供一种新的思路和方法。

Description

一种DGAT2的抑制剂PF-06424439用于缓解疼痛的方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种DGAT2的抑制剂PF-06424439用于缓解疼痛的方法。
背景技术
据统计，我国慢性疼痛的患病率达到35.9％。除去本身的不适外，慢性疼痛使得患者饱受睡眠不足、无法完成日常任务、失业、焦虑甚至抑郁的困扰，严重影响患者的身心健康和生活质量，引发一系列个人及社会问题。其发病原因主要有神经系统损伤、肿瘤、糖尿病继发神经炎症、外周炎性损伤等，主要表现为痛觉过敏、痛觉超敏或自发痛。
小胶质细胞是中枢神经系统中固有的免疫细胞，可调节脑和脊髓的稳态。近年来小胶质细胞在病理性疼痛产生和维持过程中的作用受到了重视。认为小胶质细胞对外界刺激反应灵敏，激活后形态发生明显变化，具有更强的吞噬及运动能力，可以进一步释放促炎因子，参与疼痛的发生和维持。可见小胶质细胞与炎症、疼痛有着密不可分的关系。
脂滴是储存细胞内中性脂质的球形细胞器，存储大量的甘油三酯和胆固醇酯，外有被整合了很多蛋白质的磷脂单层膜包裹。人们对脂滴的认知已经从简单的脂质储存发展到可以参与并影响细胞功能状态的细胞器。过去更多地关注在肝脏、心脏等一些外周疾病或肿瘤，直至近两年逐渐在中枢神经系统疾病中受到关注。研究发现，在衰老或中风、帕金森、阿尔茨海默病等退行性疾病中，出现小胶质细胞内脂滴显著增多的现象，并引起了ROS释放的增多、线粒体功能障碍、小胶质细胞吞噬功能的降低，并提示脂滴可能与炎症直接相关，但现有技术中对于脂滴与慢性疼痛之间的关系并没有相关描述。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中缺乏针对慢性疼痛的治疗药物的技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本申请提供了DGAT2作为缓解疼痛的靶点在制备缓解疼痛相关疾病中的应用，所述DGAT2是脂滴中重要成分甘油三酯合成的关键限速酶。
优选的，所述疼痛相关疾病为炎症性疼痛。
优选的，所述DGAT2作为靶点，应用DAGT2抑制剂PF-06424439减少甘油三酯的合成、干预脂滴生成、减少促炎因子的释放，从而达到缓解疼痛的目的。
本申请还提供了一种缓解疼痛的药物，包括DGAT2抑制剂PF-06424439；
所述PF-06424439分子式为C22H26CIN7O。
本申请还提供了DGAT2抑制剂PF-06424439缓解LPS引发疼痛的验证实验，包含以下步骤：
(1)分离培养脊髓来源的小胶质细胞；
(2)鞘内注射DGAT2抑制剂PF-06424439或DGAT2抑制剂PF-06424439预处理的小胶质细胞；
(3)Vonfrey纤维丝机械痛评定。
优选的，步骤(2)中具体步骤如下：实验用25g左右龄雄性ICR小鼠，由实验动物中心提供；
剃除小鼠下背部毛发，酒精棉球擦拭消毒，大拇指食指指腹固定小鼠两侧髂骨，使脊柱位于髂骨连线的中点上，并竖直，
此时可以观察到鼠尾根立起，将已经吸过药或细胞的针垂直刺入脊柱于髂骨的交汇处，有穿透感，快速推入，并静置1～2sec，确保完全进入，注射药物时小鼠尾巴出现震颤样摆动，注射成功。
优选的，步骤(3)具体步骤如下：测试前小鼠需放入Plexiglas cages每天2h，适应1到3天；
测试当天待小鼠安静至少20min后再进行，使用0.16g、0.4g、0.6g、1g和2g针进行，每次测量间隔5-10s；
