CN116650898A - 过表达烷烃羟化酶基因和漆酶基因在降解ldpe中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及过表达烷烃羟化酶基因和漆酶基因在降解LDPE中的应用。本发明提供了过表达以下任一项基因在降解LDPE中的应用；(I)、编码烷烃羟化酶的基因；或(II)、编码烷烃羟化酶的基因和编码烷烃羟化酶辅酶的基因。本发明选用的底盘细胞是具有优秀胞外酶分泌能力的解脂耶式酵母Po1g，能够非常有效地降解和氧化疏水性底物，并且开发了用于遗传学和分子生物学的强大工具，因此该酵母最近已被用作模型生物研究参与代谢的代谢途径。因此本发明通过合成生物学方法改造解脂耶氏酵母，得到了具有分泌漆酶的解脂耶氏酵母，以及能够表达膜蛋白烷烃羟化酶的解脂耶式酵母。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及过表达烷烃羟化酶基因和漆酶基因在降解LDPE中的应用。
背景技术
塑料是现代世界中应用最广泛、最重要的材料之一。然而，塑料的巨大生产和滥用给环境带来了巨大的负担。通过生物方法回收利用废弃塑料与常规的化学回收和物理回收相比，存在着能耗小，污染小，成本低等优点。近年来，已经有众多通过系统生物学方法改造各种模式生物或非模式生物降解塑料的先例。聚乙烯又是诸多类型的塑料中降解难度偏大的一种，目前已经有多种野生菌从含聚乙烯废弃物的环境中分离出来，包括红球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、不动杆菌等。R.ruber C208是降解PE最有效的细菌之一，是从土壤中分离的革兰氏阳性细菌，能够以每周0.9％的速率降解未预处理的LDPE。用紫外光预处理LDPE后，PE的降解率增加。孵育后也检测到LDPE的分子量和分子数的变化。据报道，R.ruber C208也能够降解PS，8周后质量减轻0.8％。此外，有研究人员根据细菌代谢活性如ATP含量、ADP/ATP比值和细胞活性的变化，检测出R.rube ATCC 29672表现出降解PP的能力。将来源于假单胞菌的烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中进行异源表达后，低分子量聚乙烯的质量损失能够在50天内达到30％。利用来自Botrytis aclada(BaLac)和Bacillus subtilis(BsLac)的两个漆酶与三个介体ABTS,HBT,TEMPO组合6个漆酶介体系统，将经过UV预处理后的LDPE薄膜与漆酶-介体溶液在30℃条件下震荡共五天后，Mw最高减少52％，并且通过GC-MS检测到了酯、酸、酮和醇等产物。
现有的聚乙烯降解研究中，降解效果较好的菌株大部分都是从自然环境中分离出来的野生菌或野生菌群，但是大部分野生菌的基因组信息和代谢网络不清晰，难以进行基因操作。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了过表达烷烃羟化酶基因和漆酶基因在降解LDPE中的应用。本发明选用的底盘细胞是具有优秀胞外酶分泌能力的解脂耶式酵母Po1g，能够非常有效地降解和氧化疏水性底物，并且开发了用于遗传学和分子生物学的强大工具，因此该酵母最近已被用作模型生物研究参与代谢的代谢途径。因此本发明通过合成生物学方法改造解脂耶氏酵母，得到了具有分泌漆酶的解脂耶氏酵母，以及能够表达膜蛋白烷烃羟化酶的解脂耶式酵母。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了过表达以下任一项基因在降解LDPE中的应用；
(I)、编码烷烃羟化酶的基因；或
(II)、编码烷烃羟化酶的基因和编码烷烃羟化酶辅酶的基因。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述LDPE包括LDPE球和/或LDPE膜。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述编码烷烃羟化酶的基因包括：Pseudomonas aeruginosa PAO1来源的AlkB1和/或AlkB2；
所述编码烷烃羟化酶辅酶的基因包括：Pseudomonas aeruginosa PAO1来源的rubA1和/或rubB。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述编码烷烃羟化酶的基因具有：
(1)、如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述编码烷烃羟化酶辅酶的基因具有：
(4)、如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了表达模块，包括以下任一项基因；
(I)、编码烷烃羟化酶的基因；或
(II)、编码烷烃羟化酶的基因和编码烷烃羟化酶辅酶的基因。
在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中，所述编码烷烃羟化酶的基因包括：Pseudomonas aeruginosa PAO1来源的AlkB1和/或AlkB2；
