CN116640196A - 囊泡相关膜蛋白的相关蛋白vap1在抗马铃薯y病毒中的应用 - Google Patents
囊泡相关膜蛋白的相关蛋白vap1在抗马铃薯y病毒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1在抗马铃薯Y病毒中的应用，属于生物技术领域。本发明首次研究发现VAP1蛋白与6K2蛋白在体内互作，沉默VAP1基因能够促进PVY侵染，过表达VAP1基因负调控PVY侵染，并确定了VAP1中决定6K2蛋白和VAP1之间互作以及调控PVY侵染的关键氨基酸位点。由此证明：囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1可以作为植物抗马铃薯Y病毒的新靶标，并可应用于马铃薯Y病毒病的防治中，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1在抗马铃薯Y病毒中的应用。
背景技术
囊泡相关膜蛋白的相关蛋白(vesicle-associated membrane protein(VAMP)-associated protein，简称VAP)，因其与SNARE蛋白家族结合发挥囊泡运输作用而被命名。VAP蛋白在结构上属于II型膜整合蛋白(赵文晶等，2012)。在不同的物种中鉴定到的VAP蛋白结构相似，由三个结构域组成，具有高度保守的精子主蛋白(MSP)结构域的N端区域和包含卷曲螺旋域和疏水跨膜结构域的不太保守的C端区域(Murphy等，2016)。
VAP蛋白具有多种生理活性，且不同来源、不同类型的VAP蛋白的活性会存在差异。研究证明VAP能够参与神经细胞中的囊泡对接和神经递质胞吐作用(Skehel等，1996)。而且VAP已经被证明在植物生长发育中起关键作用，是提高作物非生物抗逆性的潜在候选基因。研究表明，在拟南芥植株中瞬时过表达TaVAP可以增强拟南芥对干旱胁迫的耐受性，从而调控拟南芥的生长发育(Singh等，2018)。研究证明，人的VAPB在双杂交筛选中显示与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)非结构蛋白NS5A和病毒聚合酶相互作用从而促进HCV的复制(Hamamoto等，2005)。有研究发现，传毒介体的VAP调控植物病毒的传播，烟粉虱体内存在一个名为囊泡膜相关蛋白的相关蛋白B(vesicle associated membrane protein-associated protein B，VAPB)的蛋白。沉默VAPB会导致烟粉虱血淋巴和唾液腺中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)积累量显著增加，TYLCV的传播效率也会显著提高，结果表明VAPB在烟粉虱传播TYLCV中发挥重要作用(Zhao等，2019)。
马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)可侵染多种植物，其中茄科、藜科和豆科植物受害最为严重。自然条件下，PVY可以通过蚜虫以非持久性方式传播，也可通过摩擦或伤口经汁液传播，或通过带毒马铃薯种薯的调运进行远距离传播。与细菌或真菌引起的病害不同，病毒的复制与传播需要依赖宿主和传播介体，一般的化学药剂不能直接阻断病毒的增殖，甚至会干扰宿主的正常生长。因此，对于马铃薯Y病毒引起的病毒病的防治难度较大。
VAP1蛋白是VAP蛋白家族成员之一，目前对于VAP1蛋白功能的研究比较少，其与马铃薯Y病毒的作用关系更是未见报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1在抗马铃薯Y病毒中的应用。本发明首次研究发现VAP1蛋白可以作为植物抗病毒靶标而应用于马铃薯Y病毒的防治中，由此提出了本发明。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控马铃薯Y病毒的侵染；
(2)调控植物对马铃薯Y病毒的抗性；
所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述应用中，所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1通过与马铃薯Y病毒中的6K2蛋白互作来调控马铃薯Y病毒的侵染。
上述应用中，所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1调控马铃薯Y病毒侵染的关键氨基酸位点为第15位氨基酸苯丙氨酸(从起始密码子编码的后一个氨基酸开始计数)。
本发明的第二方面，提供囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对马铃薯Y病毒的抗性；