测量时首先用0.16g的针找准小鼠脚心，待接触后轻微用力使针弯曲，如没有反应记o，有反应记x。
优选的，测量过程中，如果出现反应，则待安静后再用0.16g的针刺激，0.16g持续反应，测4次即可；
若从0.16g-2.0g均不疼，则只需要五次测量即可；
如果没有反应，换0.4g,若此时出现反应，则再使用0.16g的针刺激；如此循环，测量6次，可得出小鼠的痛阈阈值。
本发明通过体内外实验探究甘油三酯合成的关键限速酶二酯酰甘油酰基转移酶2(DiacylglycerolAcyltransferase 2,DGAT2)的抑制剂PF-06424439减少小胶质细胞中脂滴形成后对疼痛的影响及其可能的机制，从脂质代谢角度为缓解疼痛提供一种新的思路和方法。
附图说明
图1为本发明所需的体外制备小胶质细胞被激活并积聚脂滴的模型。(图1A，左图是相差显微镜下拍摄的ICR小鼠脊髓来源的原代小胶质细胞，右图是经免疫细胞化学染色Iba1阳性；图1B，Bodipy染料染色显示经5μg/ml的LPS刺激1h、3h、6h、12h、18h、24h不同时间后小胶质细胞脂滴生成的情况，统计结果见最右下图。)
图2为本发明所述的体外实验中应用DGAT2抑制剂PF-06424439预处理小胶质细胞后可缓解LPS对细胞的影响。
图3为本发明所述的体内实验证实DGAT2抑制剂PF-06424439可缓解LPS引发的疼痛。
具体实施方式
以下对本发明作进一步地详细说明。
DGAT2作为缓解疼痛的靶点在制备缓解疼痛相关疾病中的应用，所述DGAT2是脂滴中重要成分甘油三酯合成的关键限速酶。
所述疼痛相关疾病为炎症性疼痛。
所述DGAT2作为靶点，应用DAGT2抑制剂PF-06424439减少甘油三酯的合成、干预脂滴生成、减少促炎因子的释放，从而达到缓解疼痛的目的。
本申请还提供了一种缓解疼痛的药物，包括DGAT2抑制剂PF-06424439。
以下结合具体的实施例对上述内容进行阐述：
实施例1.小胶质细胞被激活并积聚脂滴的模型制备
请参阅图1，包含以下步骤：
(1)分离培养脊髓来源的小胶质细胞
准备解剖液放入培养皿中，加入抗生素后置于冰上预冷。使用75％酒精对乳鼠进行消毒，棉球擦干，使用眼科剪将乳鼠断头后沿背部中线剪开皮肤，暴露出脊柱，找到颈部椎孔，将椎管左右两侧剪开椎板，暴露完整脊髓，用镊子将脊髓两边与椎管的连接松解开，从脊髓腹侧将脊髓挑出，置于解剖液中。
在体视显微镜下仔细剥除脊膜后，用显微剪将脊髓剪碎，以0.125％胰酶消化12min左右，中间每隔5min摇晃一次，加等量含10％FBS的培养基终止消化，过筛网后，离心机1000rpm离心5min，吸去液体，加入新的培养基吹打均匀，再离心一次后加入完培吹打均匀，种于预先PDL包被的培养瓶，倒置培养10min后正置，此后每3天左右更换培养基。
约10天左右，待小胶质细胞长至80％左右，使用恒温摇床270r，37℃，12h后收集悬浮细胞，重新种至预先PDL包被的培养板中，以待后续使用。
(2)免疫细胞化学染色
小胶质细胞以5×104的密度种在提前用PDL包被的24孔板中圆玻片，待铺满后，弃去细胞培养基，加入预热后的PBS润洗细胞。
弃去PBS，加入4％多聚甲醛，固定30min。弃去甲醛后，用PBS润洗，室温洗3次，每次10min。
弃去1×PBS，轻轻滴加封闭液，每孔200μl，室温静置1h。吸弃封闭液，加入一抗Anti-Iba1(1:1000)，4℃，24h，PBS洗3次，每次10min。