所述编码烷烃羟化酶辅酶的基因包括：Pseudomonas aeruginosa PAO1来源的rubA1和/或rubB。
在本发明的一些实施方案中，上述表达模块，还包括：连接肽；
所述连接肽具有：
(7)、如SEQ ID NO:5或如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或
(8)、如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(7)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(9)、与(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:5的序列为：EAAAK。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:6的序列为：GGGGS。
本发明还提供了菌株，在底盘菌株中转化和/或导入上述表达模块。
在本发明的一些实施方案中，上述菌株中，所述底盘菌株包括：解脂耶氏酵母Po1g。
本发明还提供了信号肽基因，包括：野生型漆酶的SP1基因、白腐真菌的SP2基因、α-淀粉酶的AmyE基因、芳基磷酸-β-D-葡糖苷酶的BglC基因和/或胞外酯酶的LipB基因中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述信号肽基因中，所述SP1基因具有：
(10)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述SP2基因具有：
(13)、如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述AmyE基因具有：
(16)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或
(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述BglC基因具有：
(19)、如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；或
(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(21)、与(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述LipB基因具有：
(22)、如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；或
(23)、如(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(22)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(24)、与(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了上述信号肽基因在降解LDPE中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述LDPE包括LDPE球和/或LDPE膜。
本发明还提供了重组表达载体，包括上述信号肽基因和漆酶基因。
在本发明的一些实施方案中，上述重组表达载体中所述漆酶基因包括：Trametesmaxima(White-rotfungus)来源的Lac1。
在本发明的一些实施方案中，上述重组表达载体中所述Lac1的序列如SEQ ID NO:47所示。
本发明还提供了重组菌株，在底盘菌株中转化和/或导入上述重组表达载体。
在本发明的一些实施方案中，上述菌株中，所述底盘菌株包括：解脂耶氏酵母Po1g。
本发明还提供了上述表达模块、上述菌株、上述重组表达载体和/或上述重组菌株在降解LDPE中的应用。
本发明还提供了降解LDPE的方法，取预处理的LDPE与上述菌株或上述重组菌株的菌液混合。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述预处理采用含有氢氧化钠的乙醇溶液；所述氢氧化钠的浓度为5～15％(m/m)；所述乙醇溶液的浓度为60％(m/m)。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述氢氧化钠的浓度为15％(m/m)。
本发明提供了过表达以下任一项基因在降解LDPE中的应用；
(I)、编码烷烃羟化酶的基因；或
(II)、编码烷烃羟化酶的基因和编码烷烃羟化酶辅酶的基因。
本发明选用的底盘细胞是具有优秀胞外酶分泌能力的解脂耶式酵母Po1g，能够非常有效地降解和氧化疏水性底物，并且开发了用于遗传学和分子生物学的强大工具，因此该酵母最近已被用作模型生物研究参与代谢的代谢途径。因此本发明通过合成生物学方法改造解脂耶氏酵母，得到了具有分泌漆酶的解脂耶氏酵母，以及能够表达膜蛋白烷烃羟化酶的解脂耶式酵母。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示聚乙烯碱预处理的可能机理；
