CN116650623A

CN116650623A - 表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌药物中的应用

Info

Publication number: CN116650623A
Application number: CN202310554836.5A
Authority: CN
Inventors: 马庆良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2023-05-17
Filing date: 2023-05-17
Publication date: 2023-08-29

Abstract

本发明公开了表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明还公开了表皮生长因子联合顺铂在制备治疗顺铂耐药卵巢癌的药物中的应用，所述顺铂耐药卵巢癌为顺铂耐药SKOV3细胞型卵巢癌。本发明从细胞水平和动物水平考察EGF对人卵巢癌顺铂耐药细胞生长的影响，实验结果显示，EGF能够显著抑制SKOV3‑DDP高剂量耐药细胞移植瘤的生长，EGF和DDP联用对人卵巢癌SKOV3‑DDP移植瘤生长的抑制作用优于EGF、DDP单用；本发明揭示EGF能够逆转SKOV3型卵巢癌顺铂耐药性，且EGF和顺铂联用逆转效果更为显著，为治疗顺铂耐药SKOV3型卵巢癌提供新思路。

Description

表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌药物中的应用。

背景技术

卵巢癌严重威胁女性的生命安全，而卵巢癌耐药复发是临床卵巢癌治疗的难题，目前尚无很好的解决方案。有研究证明，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)能够促进卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移。在大鼠卵巢癌细胞NuTu-19及大鼠顺铂耐药卵巢癌细胞中，与亲本细胞相比，顺铂耐药细胞系通过MAPK途径表现出增强的EGF刺激作用。EGFR-DNR(酪氨酸激酶结构域被敲除的EGFR)能够显著降低EGF通过MAPK途径诱导细胞信号转导的能力，并可部分逆转耐药细胞对顺铂(DDP)的耐药性。提示EGFR在体内赋予NuTu-19细胞生长优势。因此，EGFR阻断剂可能最终被证明是治疗顺铂敏感和顺铂耐药的卵巢癌的有用的治疗工具。在人卵巢癌细胞A2780细胞中，过度活跃的EGF受体、Jaks和Stat3信号促进顺铂耐药卵巢癌细胞的集落形成能力、运动和迁移。即现有技术证实EGF能促进卵巢癌顺铂耐药细胞的细胞活力，下调EGF表达可能逆转卵巢癌顺铂耐药。

而本发明旨在考察EGF对人卵巢癌顺铂耐药细胞生长的体内外抑制作用，为顺铂耐药卵巢癌治疗提供新思路。

发明内容

本发明的目的是提供表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明证实EGF能够逆转SKOV3型卵巢癌顺铂耐药性，且EGF和顺铂联用逆转效果更为显著，为治疗顺铂耐药SKOV3型卵巢癌提供新思路，在临床治疗顺铂耐药卵巢癌中具有重要价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌的药物中的应用。

进一步地，所述顺铂耐药卵巢癌为顺铂耐药SKOV3细胞型卵巢癌。

本发明还提供表皮生长因子联合顺铂在制备治疗顺铂耐药卵巢癌的药物中的应用，所述顺铂耐药卵巢癌为顺铂耐药SKOV3细胞型卵巢癌。

本发明还提供一种逆转卵巢癌顺铂耐药性的药物，包含有效剂量的表皮生长因子。

进一步地，还包含有效剂量的顺铂。

进一步地，所述卵巢癌为SKOV3细胞型卵巢癌。

进一步地，还包含药学上可接受的辅料。

进一步地，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂和矫味剂中任一种或几种。

进一步地，所述药物包括注射制剂。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从细胞水平和动物水平考察EGF对人卵巢癌顺铂耐药细胞生长的影响，体外细胞实验结果显示，与对照组相比，EGF能够抑制SKOV3-DDP耐药细胞的细胞活力。动物模型体内实验结果表明，EGF(28ng/kg)能够显著抑制SKOV3-DDP高剂量(2μg/mL)耐药细胞移植瘤的生长，EGF和DDP联用对人卵巢癌SKOV3-DDP移植瘤生长的抑制作用优于EGF、DDP单用。