加入二抗Alexa fluor 568goat anti-rabbit(1:1000)，4℃，避光孵育12h。弃去二抗，用PBS润洗，室温洗3次，10min/次。
加入Hochest(1:1000)，室温30min，PBS洗三遍，每次10min。最后封片，将圆玻片挑出，将有细胞一面朝下覆盖在滴有封片液的载玻片上，置于湿盒存放于4℃。注意过程中不要产生气泡。从加入二抗开始所有过程都避光。
(3)Bodipy染料染色
小胶质细胞以5×104的密度种在提前用PDL包被的24孔板中圆玻片，待细胞密度达到70％后添加LPS(终浓度为5μg/ml)作用不同时间，如上述(2)步骤，PBS润洗细胞、4％多聚甲醛固定，PBS润洗细胞，滴加封闭液室温封闭1h，吸去封闭液，添加Bodipy(1:500)室温孵育30min，PBS洗三遍，每次10min，封片，结果如图1所示。
实施例2.考察DAGT2抑制剂PF-06424439预处理对LPS刺激的小胶质细胞的影响
请参阅图2，包含以下步骤：
(1)分离培养脊髓来源的小胶质细胞
准备解剖液放入培养皿中，加入抗生素后置于冰上预冷。
使用75％酒精对乳鼠进行消毒，棉球擦干，使用眼科剪将乳鼠断头后沿背部中线剪开皮肤，暴露出脊柱，找到颈部椎孔，将椎管左右两侧剪开椎板，暴露完整脊髓，用镊子将脊髓两边与椎管的连接松解开，从脊髓腹侧将脊髓挑出，置于解剖液中。
在体视显微镜下仔细剥除脊膜后，用显微剪将脊髓剪碎，以0.125％胰酶消化12min左右，中间每隔5min摇晃一次，加等量含10％FBS的培养基终止消化，过筛网后，离心机1000rpm离心5min，吸去液体，加入新的培养基吹打均匀，再离心一次后加入完培吹打均匀，种于预先PDL包被的培养瓶，倒置培养10min后正置，此后每3天左右更换培养基。
约10天左右，待小胶质细胞长至80％左右，使用恒温摇床270r，37℃，12h后收集悬浮细胞，重新种至预先PDL包被的培养板中，以待后续使用。
(2)qRT-PCR实验
将纯化的小胶质细胞5×105密度种于六孔板，待细胞长至70％时候，添加LPS(终浓度为5μg/ml)作用18h后。
将纯化的小胶质细胞分三组，control组、LPS组以及DGAT2抑制剂PF-06424439+LPS组。其中DGAT2抑制剂PF-06424439作用浓度为20uM，预作用2h，LPS终浓度为5μg/ml，作用12h后。
使用RNA快速提取试剂盒提取RNA，在紫外分光光度计检测RNA浓度，后取1μg RNA模板置于无RNAase在八联管中，加入4μl DNA wiper，加dd H2O至16μl，混合均匀后离心，置于PCR设置42℃2min，流程结束后，每孔加入4μl HiScriptⅢRT SuperMix，混合均匀后李欣，置于PCR机器中，设置37℃2min，85℃5sec，4℃hold。后续进行荧光定量实时PCR，按照16μl体系进行，以18S为内部参考。
(3)Bodipy染料染色
小胶质细胞以5×104的密度种在提前用PDL包被的24孔板中圆玻片，待细胞密度达到70％后，分三组，control组、LPS组以及DGAT2抑制剂PF-06424439+LPS组。
其中DGAT2抑制剂PF-06424439作用浓度为20uM，预作用2h，LPS终浓度为5μg/ml，作用12h。PBS润洗细胞、4％多聚甲醛固定，PBS清洗后滴加封闭液室温封闭1h后吸去封闭液，添加Bodipy(1:500)室温孵育30min，PBS洗三遍，每次10min，封片。
(4)WesternBlot实验