图2示预处理后LDPE球的微观形态变化；其中：(a)示未处理；(b)示5％NaOH+60％乙醇；(c)示10％NaOH+60％乙醇；(d)示15％NaOH+60％乙醇；
图3示LDPE球的ATR-FTIR图；
图4示预处理后LDPE膜的微观形态变化；其中：(a)示未处理，放大倍数为30倍；(b)示未处理，放大倍数为5000倍；(c)示5％NaOH+60％乙醇，放大倍数为30倍；(d)示5％NaOH+60％乙醇，放大倍数为5000倍；
图5示LDPE膜的ATR-FTIR图；
图6示烷烃羟化酶与聚乙烯作用示意图；
图7示烷烃羟化酶多拷贝表达菌株的构建；
图8示过表达烷烃羟化酶的解脂耶氏酵母处理后的LDPE膜表面形态；其中：(a)示未处理；(b)示Po1g未处理；(c)示YPE01未处理；(d)示YPE02未处理；(e)示YPE03未处理；(f)示YPE04未处理；(g)示YPE05未处理；(h)示YPE06未处理；(i)示15％NaOH+60％乙醇；(j)示Po1g预处理；(k)示YPE01预处理；(l)示YPE02预处理；(m)示YPE03预处理；(n)示YPE04预处理；(o)示YPE05预处理；(p)示YPE06预处理；
图9示过表达烷烃羟化酶的解脂耶氏酵母的生长曲线；
图10示过表达烷烃羟化酶的解脂耶氏酵母处理后的LDPE膜表面形态；其中：(a)示预处理；(b)示Po1g预处理；(c)示YPE01预处理；(d)示YPE02预处理；(e)示YPE03预处理；(f)示YPE04预处理；(g)示YPE05预处理；(h)示YPE06预处理；
图11示烷烃羟化酶及其辅酶与聚乙烯作用示意图；
图12示烷烃羟化酶及其辅酶多拷贝表达菌株的构建；
图13示过表达烷烃羟化酶的解脂耶氏酵母的生长曲线；
图14示LDPE质量损失；
图15示YAH13降解LDPE效果；其中：(a)示YAH13预处理LDPE球，放大倍数为30倍；(b)示YAH13预处理LDPE球，放大倍数为5000倍；
图16示漆酶与聚乙烯作用示意图；
图17示漆酶多拷贝表达菌株的构建；
图18示过表达漆酶的解脂耶氏酵母的生长曲线；
图19示工程解脂耶氏酵母处理后的LDPE球和LDPE膜表面微观形态；其中：(a)示15％NaOH+60％乙醇；(b)示Po1g；(c)示YPE07；(d)示YPE08；(e)示YPE09；(f)示YPE10；(g)示YPE11；(h)示15％NaOH+60％乙醇；(i)示Po1g；(j)示YPE07；(k)示YPE08；(l)示YPE09；(m)示YPE10；(n)示YPE11；其中：(a)～(g)为LDPE球；(h)～(n)为LDPE膜；
图20示漆酶活性示意图；
图21示聚乙烯样品质量损失。
具体实施方式
本发明公开了过表达烷烃羟化酶基因和漆酶基因在降解LDPE中的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本研究以解脂耶式酵母Po1g为底盘细胞，对聚乙烯降解酶漆酶和烷烃羟化酶及其辅酶的表达进行优化，并通过扫描电子显微镜及分析天平测定工程解脂耶式酵母对聚乙烯的降解效果。
本发明实施例1～实施例4中，
解脂耶氏酵母Po1g来源：Jolivalt C,Madzak C,Brault A,et al.Expressionoflaccase IIIb from the white-rot fungus Trametes versicolor in the yeastYarrowia lipolytica for environmental applications[J].Applied MicrobiologyandBiotechnology,2005,66(4):450-456.
本发明SC培养基包括：22g/L葡萄糖、6.7g/L YNB和2g/L drop-out混合粉末(腺嘌呤0.5、天冬酰胺2.0、丙氨酸2.0、苏氨酸2.0、精氨酸2.0、半胱氨酸2.0、谷酰胺2.0、甲硫氨酸2.0、谷氨酸2.0、对氨基苯甲酸0.2、肌醇2.0、丝氨酸2.0、赖氨酸2.0、酪氨酸2.0、异亮氨酸2.0、天冬氨酸2.0、甘氨酸2.0、脯氨酸2.0，单位均为g)及0.002g/L组氨酸、0.01g/L亮氨酸、0.002g/L尿嘧啶和0.002g/L色氨酸。
表1本发明所用引物
本发明实施例1～实施例4中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1聚乙烯的预处理
本发明先用化学方法对聚乙烯进行预处理，以期能够提高生物降解的效率。本实施例对于PE化学预处理的条件进行了初步探究。(如图1所示)
1、LDPE球的预处理