(2)培育抗马铃薯Y病毒的植物品种。
上述应用中，所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因为如下(i)或(ii)所示的核酸分子：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
(ii)除(i)以外的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸分子。
本发明的第三方面，提供含有上述编码基因的重组表达载体或工程菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对马铃薯Y病毒的抗性；
(2)培育抗马铃薯Y病毒的植物品种。
本发明的第四方面，提供一种提高植物对马铃薯Y病毒抗性的方法，包括以下步骤：
使植物中囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因过表达。
上述方法中，囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因过表达可以通过外源转入囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因的方法；或者上调植物基因组中囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因的表达。
本发明的第五方面，提供一种培育抗马铃薯Y病毒的转基因植物的方法，包括以下步骤：
将VAP1基因导入野生型植物中，获得VAP1基因过表达植物；所获得的VAP1基因过表达植物对马铃薯Y病毒的抗性高于野生型植物。
上述方法中，所述VAP1基因为如下(i)或(ii)所示的核酸分子：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
(ii)除(i)以外的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸分子。
本发明的有益效果：
(1)为考察囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1与马铃薯Y病毒6K2蛋白是否存在互作关系，本发明通过核酵母双杂交试验和免疫共沉淀试验进行了验证，结果发现VAP1蛋白与6K2蛋白在体内互作。
(2)为进一步研究囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1对马铃薯Y病毒侵染的影响，本发明分别构建了VAP1基因沉默载体和VAP1基因过表达载体，发现沉默VAP1基因能够促进PVY侵染；过表达VAP1基因负调控PVY侵染。
(3)本发明还对决定6K2蛋白和VAP1之间互作以及调控PVY侵染的关键氨基酸位点进行了确定，发现囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的第15位氨基酸残基是决定6K2蛋白和VAP1之间互作以及调控PVY侵染的关键氨基酸位点。
综上，囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1可以作为植物抗马铃薯Y病毒的新靶标，并可应用于马铃薯Y病毒病的防治中，具有重要的应用价值。
附图说明
图1：实施例1中核酵母双杂交试验结果。
图2：实施例1中免疫共沉淀试验分析结果。
图3：实施例1中萤火素酶互补试验分析结果。
图4：实施例1中双分子荧光互补试验分析结果。
图5：实施例2中qPCR检测NbVAP1沉默效率。
图6：实施例2中NbVAP1沉默和未沉默的本氏烟接种PVY-GFP 5天后的症状和荧光。
图7：实施例2中Western blot分析NbVAP1沉默和未沉默的本氏烟接种PVY-GFP 5天的系统叶片中GFP蛋白的积累量。
图8：实施例2中NbVAP1过表达和对照本氏烟接种PVYPIPOSTOP 4天后荧光(n＝9)。
图9：实施例2中qPCR检测NbVAP1过表达和对照区域接种PVYPIPOSTOP 60h后PVYCP的mRNA积累量。
图10：实施例2中Western blot分析NbVAP1过表达和对照区域接种PVYPIPOSTOP 4天后GFP的蛋白积累量。
图11：实施例3中预测NbVAP1的结构域模式图。
图12：实施例3中NbVAP1关键区域的确定。
图13：实施例3中酵母双杂交试验分析NbVAP1决定VAP1与6K2互作的关键区域。
图14：实施例3中萤火素酶互补试验分析NbVAP1决定VAP1与6K2互作的关键区域。
图15：实施例3中NbVAP1F15A过表达和野生型对照本氏烟接种PVY-GFP 3天后荧光。