纯化的小胶质细胞5×105密度种于六孔板中，待细胞长至70％时候，分三组，control组、LPS组以及DGAT2抑制剂PF-06424439+LPS组。
其中DGAT2抑制剂PF-06424439作用浓度为20uM，预作用2h，LPS终浓度为5μg/ml，作用12h。
提取细胞总蛋白，并用BCA法测定浓度。
通过聚丙烯凝胶电泳分离蛋白质，将胶上的蛋白质转移到PVDF膜上后，5％脱脂乳室温封闭2h后，加入Anti-P38抗体(1:1000)、Anti-PP38抗体(1:1000)4℃孵育过夜。弃去一抗，用1×TBST润洗，室温洗3次，10min/次。
弃去TBST，轻轻滴加使用二抗稀释液稀释的辣根过氧化物酶偶联的goat anti-rabbit(1:10000)，室温孵育2h。
弃去二抗，用1×TBST润洗，室温洗3次，10min/次，显影。
实验结果如图2所示，其中图2A，通过qRT-PCR显示经过5μg/ml LPS作用18h后，小胶质细胞内与甘油三酯合成关键的限速酶DGAT2明显表达上调(18s为内参)；图2B，经Bodipy染色发现DGAT2抑制剂PF-06424439预处理2h后能明显缓解LPS刺激小胶质细胞导致的脂滴增多；图2C，提取各组的RNA，经qRT-PCR发现DGAT2抑制剂PF-06424439预处理2h能明显降低LPS引发的促炎因子TNF-α、IL-1β、iNOS、COX2的水平，增高抑炎因子TGF-β的水平(18s为内参)；图2D，Western Blot实验显示此现象与P38的磷酸化水平有关。
实施例3.体内实验考察DGAT2抑制剂PF-06424439可缓解LPS引发的疼痛
(1)分离培养脊髓来源的小胶质细胞
准备解剖液放入培养皿中，加入抗生素后置于冰上预冷。
使用75％酒精对乳鼠进行消毒，棉球擦干，使用眼科剪将乳鼠断头后沿背部中线剪开皮肤，暴露出脊柱，找到颈部椎孔，将椎管左右两侧剪开椎板，暴露完整脊髓，用镊子将脊髓两边与椎管的连接松解开，从脊髓腹侧将脊髓挑出，置于解剖液中。
在体视显微镜下仔细剥除脊膜后，用显微剪将脊髓剪碎，以0.125％胰酶消化12min左右，中间每隔5min摇晃一次，加等量含10％FBS的培养基终止消化，过筛网后，离心机1000rpm离心5min，吸去液体，加入新的培养基吹打均匀，再离心一次后加入完培吹打均匀，种于预先PDL包被的培养瓶，倒置培养10min后正置，此后每3天左右更换培养基。
约10天左右，待小胶质细胞长至80％左右，使用恒温摇床270r，37℃，12h后收集悬浮细胞，重新种至预先PDL包被的培养板中，以待后续使用。
(2)鞘内注射DGAT2抑制剂或DGAT2抑制剂PF-06424439预处理的小胶质细胞
实验用25g左右龄雄性ICR小鼠，由实验动物中心提供。剃除小鼠下背部毛发，酒精棉球擦拭消毒，大拇指食指指腹固定小鼠两侧髂骨，使脊柱位于髂骨连线的中点上，并竖直，此时可以观察到鼠尾根立起，将已经吸过药或细胞的针垂直刺入脊柱于髂骨的交汇处，有穿透感，快速推入，并静置1～2sec，确保完全进入，注射药物时小鼠尾巴出现震颤样摆动，注射成功。
(3)Vonfrey纤维丝机械痛评定
测试前小鼠需放入Plexiglas cages每天2h，适应1到3天。测试当天待小鼠安静至少20min后再进行。使用0.16g、0.4g、0.6g、1g和2g针进行，每次测量间隔5-10s。
测量时首先用0.16g的针找准小鼠脚心，待接触后轻微用力使针弯曲，如没有反应记o，有反应记x，如果出现反应，则待安静后再用0.16g的针刺激，0.16g持续反应，测4次即可。