本实施例选择用碱水解方法对LDPE球(希恩思奥普德科技有限公司)进行预处理，选择对PET处理效果较好的氢氧化钠的乙醇溶液进行预处理。用5％NaOH+60％乙醇、10％NaOH+60％乙醇以及15％NaOH+60％乙醇三种预处理液对LDPE球进行预处理，用分析天平准确称取一定质量的LDPE球，于115℃反应15min，反应结束后用无菌水清洗LDP E球并烘干，使用扫描电子显微镜及FTIR表征降解效果。
如图2所示，经过碱预处理后的LDPE球样品表面形态发生改变，未进行预处理的LDPE球表面较为光滑(如图2(a)所示)，经过5％NaOH+60％乙醇、10％NaOH+60％乙醇以及15％NaOH+60％乙醇预处理后的LDPE球表面形态有所变化，且表面粗糙程度随NaOH浓度升高逐渐加重。未预处理的LDPE球在5000倍的条件下出现的褶皱为该样品本身的褶皱。在30倍条件下用扫描电镜观察发现不同条件预处理后的各个LDPE球表面粗糙程度相差不大。经过5％NaOH+60％乙醇处理后的LDPE球在500倍条件下，与未预处理LDPE球相比出现明显凹痕，在5000倍条件下，观察出现多处腐蚀(如图2(b)所示)。10％NaOH+60％乙醇处理后，LDPE球在500倍条件下出现明显粗糙程度加重，在5000倍条件下，LDPE球表面明显凹凸不平，并且比5％NaOH+60％乙醇条件下粗糙程度明显加深(如图2(c)所示)。15％NaOH+60％乙醇预处理后，LDPE球表面形态改变最为明显，在100倍条件下观察可以明显看出LDPE求表面出现密集的孔洞，5000倍条件下观察可以看出空洞直径在5μm左右(如图2(d)所示)。
15％NaOH+60％乙醇预处理后的LDPE球和未预处理的FTIR检测结果如图3所示。由图可知，LDPE球在718cm-1、1462cm-1、2847cm-1和2915cm-1处会出现特征峰，分别代表-CH2-的反对称伸缩振动、对称伸缩振动、剪式振动和伸缩摇摆振动。预处理后的LDPE球在837cm-1和1600cm-1处出现了微弱的吸收峰，对应的官能团分别为OH和C＝O。未处理的LDPE球在1456cm-1处微弱的吸收峰消失，对应的官能团为CH2。说明经过NaOH的醇溶液预处理后，聚乙烯碳链上出现了OH和C＝O这样的氧化了的官能团。
2、LDPE膜的预处理
鉴于15％NaOH+60％乙醇预处理LDPE球效果最为明显，因此本部分选用15％NaOH+60％乙醇预处理LDPE薄膜(Good fellow公司)，操作步骤同步骤1。
如图4所示，未预处理的LDPE薄膜表面较为光滑平整，经过15％NaOH+60％乙醇预处理后，LDPE薄膜表面不再平整，在5000倍放大条件下LDPE薄膜表面出现不规则的密集的孔洞，直径约为0.5μm。
如图5所示，与LDPE球相同，LDPE膜在718cm-1、1462cm-1、2847cm-1和2915cm-1处会出现特征峰，分别代表-CH2-的反对称伸缩振动、对称伸缩振动、剪式振动和伸缩摇摆振动。经过NaOH的醇溶液预处理后的LDPE膜，在1650cm-1、3170cm-1和3350cm-1处出现了微弱的吸收峰，对应的官能团分别为C＝O、C-H和OH。未处理的LDPE球在837cm-1处微弱的吸收峰消失，对应的官能团为OH。官能团C＝O、C-H和OH的出现证实了NaOH的醇溶液对LDPE膜有降解效果。
实施例2过表达烷烃羟化酶的工程解脂耶氏酵母降解聚烯烃的效果
1、外源烷烃羟化酶的过表达
有研究表明，来源于假单胞菌的烷烃羟化酶基因AlkB1和AlkB2在重组大肠杆菌中表达后能够降解LMWPE。本发明尝试在解脂耶氏酵母Po1g基础上表达外源烷烃羟化酶基因AlkB1和AlkB2，并测试其降解效果。AlkB1和AlkB2编码的烷烃羟化酶是一种膜蛋白，与聚乙烯作用效果如图6所示。
将AlkB1和AlkB2以解脂耶氏酵母进行密码子优化并合成，用表1所示引物进行PCR扩增，回收后得到含PINA1269同源臂的AlkB1和AlkB2基因片段。对载体PINA1269进行BamHI及KpnI双酶切，回收后得到线性载体PINA1269。利用SE连接酶对线性载体及目的基因片段进行组装，并转入大肠杆菌感受态，用表1所示引物对大肠杆菌转化子进行菌落PCR验证，验证结果正确后送测序，测序结果正确则得到重组大肠杆菌EPE01和EP E02。提取重组大肠杆菌质粒并用NotI酶切，回收的得到线性化的重组载体。将线性化的重组载体转化入Po1g中，用大肠杆菌菌落PCR相同引物进行解脂耶氏酵母菌落PCR验证，验证结果正确后送测序，若测序结果正确则得到YPE01和YPE02。具体构建过程如图7所示。
在添加约0.2g未处理或碱预处理后的LDPE样品的SC培养基中摇瓶培养工程解脂耶氏酵母YPE01及YPE02共7d，期间取适当时间点测OD600，7d后，将LDPE样品取出，并用无菌水洗涤后通过扫描电子显微镜观察聚乙烯表面形态。
如图9和表2所示，工程菌YPE01和YPE02生长情况好于野生菌Po1g，YPE01和YPE02经过7d后的OD600达到22左右，比Po1g7d后的OD600高出6左右。
表2过表达烷烃羟化酶的解脂耶氏酵母的生长曲线
