CN112587518B - 鸦胆子苦醇药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鸦胆子提取物鸦胆子苦醇或其类似物联合卡麦角林在治疗垂体腺瘤中的新应用。鸦胆子苦醇或其类似物主要通过抑制4E‑BP1和S6K1的磷酸化来引起细胞死亡，同时鸦胆子苦醇与卡麦角林协同用药能够更显著的抑制4E‑BP1和S6K1的磷酸化，联合给药后显示更好的肿瘤抑制效应，其中所述的垂体腺瘤为泌乳素腺瘤，临床无功能垂体腺瘤，生长激素腺瘤等。

Description

鸦胆子苦醇药物组合物及其用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及鸦胆子提取物鸦胆子苦醇或其类似物联合卡麦角林在治疗垂体腺瘤中的新应用。
背景技术
垂体腺瘤(主要包括泌乳素瘤、无功能腺瘤、生长激素腺瘤、ACTH腺瘤等)是常见的颅内肿瘤，其人群发病率为7.5-15/10万，近年来垂体腺瘤的发病率在增高，最近比利时流行病学调查发现垂体腺瘤人群发病率高达75-113/10万，而尸体解剖的发现率甚至高达20％-30％。泌乳素腺瘤是最常见的垂体腺瘤，占所有垂体腺瘤的40％～45％。泌乳素腺瘤患者的临床表现主要是由高泌乳素血症引起的闭经溢乳、性功能减退、体重增加、不孕不育等；同时由于肿瘤体积增加产生的压迫效应，导致如颅内压升高如头痛、视力下降、视野改变甚至引起失明等严重并发症，因此严重影响患者的生活质量和健康安全。
目前临床上针对泌乳素腺瘤患者首选药物治疗，其一线药物主要为多巴胺2型受体激动剂(Dopamine agonists，DAs)，常用的有溴隐亭(Bromocriptine,BRC)和卡麦角林(Cabergoline,CAB)，其中CAB效果优于BRC，且已在欧美国家广泛使用。DAs能够使大多数的泌乳素瘤患者获益，包括恢复正常的泌乳素水平、改善内分泌症状；减小肿瘤体积而缓解肿瘤压迫产生的症状，如视力改善、缓解头痛等。但是，仍有10％～20％的患者对该类药物治疗不敏感甚至无效，临床上将此类患者归入耐药泌乳素腺瘤患者，该类患者往往临床预后不佳，严重影响生存质量。因此，试图解决泌乳素瘤耐药问题是目前泌乳素瘤临床治疗难点，其中涉及传统中药提取物的研究，仍然较少。
天然产物如中药提取物对肿瘤的治疗作用具有重要的临床和社会意义，比如传统的紫杉醇(Taxol)、青蒿素(Artemisinin)等都是天然产物的衍生物或其类似物。鸦胆子来源于苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，主要分布于我国广东、广西等岭南地区。根据《本草纲目拾遗》和《岭南采药录》的记载，其具有清热解毒、截疟、止痢等作用，并且我国于早年开始研究鸦胆子的抗肿瘤作用并生产鸦胆子乳油注射液和软胶囊。
鸦胆子的主要成分是鸦胆子苦素A、B、C、D、E、F、G、H、I、鸦胆子苦内酯(Bruceolide)、鸦胆子苦醇(Brusatol)；亦含生物碱，如鸦胆子碱(Brucamarine)、鸦胆宁(Yatanine)；糖甙，如鸦胆灵(Brucealin)、鸦胆子甙(Yatanoside)以及鸦胆子酚(Brucenol)、鸦胆子酸(Bruceolic acid)和香草酸(Vanillic acid)等。
鸦胆子苦醇英文名为brusatol，CAS号：14907-98-3，分子式：C26H32O11，分子量520.54，其化学结构如式(I)所示，相关的制备工艺可中国专利申请CN201310384744.3。
Figure GDA0003237742200000031
近年来，国内和国际上对鸦胆子苦醇的抗肿瘤效应越来越关注。鸦胆子苦醇作为一种新型的核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)抑制剂，在以往的研究主要集中在鸦胆子苦醇能够通过抑制Nrf2下游把基因，如血红素氧化酶1(Heme Oxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidases)等的表达，从而诱导细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生并抑制肿瘤细胞生长，如肝癌、肺癌、胰腺癌和脑胶质瘤等。
CN201911337381.1报道了曲妥珠单抗联合鸦胆子苦醇给药相比鸦胆子苦醇或曲妥珠单抗单独给药，在HER2高表达的乳腺癌BT-474荷瘤小鼠模型上显示了更显著的抑制肿瘤进展的效果。
CN202010096435.6报道了鸦胆子苦醇在制备预防或治疗炎症性疾病药物中的应用，尤其是在制备银屑病药物中的应用。