若从0.16g-2.0g均不疼，则只需要五次测量即可。如果没有反应，换0.4g,若此时出现反应，则再使用0.16g的针刺激；如此循环，测量6次，可得出小鼠的痛阈阈值。
实验结果如图3所示，其中，图3A，鞘内注射DGAT2抑制剂PF-06424439可缓解LPS刺激引发的痛阈下降；图3B,对比未经DGAT2抑制剂PF-06424439预处理，经DGAT2抑制剂PF-06424439预处理的小胶质细胞，即便LPS刺激12h后鞘内注射，可缓解痛阈阈值的下降。
综上所述，本申请中通过体内外实验探究甘油三酯合成的关键限速酶二酯酰甘油酰基转移酶2(DiacylglycerolAcyltransferase 2,DGAT2)的抑制剂PF-06424439减少小胶质细胞中脂滴形成后对疼痛的影响及其可能的机制，从脂质代谢角度为缓解疼痛提供一种新的思路和方法。

Claims (8)

1.DGAT2作为缓解疼痛的靶点在制备缓解疼痛相关疾病中的应用，其特征在于：所述DGAT2是脂滴中重要成分甘油三酯合成的关键限速酶。
2.根据权利要求1所述的DGAT2作为缓解疼痛的靶点在制备缓解疼痛相关疾病中的应用，其特征在于：所述疼痛相关疾病为炎症性疼痛。
3.根据权利要求1所述的DGAT2作为缓解疼痛的靶点在制备缓解疼痛相关疾病中的应用，其特征在于：所述DGAT2作为靶点，应用DAGT2抑制剂PF-06424439减少甘油三酯的合成、干预脂滴生成、减少促炎因子的释放，从而达到缓解疼痛的目的。
4.一种缓解疼痛的药物，其特征在于：包括DGAT2抑制剂PF-06424439。
5.DGAT2抑制剂缓解LPS引发疼痛的验证实验，其特征在于：包含以下步骤：(1)分离培养脊髓来源的小胶质细胞；
(2)鞘内注射DGAT2抑制剂PF-06424439或DGAT2抑制剂PF-06424439预处理的小胶质细胞；
(3)Vonfrey纤维丝机械痛评定。
6.根据权利要求5所述的DGAT2抑制剂PF-06424439缓解LPS引发疼痛的验证实验，其特征在于：步骤(2)中具体步骤如下：实验用25g左右龄雄性ICR小鼠，由实验动物中心提供；
剃除小鼠下背部毛发，酒精棉球擦拭消毒，大拇指食指指腹固定小鼠两侧髂骨，使脊柱位于髂骨连线的中点上，并竖直，
此时可以观察到鼠尾根立起，将已经吸过药或细胞的针垂直刺入脊柱于髂骨的交汇处，有穿透感，快速推入，并静置1～2sec，确保完全进入，注射药物时小鼠尾巴出现震颤样摆动，注射成功。
7.根据权利要求5所述的DGAT2抑制剂PF-06424439缓解LPS引发疼痛的验证实验，其特征在于：步骤(3)具体步骤如下：测试前小鼠需放入Plexiglas cages每天2h，适应1到3天；
测试当天待小鼠安静至少20min后再进行，使用0.16g、0.4g、0.6g、1g和2g针进行，每次测量间隔5-10s；
测量时首先用0.16g的针找准小鼠脚心，待接触后轻微用力使针弯曲，如没有反应记o，有反应记x。
8.根据权利要求7所述的DGAT2抑制剂PF-06424439缓解LPS引发疼痛的验证实验，其特征在于：测量过程中，如果出现反应，则待安静后再用0.16g的针刺激，0.16g持续反应，测4次即可；
若从0.16g-2.0g均不疼，则只需要五次测量即可；
如果没有反应，换0.4g,若此时出现反应，则再使用0.16g的针刺激；如此循环，测量6次，可得出小鼠的痛阈阈值。
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