图8中所示样品在30倍放大倍数下无明显差异，在5000倍的放大倍数下可以观察出诸如粗糙程度，空洞数量等差异。经出发菌Po1g降解7d后的LDPE球中，未预处理的样品与处理后的样品在相同放大倍数下相比，更为光滑平整，在5000倍的放大倍数下可以观察到经NaOH预处理后的样品孔洞数量及比未处理的样品明显增多，并且孔洞直径也更大，未预处理的样品上孔洞直径约为0.3μm(如图8(b)所示)，而预处理后的样品孔洞直径约为0.7μm(如图8(j)所示)。
经工程菌YPE01处理后的样品与经出发菌Po1g处理过的样品相比，孔洞数量明显增多，粗糙程度略有加深，且经过NaOH预处理后的样品比未处理后的样品孔洞数量增多，粗糙程度明显加深，未经预处理的样品孔洞直径约为10μm左右，经过预处理的样品上孔洞直径最大约为0.7μm(如图8(c)和图8(k)所示)。
经工程菌YPE02处理且未经NaOH预处理的样品表面比较光滑，孔洞数量很少，直径约为3μm左右(如图8(d)所示)。在30倍的放大倍数下观察，经NaOH预处理及工程菌YPE02处理过的样品与其他样品相比表面最为粗糙，空洞直径较大，约为7μm(如图8(i)所示)。
由实施例1可知，经过NaOH预处理后的LDPE球的降解效果明显优于未经过预处理的，因此本部分选用经NaOH预处理后的LDPE薄膜进行降解实验，降解方法同实施例1中的LDPE球。
如图10所示，在30倍的放大倍数下，聚乙烯膜表面出现较大孔洞，这是由于聚乙烯膜的碎片预处理后，会融化并黏附在一起，这些孔洞为碎片之间的空隙，并非NaOH或解脂耶氏酵母的降解所致。在5000倍的放大倍数下，可以观察出YPE01和YPE02处理后的LDPE膜表面出现较大孔洞，而除孔洞外的其他位置粗糙程度与Po1g处理后的LDPE膜比较相似。YPE01处理后的样品表面孔洞直径约为2μm，YPE02处理后的样品表面孔洞直径约为5μm。
实施例3外源烷烃羟化酶的优化表达
1、烷烃羟化酶有红氧还蛋白和红氧还蛋白还原酶两个辅酶，两个辅酶可以协助烷烃羟化酶与底物反应时的电子传递过程。图11为烷烃羟化酶及其辅酶与聚乙烯作用示意图。
本实施例在AlkB1和AlkB2后各连接两个辅酶基因rubA1和rubB，基因之间选取两种LINKER进行连接，分别为EAAAK(E)和GGGGS(G)，以筛选出能更有效提高烷烃羟化酶活性的Linker。
以解脂耶氏酵母进行密码子优化合成rubA1和rubB利用表1所示引物对基因AlkB1、AlkB2、rubA1和rubB进行PCR扩增，获得带有同源臂的DNA片段，再通过overlap将目的基因片段组装起来，获得带有PINA1269同源臂的目的基因片段，将对载体PINA1269进行BamHI及KpnI双酶切，回收后与目的基因片段进行SE连接，并转入大肠杆菌感受态，用表1所示引物对大肠杆菌转化子进行菌落PCR验证，验证结果正确后送测序，测序结果正确则得到重组大肠杆菌EPE03、EPE04、EPE05和EPE06。提取重组大肠杆菌质粒并用NotI酶切，回收的得到线性化的重组载体。将线性化的重组载体转化入Po1g中，用大肠杆菌菌落PCR相同引物进行解脂耶氏酵母菌落PCR验证，验证结果正确后送测序，若测序结果正确则得到YPE03、YPE04、YPE05和YPE06。具体构建过程如图12所示。
2、在添加约0.2g碱预处理后的LDPE样品的SC培养基中摇瓶培养工程解脂耶氏酵母YPE03、YPE04、YPE05及YPE06共7d，期间取适当时间点测OD600，7d后，用将LDPE样品取出，并用2％s十二烷基硫酸钠及无菌水洗涤后用扫描电子显微镜观察聚乙烯表面形态。
在过表达烷烃羟化酶基础上过表达辅酶的工程酵母YPE03、YPE04、YPE05和YPE06的生长情况与YPE01和YPE02非常接近(如图13和表2所示)。YPE03和YPE04相比YPE01降解聚乙烯的效果有所提升。
如图10所示，经过NaOH预处理的LDPE球的降解效果均优于未预处理的样品。在经过NaOH预处理的样品又经过YPE03和YPE04降解7d的LDPE球的表面形态变化最为明显，其中YPE03处理后的样品在5000倍的放大倍数下可以明显观察到有密集的孔洞，孔洞直径最大约为2μm，其表面粗糙程度与Po1g处理过的样品表面比较相似(如图8(m)所示)。
而YPE04处理后的样品表面在5000倍的放大倍数下可以观察出其他样品没有的凹凸不平，另外样品表面还出现了孔径较大的孔洞(如图8(n)所示)。YPE03和YPE04相比YPE01降解聚乙烯的效果有所提升，说明共表达烷烃羟化酶基因AlkB1及其辅酶基因后有利于LDPE降解效果的提升。
YPE05与YPE02相比，降解效果没有明显提升，孔洞数量及粗糙程度都比较相似(如图8(o)所示)。YPE06处理后的样品出现了其他样品没有出现的雪花状腐蚀，即样品表面粗糙程度加重(如图8(p)所示)。
3、由于YPE03、YPE04、YPE05及YPE06降解NaOH处理过的LDPE球效果均由于未处理过的LDPE球，因此，本部分选用NaOH处理过的LDPE膜进行降解实验。
在添加约0.2g碱预处理后的LDPE样品的SC培养基中摇瓶培养工程解脂耶氏酵母YPE03、YPE04、YPE05及YPE06共7d，期间取适当时间点测OD600，7d后，用将LDPE样品取出，并用无菌水洗涤后用扫描电子显微镜观察聚乙烯表面形态。结果如图10所示。