US20020193425A1报道了鸦胆子苦醇及其类似物在预防和/或治疗癌症如白血病或淋巴瘤的方法，所述的在白血病或淋巴瘤选自急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性期慢性粒细胞白血病，伯基特氏白血病，伯基特样白血病和高风险骨髓增生异常综合征。
但是，目前国内外对于应用鸦胆子苦醇治疗垂体腺瘤的项目还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸦胆子提取物鸦胆子苦醇或其类似物联合卡麦角林在治疗垂体腺瘤中的新应用。
发明人意外发现，不同于多巴胺受体激动剂的DRD2依赖性促使肿瘤细胞凋亡这一经典途径，鸦胆子苦醇或其类似物主要通过抑制4E-BP1和S6K1的磷酸化来引起细胞死亡，同时鸦胆子苦醇与卡麦角林协同用药能够更显著的抑制4E-BP1和S6K1的磷酸化，联合给药后显示更好的肿瘤抑制效应。
因此，一方面，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中鸦胆子苦醇或其类似物选自如下的化合物：
Figure GDA0003237742200000041
Figure GDA0003237742200000051
Figure GDA0003237742200000061
本发明中，式(I)所示的鸦胆子苦醇可商购或自行制备，制备工艺可参考CN201310384744.3公开的方法。式(II)-式(X)所示的鸦胆子苦醇类似物可参考US20020193425A1，该类化合物在预防和/或治疗癌症如白血病或淋巴瘤时表现出接近的药理药效，显示该类与鸦胆子苦醇具有相同母核的化合物由于具有近似的化学结构，因而具有相似的化学性质，进而具有与鸦胆子苦醇相近似的药理药效活性。
在本发明的另一实施方案中，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中所述的鸦胆子苦醇或其类似物为其药学上可接受的盐，优选为盐酸盐、硫酸盐、溴酸盐、富马酸盐、醋酸盐或柠檬酸盐等。
在本发明的另一实施方案中，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中所述的垂体腺瘤为泌乳素腺瘤，临床无功能垂体腺瘤，生长激素腺瘤，ACTH腺瘤，混合型腺瘤等。
为了实现本发明的目的，发明人根据既往垂体泌乳素细胞腺瘤耐药研究数据，选择认可度较高的MMQ细胞(高表达DRD2，对DA治疗敏感)和GH3细胞(低/无表达DRD2，对DA治疗不敏感)进行卡麦角林和鸦胆子苦醇单独给药或同时给药。
体外实验结果显示，鸦胆子苦醇单独给药对GH3细胞、MMQ和人垂体瘤原代细胞均具有较强的抑制肿瘤生长的作用。同时，裸鼠移植瘤体内结果显示，卡麦角林联合鸦胆子苦醇给药能够有效抑制GH3细胞移植瘤生长，但单独卡麦角林给药却对肿瘤无明显的抑制作用。
在对鸦胆子苦醇药物作用机制进行相应研究后发现，不同于多巴胺受体激动剂的DRD2依赖性促使肿瘤细胞凋亡这一经典途径，鸦胆子苦醇则主要通过抑制4E-BP1和S6K1的磷酸化来引起细胞死亡，同时鸦胆子苦醇与卡麦角林协同用药能够更显著的抑制4E-BP1和S6K1的磷酸化。
在本发明的另一实施方案中，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中所述的卡麦角林治疗剂量为0.25mg-2mg/每周；其中所述的鸦胆子苦醇或其类似物治疗剂量为50-500mg/天。
在本发明的另一实施方案中，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中所述的卡麦角林治疗剂量为0.25mg-2mg/每周；其中所述的鸦胆子苦醇或其类似物治疗剂量为50mg-500mg/天。
在本发明的另一实施方案中，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中所述的卡麦角林以初始剂量每次0.25mg口服，每周口服2次方式给药，如有必要可每4周增加0.5mg，治疗剂量一般为每周0.25mg-2mg；其中所述的鸦胆子苦醇或其类似物治疗剂量为50mg-500mg/天，以每天1-3次口服或静脉注射的方式给药。
在本发明的另一实施方案中，本发明公开了治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，所述的药物包括治疗有效量的卡麦角林、治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
虽然剂量随症状和病人的年龄，疾病或失调的性质及严重性和给药的途径和方式而变，但对成年病人口服给药的情况来说，本发明特别优选的药物组合物包含0.5mg剂量的卡麦角林和50mg剂量的鸦胆子苦醇或其类似物。儿童患者的给药剂量可根据成年患者方案酌减。