本发明揭示EGF能够逆转SKOV3型卵巢癌顺铂耐药性，且EGF和顺铂联用逆转效果更为显著，本发明为治疗顺铂耐药SKOV3型卵巢癌提供新思路，在临床治疗顺铂耐药卵巢癌中具有重要价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为2.5％FBS下，EGF对A2780-DDP耐药细胞活力的影响A：24h；B：48h；C：72h；与模型组比较，***P＜0.001；

图2为10％FBS下，EGF对A2780-DDP耐药细胞活力的影响A：24h；B：48h；C：72h；与模型组比较，***P＜0.001；

图3为10％FBS下，EGF对SKOV3-DDP(0.1μg/mL)耐药细胞活力的影响A：24h；B：48h；C：72h；与模型组比较，***P＜0.001；

图4为10％FBS下，EGF对SKOV3-DDP(2μg/mL)耐药细胞活力的影响A：24h；B：48h；

图5为EGF对低剂量(0.1μg/mL)SKOV3-DDP耐药细胞移植瘤生长的影响A：裸鼠体重变化曲线；B：肿瘤体积生长曲线；C：肿瘤体积统计图；D：各组肿瘤图；E：瘤重统计图；

图6为EGF对高剂量(2μg/mL)SKOV3-DDP耐药细胞移植瘤生长的影响A：肿瘤体积生长曲线；B：裸鼠体重变化曲线；C：肿瘤体积统计图；D：各组肿瘤图；E：瘤重统计图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1主要材料

4周龄BALB/c，Nu/Nu裸鼠60只，体质量(20±1)g，雌性，购于上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2014-0008。小鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心，饲养环境为昼夜12h，室温(25±1)℃，湿度60％±10％，自由摄水摄食，适应性饲养1周后开始实验。

DMEM培养基(批号：MA0212)、青霉素链霉素(批号：MA0110)、CCK-8试剂(批号：MA0218)和顺铂(批号：MB1055)，均购自大连美仑生物技术有限公司；Recombinant HumanEGF(批号：C029)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；FBS(批号：13011)购自四季青；Recombinant Murine EGF(批号：AF-315-09)购自PeproTech。

酶标仪(VARIOSKAN FLASH，美国Thermo公司)，高速离心机(5415R，德国Eppendorf公司)，倒置显微镜(CKX41，日本Olympus公司)。

2方法

2.1人卵巢癌顺铂(DDP)耐药细胞培养

细胞培养：人卵巢癌SKOV3细胞(DDP耐药浓度：0.1μg/mL)、A2780细胞(DDP耐药浓度：0.1μg/mL)在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，并置于37℃，5％CO₂的培养箱中，细胞融合度达到90％以上时进行传代，从T25培养瓶中吸出旧的培养基并丢弃，从与细胞相对的T25培养瓶一侧加入1mLPBS，轻轻晃动容器数次冲洗细胞，从培养瓶中吸出冲洗液并丢弃，向培养瓶中加入1mL预热的含0.25％EDTA的胰酶后将培养瓶放入培养箱消化3min左右可使细胞解离程度达90％以上，倾斜培养瓶并加入1mL预热的DMEM完全生长培养基，轻柔吹打细胞层表面数次后将细胞转移到15mL离心管，1000rpm，离心3min，用1mL完全培养基重悬细胞并分别吸取1/2体积的SKOV3/A2780细胞悬液于装有4mLDMEM完全培养基的T25培养瓶中进行细胞传代，在该比例下细胞均隔天传代。当细胞融合度达到70％时，将T25培养瓶中的含DDP浓度为0.1μg/mL的完全培养基吸出，加入1mL PBS，轻轻晃动容器数次冲洗细胞，从培养瓶中吸出冲洗液并丢弃，再加入含DDP浓度为0.25μg/mL的完全培养基，放入培养箱培养，第二天换液，当细胞融合度达到90％以上时进行传代，培养时的DDP浓度都为0.25μg/mL，当细胞生长状况稳定，即细胞形态良好，无漂浮细胞时，依次将培养基中DDP的浓度升为0.5μg/mL，1μg/mL，1.5μg/mL，2μg/mL。