YPE03降解LDPE薄膜的效果明显优于YPE01，在5000倍的放大倍数下可以明显观察到部分位置出现较大空隙，且中间粘连的LDPE膜表面较为粗糙(如图10(e)所示)。
YPE04处理后的LDPE薄膜与YPE01相比粗糙程度加重，孔洞数量增多，但空洞直径略有降低，小于1μm(如图10(f)所示)。
YPE05处理后的LDPE膜与YPE02相比粗糙程度加重，空洞数量增加，孔洞直径减小，最大约为1μm(如图10(g)所示)。
YPE06处理后的样品与YPE02相比，粗糙程度也明显增加，且样品表面出现缝隙，宽度小于1μm(如图10(h)所示)。
与LDPE球降解效果相似，同时过表达烷烃羟化酶及其辅酶基因比单表达烷烃羟化酶基因降解LDPE膜的效果得到提升，其中YPE03，即过表达用EAAAK连接AlkB1、rubA1和rubB基因的工程菌降解效果最为明显。
4、目前报道的聚乙烯降解的质量损失水平普遍偏低，因此本部分选取扫描电子显微镜观察到的降解效果最为明显的YPE03和YPE04测量其质量损失，发酵7d后取出LDPE样品，用2％SDS溶液和双蒸水分别洗涤两次后，放入烘箱干燥。发酵前后均用分析天平精确称取LDPE样品质量并计算LDPE样品的质量损失，得到的结果如图14和表3所示。
如图14和表3所示，出发菌Po1g、YPE03和YPE04降解LDPE膜造成的质量损失均高于LDPE球。LDPE球的质量损失均不到1％，其中，YPE03和YPE04降解LDPE球的质量损失均约为0.6％，是出发菌Po1g的5倍左右。YPE03降解LDPE膜的质量损失为2.43％，是出发菌Po1g的5.02倍，YPE04降解LDPE膜的质量损失最大，为8.86％，是野生菌的18.3倍。造成LDPE膜相比LDPE球的质量损失更大的原因可能有两方面，一方面为LDPE膜表面积更大，更有利于微生物与底物的接触，另一方面，LDPE球纯度为工业级，工业级LDPE样品中含有添加剂或稳定剂，更不利于降解。
表3聚乙烯质量损失率
5、将本实验室先前构建的用于正十六烷降解的工程解脂耶氏酵母YAH13(202110818285.X)按照线条同条件培养，即在添加约0.2g未处理或碱预处理后的LDPE样品的SC培养基中摇瓶培养工程解脂耶氏酵母YAH13共7d，7d后，将LDPE样品取出，并用无菌水洗涤后通过扫描电子显微镜观察聚乙烯表面形态。结果如图15所示。
经过YAH13降解后的与处理过的LDPE球和LDPE膜表面均未出现孔洞或刻蚀现象，说明YAH13对聚乙烯几乎没有降解作用。
实施例4过表达漆酶的工程解脂耶氏酵母降解聚烯烃的效果
为了实现胞外漆酶的分泌，本实施例在取解脂耶氏酵母Po1g的基础上过表达来源于白腐真菌的漆酶基因。先前有研究比较了在解脂耶氏酵母中过表达连接两个信号肽的漆酶的活性，结果表明带有漆酶天然信号肽的重组漆酶表现出更高活性。本研究进一步筛选了不同来源的信号肽以期提高漆酶的分泌活性。胞外漆酶与聚乙烯作用过程如图所示，由解脂耶氏酵母分泌的重组漆酶与聚乙烯接触后，在聚乙烯碳链中引入羟基、羰基等一系列氧化基团，随后聚乙烯碳链可能断裂，生成长链脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸等聚乙烯低聚物。如图16所示。
1、不同信号肽的比较筛选
为了筛选出分泌漆酶的最优信号肽，本部分选取了漆酶野生型信号肽SP1，及与其同源度较高的白腐真菌的漆酶信号肽SP2，α-淀粉酶信号肽基因(AmyE)、芳基磷酸-β-D-葡糖苷酶信号肽基因(BglC)以及胞外酯酶信号肽基因(LipB)，以解脂耶氏酵母进行密码子优化并合成漆酶基因及五个信号肽基因(序列见表1)，构建解脂耶氏酵母带有不同信号肽的漆酶。引物设计时在基因两端增加同源臂序列及酶切位点。利用引物通过重叠延伸PCR将信号肽基因与漆酶基因lac组装起来，回收后得到目的基因片段，对载体PINA1269进行BamHI及KpnI双酶切，回收后得到线性载体PINA1269。利用SE连接酶将目的基因片段与载体片段进行组装，并转化入大肠杆菌感受态，利用引物进行大肠杆菌菌落PCR进行验证，挑选出正确的转化子进行测序，测序结果正确则得到重组大肠杆菌EPE07、EPE08、EPE09、EPE10及EPE11。提取重组大肠杆菌质粒，并用NotI进行单酶切，回收后得到线性化的重组载体。将线性化的重组载体转化入解脂耶氏酵母Po1g中，利用表1中的引物进行验证，挑取正确的转化子送测，若测序结果正确则得到重组解脂耶氏酵母YPE07、YPE08、YPE09、YPE10及YPE11。菌株构建过程如图17所示。
由于实施例1～实施例3中经过NaOH预处理的LDPE样品均比未处理的LDPE样品显示出更好的降解效果，因此本部分均选用经过NaOH预处理的LDPE样品进行降解实验。
在添加约0.2g碱预处理后的LDPE样品的SC培养基中摇瓶培养工程解脂耶氏酵母YPE07、YPE08、YPE09、YPE10及YPE11共7d，期间取适当时间点测OD600，7d后，用将LDPE样品取出，并用无菌水洗涤后用扫描电子显微镜观察聚乙烯表面形态。