在本发明的另一实施方案中，所述的药物组合物可以制备成胶囊剂，片剂，粉剂，粒剂，糖浆或类似剂型形式口服给药，或通过注射，软膏，栓剂或类似剂型非肠胃给药。这些药物制剂可通过使用本领域熟知的辅助剂，如粘合剂，赋形剂，稳定剂，崩解剂，矫味剂，润滑剂等等以普通方法生成，也可以制备为控释给药剂型、缓释给药剂型、各种微粒给药系统。
本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其类似物给予需要治疗的受试者。术语“受试者”包括人类和非人哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马等，优选的受试者为人类患者。
附图说明
附图1：鸦胆子苦醇(Brusatol)抑制垂体瘤细胞生长。其中：A-B:利用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测不同浓度的鸦胆子苦醇分别处理GH3和MMQ细胞后，检测细胞活性，发现随着浓度的增加，Brusatol对MMQ和GH3细胞具有细胞活性抑制作用，且呈现出浓度依赖性，但48小时作用并未比24小时更强；C-D:将GH3细胞和MMQ细胞分别形成平板克隆群，在克隆群形成过程中培养基加入一定浓度的Brusatol，结果显示够抑制GH3和MMQ细胞的生长；E:利用原代细胞培养技术获取不同类型的人垂体瘤原代细胞包括无功能腺瘤，生长激素腺瘤，泌乳素腺瘤)，利用CCK-8实验验证鸦胆子苦醇处理后，能够抑制各类垂体瘤细胞的活性。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。
附图2：体外实验证明鸦胆子苦醇和卡麦角林联用具有协同抑制肿瘤作用。其中：A-B：利用细胞活性实验和平板克隆实验证明，由于GH3细胞缺乏多巴胺2型受体，利用低浓度CAB作用于GH3细胞可见CAB对GH3细胞无有效杀伤作用，但同时增加鸦胆子苦醇与之合用，可见具有协同抑制肿瘤的作用，另虽然CAB对MMQ细胞具有杀伤作用，但鸦胆子苦醇合用后显示更好的肿瘤抑制效应。C：利用Image J软件分析克隆形成数量，提示CAB和鸦胆子苦醇联用对克隆形成具有显著抑制作用。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。
附图3：机制研究证明鸦胆子苦醇联合卡麦角林能够更有效抑制：4E-BP1和S6K1的磷酸化。其中：A：提取鸦胆子苦醇处理0h,6h,12h,24h后GH3及MMQ细胞蛋白进行Westernblot检测，其结果如图3A所示，随着时间的增加，mTORC1下游底物S6K1和4E-BP1的蛋白磷酸化水平降低。B：将无功能腺瘤和GH腺瘤的原代细胞用鸦胆子苦醇处理后，收取细胞蛋白进行Western blot检测，其结果如图3B所示，随着时间的增加，mTORC1下游底物S6K1和4E-BP1的蛋白磷酸化水平降低。C：收集如图2A处理后的GH3和MMQ细胞蛋白，Western blot实验结果显示鸦胆子苦醇处理后能够增加CAB对S6k1和4EBP的磷酸化抑制作用。
附图4：裸鼠移植瘤体内实验证明，鸦胆子苦醇能够增强CAB的药物敏感性。其中：(A)在30天的喂养后，麻醉处死裸鼠，解剖获得皮下GH3细胞移植瘤标本；(B)通过每3天一次绘制生长曲线提示，低浓度CAB处理组肿瘤抑制作用不明显，但合用鸦胆子苦醇后肿瘤生长抑制作用明显；(C)将获取的肿瘤标本称重发现，协同用药组的肿瘤重量更轻，进一步提示CAB联合鸦胆子苦醇的协同作用。***P<0.001；**P<0.01。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中所用术语简称：
CCK-8：Cell Counting Kit-8细胞计数试剂。
Brusatol：鸦胆子苦醇。
CAB：cabergoline，卡麦角林。
BRC：bromocriptine，溴隐亭。
DRD2：dopamine receptor 2，多巴胺2型受体。
实施例中所用CAB购买于Tocris Bioscience公司；CCK-8试剂盒购买于北京碧云天公司；Brusatol购买于美国MCE公司；细胞培养基及所需血清购买于美国Gibco公司，其余实验耗材为本实验室常用常规耗材。
实施例1验证鸦胆子苦醇对垂体腺瘤的细胞活性抑制试验