2.2细胞活力检测

将SKOV3/A2780细胞(DDP耐药浓度：0.1或2μg/mL)按8×10⁴个/mL的密度接种于96孔板内(100μL/孔)，放置于细胞培养箱使其贴壁过夜，次日观察板内细胞密度达60-70％时弃旧培养基，加入配制的含EGF的培养基(1、5、15、45、50、100、200、400、800ng/mL)分别干预24h、48h或72h，每组设置6个复孔，先稀释CCK-8试剂(CCK-8试剂：DMEM完全培养基＝1：10)，然后将吸液泵压力调至最小轻轻吸去96孔板里含药旧培养基，每孔加入100μL稀释的CCK-8工作液，将96孔板放至培养箱孵育45min后使用酶标仪在450nm波长条件下检测每组的吸光度A，计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(OD给药组-OD完全空白孔)/(OD空白组-OD完全空白孔)×100％。

2.3人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤实验

实验一：待人卵巢癌细胞SKOV3细胞(DDP耐药浓度：0.1μg/mL)生长至80％～90％融合度时，用PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化为单细胞悬液，调整细胞浓度为4×10⁷个/mL。每只裸鼠接种4×10⁶个(0.1mL)，接种前轻轻充分混匀，将单细胞悬液注射于裸鼠腋下偏背部表皮下，正常饲养并每天观察接种处变化。当肿瘤体积约达到50mm³时，随机分组开始给药，EGF组裸鼠每日灌胃EGF(14ng/kg)，Model组裸鼠每天注射生理盐水。同时，每日察看裸鼠的生长状态，每3d相同时间测量一次肿瘤大小及裸鼠体重，给药37d后处理动物，收集肿瘤并称重。

实验二：待人卵巢癌细胞SKOV3细胞(DDP耐药浓度：2μg/mL)生长至80％～90％融合度时，用PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化为单细胞悬液，调整细胞浓度为4×10⁷个/mL。每只裸鼠接种4×10⁶个(0.1mL)，接种前轻轻充分混匀，将单细胞悬液注射于裸鼠腋下偏背部表皮下，正常饲养并每天观察接种处变化。当肿瘤体积约达到50mm³时，随机分组开始给药，EGF组和EGF+DDP组裸鼠每日灌胃EGF(28ng/kg)，Model组和DDP组裸鼠每日灌胃ddH₂O。一周后，DDP组和EGF+DDP组裸鼠腹腔注射DDP(2mg·kg^-1，1周2次)，Model组和EGF组小鼠每天注射生理盐水。同时，每日察看裸鼠的生长状态，每3d相同时间测量一次肿瘤大小及裸鼠体重，给药37d后处理动物，收集肿瘤并称重。

2.4统计学处理

用GraphPad Prism 7.0统计软件，两组比较采用Student's t test分析数据，三组及三组以上比较采用One-wayANOVADunnett分析方法分析数据，数据均表示为P<0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1EGF能够显著降低SKOV3-DDP耐药细胞的细胞活力，但是促进A2780-DDP耐药细胞的细胞活力

本研究中，首先考察了EGF对A2780和SKOV3低浓度(0.1μg/mL)DDP耐药细胞活力的影响。A2780-DDP(0.1μg/mL)细胞在DMEM含2.5％FBS培养时，如图1中B-C所示，EGF干预48和72h后均能显著促进A2780-DDP耐药细胞的细胞活力；当A2780-DDP(0.1μg/mL)细胞在DMEM含10％FBS培养时，如图2中B-C所示，EGF干预48和72h后均能显著促进A2780-DDP耐药细胞的细胞活力。SKOV3-DDP(0.1μg/mL)细胞在DMEM含2.5％FBS培养时，细胞生长不好，无法完成后续实验，因此本研究中，仅考察了SKOV3-DDP(0.1μg/mL)细胞在DMEM含10％FBS培养时，EGF对其细胞活力的影响。如图3中A-C所示，SKOV3-DDP(0.1μg/mL)细胞在DMEM含10％FBS培养时，EGF干预24、48和72h后均能显著降低SKOV3-DDP耐药细胞的细胞活力。

接着考察EGF对SKOV3-DDP高剂量耐药细胞的细胞活力的影响。如图4中A-B所示，SKOV3-DDP(2μg/mL)细胞在DMEM含10％FBS培养时，EGF干预24和48h后依然能显著降低SKOV3-DDP耐药细胞的细胞活力。