如图18和表4所示，工程菌YPE07、YPE08、YPE09、YPE10和YPE11的生长情况均优于野生菌Po1g，YPE07、YPE08、YPE09和YPE10的生长情况比较相似，7d后的OD600可以达到20左右，YPE11在7d后的OD600在工程菌中最低，约为18左右。
表4过表达漆酶解脂耶氏酵母的生长曲线
如图19所示，解脂耶氏酵母处理后的LDPE球在放大5000倍的情况下可以观察出表面物理性质的差异。YPE07、YPE08、YPE10的降解效果更为明显。
其中YPE07处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度加深，孔洞数量明显增多，孔洞直径也变大，约为1μm(如图19(c)所示)。
YPE08处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相似，孔洞数量增多，孔洞直径也增大，最大为1μm左右(如图19(d)所示)。
YPE09处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相似，孔洞数量略有增多，孔洞直径相似，约为0.3μm(如图19(e)所示)。
YPE10处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相差不大，孔洞数量明显增多，直径增大，最大约为0.6μm左右(如图19(f)所示)。
YPE11处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相差不大，孔洞数量略有增多，直径增大，最大为0.8μm左右(如图19(g)所示)。
如图19所示，为解脂耶氏酵母处理后的LDPE膜表面微观形态。放大5000倍可以明显看出工程菌的降解效果比Po1g好。
YPE08、YPE10的降解效果更为明显。其中YPE07处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度加深，出现若干直径约为0.8μm的孔洞(如图19(j)所示)。YPE08处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相似，也没有出现孔洞，但出现一条平均宽度约为5μm的裂缝，裂缝处为不规则的锯齿状(如图19(k)所示)。
YPE09处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相似，出现若干直径约为1.2μm的孔洞(如图19(l)所示)。
YPE10处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相似，出现密集的直径约为1.2μm的孔洞(如图19(m)所示)。
YPE11处理后的样品表面与Po1g相比粗糙程度相似，出现了直径约为2至3μm的孔洞，但与其他工程菌相比空洞数量最少(如图19(n)所示)。
2、漆酶活性的测定
为了研究带有不同信号肽的漆酶降解聚乙烯的能力，本部分采用ABTS法每隔24h测定一次重组解脂耶氏酵母发酵液中的漆酶活性，结果如图20所示。
如图20和表5所示，解脂耶氏酵母漆酶活性均随培养时间增长逐渐升高，在第三天漆酶活性最高，随后活性有所降低，第五天和四六天漆酶活性略有升高，到第七天明显降低。所有重组解脂耶氏酵母漆酶活性均比野生型解脂耶氏酵母P明显提高，另外带有两个野生型信号肽的漆酶活性较高，与实施例4的步骤1中结果一致，与文献报道的野生型信号肽能够在解脂耶氏酵母中实现漆酶有效分泌且活性较高一致。
表5漆酶活性
其中，漆酶本身的信号肽SP1分泌的漆酶具有最高活性，为10.055U/mL，另外，连接芳基磷酸-β-D-葡糖苷酶信号肽基因(BglC)的漆酶活性也较高，对应的重组菌株YPE10降解效果也较好，最高值为9.139U/mL。
3、本部分结合上述实验结果选取了在扫描电子显微镜下降解效果最明显及分泌的重组漆酶活性较高的三株漆酶多拷贝表达菌，分别为YPE07、YPE08和YPE10进行降解实验，7d后取出LDPE样品，用2％SDS溶液和双蒸水分别洗涤两次后，放入烘箱干燥。发酵前后均用分析天平精确称取LDPE样品质量并计算LDPE样品的质量损失，得到的结果如图21和表6所示。
如图21和表6所示，经过碱预处理后的LDPE样品的质量损失大多都在1％左右，不同类型的底物对于降解率也有影响。
表6聚乙烯质量损失
YPE07对于LDPE小球的降解率较出发菌Po1g有明显增高，而YPE07对于LDPE薄膜的降解率较出发菌P降低。
另外，YPE10对于LDPE球的降解率高达8.55％，但是对于LDPE薄膜的降解率却只有1.03％。其中一个可能原因为LDPE球纯度为工业级，工业级LDPE样品中含有添加剂或稳定剂，而LDPE薄膜样品的纯度很高，YPE07和YPE08对于LDPE球中的其他组分有降解效果,对聚乙烯降解效果不明显。YPE08对LDPE膜的降解效果优于LDPE球，推测是由于其对LDPE样品中聚乙烯组分的降解效果优于其他菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.过表达以下任一项基因在降解LDPE中的应用；