1)取状态良好的处于对数生长期的GH3细胞和MMQ细胞，用PBS洗涤2-3次，用F12培养基在37℃、5％CO2的条件下培养，培养基添加2.5％胎牛血清，15％马血清和100U/ml青霉素/链霉素；取新鲜的温州医科大学附属第一医院神经外科垂体腺瘤术手术切除肿瘤标本，在无菌条件下用眼科剪剪碎肿瘤组织后以IV型胶原酶配合胰酶机械消化肿瘤组织获取原代垂体瘤细胞，培养方式同GH3和MMQ细胞培养条件。
2)以10～20万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用96孔板培养，每孔内培养基为100μl，用于检测细胞活性实验；使用多聚赖氨酸处理后的6孔板按照500个细胞/ml的浓度接种细胞于6孔培养板，加入2ml培养基，用于平板克隆实验。
3)细胞过夜培养后，将鸦胆子苦醇原液从-80℃冰箱中取出，自然条件下溶解至液体状，确认无沉淀及悬浊物后，根据工作浓度0-1μM的浓度加入预先铺设好GH3细胞和MMQ细胞的96孔板中和6孔板中，经过24小时和48小时的培养后，用CCK-8实验检测细胞活性；同时，在3-4周后用亚甲蓝染色检测6孔板中细胞克隆形成数量，根据图1A-图1D结果显示，鸦胆子苦醇对GH3细胞和MMQ细胞具有显著的生长抑制作用。
4)另外将获取的不同亚型的垂体腺瘤原代细胞按照上述细胞密度铺设于96孔细胞培养板中，按照0.5μM的工作浓度加入鸦胆子苦醇，培养24小时后，用CCK-8实验检测原代细胞活性，根据图1E显示，鸦胆子苦醇对不同的垂体腺瘤原代细胞具有抑制细胞活性的作用。
实施例2对Brusatol对CAB治疗中的增敏作用探索。
1)取状态良好的处于对数生长期的GH3细胞和MMQ细胞，用PBS洗涤2-3次，用F12培养基在37℃、5％CO2的条件下培养，培养基添加2.5％胎牛血清，15％马血清和100U/ml青霉素/链霉素。
2)以10～20万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用96孔板培养，每孔内培养基为100μl，用于检测细胞活性实验。将铺好的96孔培养板培养过夜后，所有测试孔分为4组，分别为：空白对照组，单用CAB(50μM)处理组，Brusatol(250nM)处理组，CAB与Brusatol合用组。
3)加药培养24小时后用CCK-8实验检测原代细胞活性，所得结果如图2所示。
4)再次取状态良好的处于对数生长期的GH3细胞和MMQ细胞，用PBS洗涤2-3次，用F12培养基在37℃、5％CO2的条件下培养，培养基添加2.5％胎牛血清，15％马血清和100U/ml青霉素/链霉素。
5)使用6孔板培养，每孔内培养基为2ml，每孔设置1000个细胞单体；然后按照如上述分组加药，培养24小时后更换细胞培养基，放回培养箱继续培养14天后取出染色，计数。
实施例3对Brusatol抑制垂体瘤生长的分子机制探索及验证。
1)取状态良好的处于对数生长期的GH3细胞和MMQ细胞，用PBS洗涤2-3次，用F12培养基在37℃、5％CO2的条件下培养，培养基添加2.5％胎牛血清，15％马血清和100U/ml青霉素/链霉素。
2)以30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用6孔板培养，每孔内培养基为2ml；然后按照如上述0.5μM的工作浓度在6孔板中加入鸦胆子苦醇，培养0-24小时，然后收集细胞于1.5mL的EP管中，置于冰上。加入适量的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解30分钟，然后使用12000rpm/min离心，获取上清细胞蛋白。
3)结合我们以往的研究成果，我们使用Western blot实验检测鸦胆子苦醇处理后细胞内mTORC1下游底物磷酸化水平的改变，结果提示，鸦胆子苦醇处理后的GH3和MMQ细胞以及垂体瘤原代细胞mTORC1下游底物4E-BP1和S6K1磷酸化降低，提示鸦胆子苦醇具有抑制mTORC1信号通路的作用。
4)选择实施例-1中获取的原代垂体瘤细胞，以类似于上述方法，在鸦胆子苦醇处理后，收集细胞于1.5mL的EP管中，置于冰上。加入适量的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解30分钟，然后使用12000rpm/min离心，获取上清细胞蛋白。利用Western blot实验验证鸦胆子苦醇对垂体瘤原代细胞中4E-BP1合S6K1蛋白磷酸化的影响。
实施例4 Brusatol在裸鼠体内对CAB的增敏效果探究。
1)从上海实验动物中心购买5周龄雌性BALB/c(nu/nu)裸鼠20只，SPF级动物房适应性饲养一周，裸鼠未见明显异常及不适状态下，则可进行GH3细胞皮下种植成瘤实验。
2)接种部位选择腰背部皮下，避开前肢，不触碰肌肉，一侧接种200万GH3细胞，一只裸鼠接种一侧。用F12培养基，添加2.5％胎牛血清，15％马血清和100U/ml青霉素/链霉素重悬细胞，接种前用75％的酒精对进针部位擦拭消毒。