3.2EGF能够显著抑制高剂量SKOV3-DDP耐药细胞移植瘤的生长

如图5所示，EGF(14ng/mL)有抑制低剂量(0.1μg/mL)SKOV3-DDP耐药细胞移植瘤的生长的趋势。如图6所示，EGF(28ng/mL)能够显著抑制高剂量(2μg/mL)SKOV3-DDP耐药细胞移植瘤的生长，且肿瘤体积与瘤重均与模型组裸鼠有显著学差异，在实验过程中，DDP组裸鼠有体重减轻的不良反应，但EGF组裸鼠状态良好，无体重减轻症状。EGF和DDP联用对卵巢癌SKOV3顺铂耐药细胞移植瘤的抑制作用优于EGF或DDP单用。

4结果分析

一、临床实践的提示：

卵巢上皮性癌耐药复发是临床医生面对卵巢癌治疗的严峻难题，目前尚无很好的解决方案。临床最新卵巢癌诊疗指南(2022年版)中铂耐药复发定义：肿瘤在铂类为基础的一线治疗中无效(铂类难治型)，或化疗有效但无化疗间隔＜6个月复发者(铂耐药型)。本发明前期在治疗复发耐药的卵巢上皮性的过程中，经常应用中西医结合治疗。这几年在治疗中发现应用泰国产葛根的病人中，大部分耐药病人重新恢复对铂类药物的敏感性，临床症状均有不同程度的改善，如腹水、肠梗阻等，肿瘤指标均有不同程度下降。临床提示泰国产葛根能够重新恢复患者对化疗药物的敏感性。临床有良好的治疗效果，具体资料如下表。

表1

同时我们检测到泰国产葛根中含有一定量的EGF，但是根据以往的研究，EGF在卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移过程中发挥促进作用。在大鼠卵巢癌细胞NuTu-19及大鼠顺铂耐药卵巢癌细胞中研究发现，EGFR的酪氨酸激酶结构域是其介导卵巢癌增殖、顺铂耐药的重要活性区，该活性区被敲除后，能够部分逆转大鼠卵巢癌耐药细胞(NuTu-19)对顺铂的耐药性。因此，EGFR阻断剂可能是治疗顺铂敏感和顺铂耐药的卵巢癌的有用的治疗工具。而在人卵巢癌细胞A2780细胞中，EGFR也异常活跃，并与Jaks和Stat3信号一起促进顺铂耐药卵巢癌细胞的集落形成能力、运动和迁移。然而有意思的是，本发明在临床上偶然发现，含有表皮生长因子(EGF)的草药能够逆转多例患者的卵巢癌顺铂耐药，为进一步确认这一令人惊喜的结果，本研究中采用EGF对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3-DDP和A2780-DDP细胞株的作用进行实验验证。

二、实验结果的提示：

本发明的体外研究结果显示，与对照组相比，EGF确实能够促进A2780-DDP耐药细胞的细胞活力，这一结果与以往研究者的研究报道一致。但是EGF能够显著抑制SKOV3-DDP耐药细胞的细胞活力。体内研究结果表明，EGF(14ng/kg)有抑制SKOV3-DDP低剂量(0.1μg/mL)耐药细胞移植瘤生长的趋势。EGF(28ng/kg)能够显著抑制SKOV3-DDP高剂量(2μg/mL)耐药细胞移植瘤的生长，EGF和DDP联用对人卵巢癌SKOV3-DDP移植瘤生长的抑制作用优于EGF、DDP单用，这一结果与在临床上观察到的结果一致。本研究结果提示EGF在临床治疗顺铂耐药卵巢癌中的重大价值。

综上所述，表皮生长因子(EGF)能够逆转SKOV3型卵巢癌顺铂耐药性，且EGF和顺铂联用逆转效果更为显著，本发明为治疗顺铂耐药SKOV3型卵巢癌提供新思路。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.表皮生长因子在制备治疗顺铂耐药卵巢癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述顺铂耐药卵巢癌为顺铂耐药SKOV3细胞型卵巢癌。

3.表皮生长因子联合顺铂在制备治疗顺铂耐药卵巢癌的药物中的应用，其特征在于，所述顺铂耐药卵巢癌为顺铂耐药SKOV3细胞型卵巢癌。

4.一种逆转卵巢癌顺铂耐药性的药物，其特征在于，包含有效剂量的表皮生长因子。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，还包含有效剂量的顺铂。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述卵巢癌为SKOV3细胞型卵巢癌。

7.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂和矫味剂中任一种或几种。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物包括注射制剂。