(I)、编码烷烃羟化酶的基因；或
(II)、编码烷烃羟化酶的基因和编码烷烃羟化酶辅酶的基因。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码烷烃羟化酶的基因包括：Pseudomonas aeruginosa PAO1来源的AlkB1和/或AlkB2；
所述编码烷烃羟化酶辅酶的基因包括：Pseudomonas aeruginosa PAO1来源的rubA1和/或rubB；
所述编码烷烃羟化酶的基因具有：
(1)、如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述编码烷烃羟化酶辅酶的基因具有：
(4)、如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
3.表达模块，其特征在于，包括以下任一项基因和连接肽；
(I)、编码烷烃羟化酶的基因；或
(II)、编码烷烃羟化酶的基因和编码烷烃羟化酶辅酶的基因；
所述连接肽具有：
(7)、如SEQ ID NO:5或如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或
(8)、如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(7)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(9)、与(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列。
4.菌株，其特征在于，在底盘菌株中转化和/或导入如权利要求3所述的表达模块。
5.信号肽基因，其特征在于，包括：野生型漆酶的SP1基因、白腐真菌的SP2基因、α-淀粉酶的AmyE基因、芳基磷酸-β-D-葡糖苷酶的BglC基因和/或胞外酯酶的LipB基因中的一种或多种；
所述SP1基因具有：
(10)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述SP2基因具有：
(13)、如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述AmyE基因具有：
(16)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或
(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述BglC基因具有：
(19)、如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；或
(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(21)、与(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述LipB基因具有：
(22)、如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；或
(23)、如(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(22)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(24)、与(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的信号肽基因在降解LDPE中的应用。
7.重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求5所述的信号肽基因和漆酶基因。
8.重组菌株，其特征在于，在底盘菌株中转化和/或导入如权利要求7所述的重组表达载体。
9.如权利要求3所述的表达模块、如权利要求4所述的菌株、如权利要求7所述的重组表达载体和/或如权利要求8所述的重组菌株在降解LDPE中的应用。
10.降解LDPE的方法，其特征在于，取预处理的LDPE与如权利要求4所述的菌株或权利要求8所述的重组菌株的菌液混合；所述预处理采用含有氢氧化钠的乙醇溶液；所述氢氧化钠的浓度为5～15％(m/m)；所述乙醇溶液的浓度为60％(m/m)。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 徐子晴;罗美玲;高佳;李琳琳;王战勇;: "PHBV降解菌株的选育及其降解性能研究", 塑料科技, no. 11, 10 November 2011 (2011-11-10) * |
| 莫乔程;赵永平;朱苏文;程备久;谢传晓;: "玉米漆酶ZmLac5基因拟南芥遗转转化", 安徽农业大学学报, no. 04, 30 July 2012 (2012-07-30) * |
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