3)一次性针头抽取细胞悬液，排去空气，从进针部位向前穿刺大约1cm，进行皮下注射。注射时，每次注射量大约为0.1～0.2ml，注射完毕后，缓慢退出针头，尽量避免漏液。注射过程中，细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，并尽量在半小时内完成。
4)接种7-10天后便可看到肿块长起，进行游标卡尺检测，当肿瘤体积大部分接近50mm3时，将裸鼠随机均分为空白对照组，CAB饲养组(0.5mg/kg，每2日一次)，Brusatol饲养组(2mg/kg，2日一次)，CAB和Brusatol共同饲养组。每3日测量肿瘤体积，绘制皮下肿瘤体积曲线，当对照组肿瘤组织生长至约1500mm3则停止整个动物实验。麻醉处死小鼠后，取出皮下肿瘤，测量肿瘤重量。
表1：6例人垂体腺瘤患者临床基本信息情况
Figure GDA0003237742200000161
a:正常值，男性：2.63-13.08ng/ml，女性:3.33-26.62ng/ml.
b:正常值，男性：0.003-0.971ng/ml，女性：0.01-3.607ng/ml.
c:IGF-1：术前，688μg/L；术后三天，159μg/L；正常值：109-284μg/L。
d:此患者耐受溴隐亭药物治疗。15mg/d溴隐亭治疗超过6个月，肿瘤体积减少小于20％并且血泌乳素水平维持于457.23ng/ml。

Claims (13)

1.治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其药学上可接受的盐在制备用于治疗垂体腺瘤的药物中的用途，其中鸦胆子苦醇结构式如下所示：
Figure FDA0003225946790000011
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的盐为盐酸盐、硫酸盐、溴酸盐、富马酸盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的垂体腺瘤为泌乳素腺瘤、临床无功能垂体腺瘤、生长激素腺瘤、ACTH腺瘤或混合型腺瘤。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的卡麦角林治疗剂量为0.25mg-2mg/每周；所述的鸦胆子苦醇治疗剂量为1-1000mg/天。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的卡麦角林治疗剂量为0.25mg-2mg/每周；所述的鸦胆子苦醇治疗剂量为50mg-500mg/天。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：其中所述的卡麦角林以初始剂量每次0.25mg口服、每周口服2次方式给药，治疗剂量为每周0.25mg-2mg；其中所述的鸦胆子苦醇治疗剂量为50mg-500mg/天，以每天1-3次口服或静脉注射的方式给药。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物包括治疗有效量的卡麦角林、治疗有效量的鸦胆子苦醇或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物包含0.5mg剂量的卡麦角林和50mg剂量的鸦胆子苦醇。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物制备成胶囊剂、片剂、粉剂、粒剂、糖浆形式口服给药，或通过注射、软膏、栓剂非肠胃给药。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：儿童患者的给药剂量根据成年患者酌减。
11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途包括将治疗有效量的卡麦角林和治疗有效量的鸦胆子苦醇或其药学上可接受的盐给予需要治疗的受试者，所述的受试者包括人类和非人哺乳动物。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述的受试者为非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛或马。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述的受试者为人类患者。
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