图16：实施例3中Western blot分析NbVAP1F15A过表达和野生型对照区域接种PVY-GFP 3天后GFP的蛋白积累量。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，VAP蛋白具有多种生理活性，且不同来源、不同类型的VAP蛋白的活性会存在差异。VAP1蛋白是VAP蛋白家族成员之一，本发明的NbVAP1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体如下：
MTSEELLIIDPLDLQFPFELKKSISSSFELINKTDNHVAFKVKTTNPRKYTVRPNSGIVLPQSRSNVTVTMQPQTELPPDMQCKDKFLVQSVITNPGSTPKDINPDMFNKSGGNHVEECKLKVVYVSPPRKPSPVPEDSEEGTSPGASETDLQEHGESQDNSTKARELILRLMQERDSIIQQNAKLNRELELLRHGRQEHRTGVPHWYILVVGLLGILLGYIVRNF。
NbVAP1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
ATGACAAGTGAAGAACTTCTAATTATCGATCCTTTAGACCTCCAATTTCCATTCGAGCTCAAGAAGTCAATTTCGAGCTCTTTTGAACTGATCAATAAGACTGATAATCACGTGGCTTTCAAGGTAAAGACAACCAATCCCAGGAAGTATACTGTCAGGCCGAACAGTGGAATTGTTCTCCCACAATCAAGATCCAACGTTACTGTTACGATGCAACCGCAAACAGAGTTGCCTCCGGATATGCAATGCAAAGACAAGTTTCTTGTACAGAGTGTGATTACGAACCCTGGGTCTACCCCGAAAGATATTAACCCAGATATGTTCAACAAGTCCGGAGGAAATCATGTTGAGGAATGCAAACTAAAAGTTGTTTATGTTTCACCACCAAGAAAACCATCACCAGTCCCTGAAGATTCTGAGGAAGGGACTTCACCAGGAGCTTCTGAAACTGATTTACAAGAACATGGTGAGTCTCAGGATAACTCCACTAAGGCCAGAGAACTAATTTTGAGGTTGATGCAAGAGAGAGATTCCATTATTCAACAAAATGCCAAGCTCAACCGAGAACTGGAGCTTCTGAGGCATGGACGTCAAGAACATCGTACTGGAGTTCCACATTGGTACATCTTGGTGGTTGGCTTGCTTGGTATCCTTTTGGGGTACATTGTCAGAAACTTT。
目前对于VAP1蛋白功能的研究比较少，有鉴于此，本发明对VAP1蛋白的功能进行了深入研究。
本发明首先通过核酵母双杂交试验和免疫共沉淀试验考察了VAP1蛋白与马铃薯Y病毒6K2蛋白的相互作用关系，发现VAP1蛋白与6K2蛋白在体内互作。
基于蛋白互作的考察结果，本发明进一步研究了VAP1蛋白对PVY侵染的影响，本发明分别构建了VAP1基因沉默载体和VAP1基因过表达载体，浸润接种本氏烟后再接种PVY病毒，结果表明：沉默VAP1基因能够促进PVY侵染；过表达VAP1基因负调控PVY侵染。
本发明还对决定6K2蛋白和VAP1之间互作以及调控PVY侵染的关键氨基酸位点进行了确定，发现囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的第15位氨基酸残基是决定6K2蛋白和VAP1之间互作以及调控PVY侵染的关键氨基酸位点。
由此证明：VAP1蛋白可以作为植物抗病毒的新靶标，能够应用于马铃薯Y病毒病的防治中，具有重要的应用价值。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：
核酸凝胶回收试剂盒购买自北京全式金公司；质粒小提试剂盒购买自美国OMEGA公司；构建载体所需要的同源重组酶购自济南安博特公司、苏州莫纳生物公司和镇江爱必梦(abm)公司；RNA提取试剂盒TransZol购买自北京全式金公司；常见的限制性内切酶购自美国赛默飞(Thermo)公司；扩增基因片段需要的phanta酶购买自南京诺唯赞(Vazyme)公司，phusion酶购买自北京宝日医(TaKaRa)公司；逆转录酶购自Vazyme公司；GFP抗体购自深圳康体生命公司；MYC抗体购买自北京安必维(Abway)公司；PVYCP抗体实验室自己制备；荧光定量PCR试剂购买自北京康润诚业(GenStar)公司；Western Blot实验中所使用的硝酸纤维素膜购买自德国Pall Corporation公司；蛋白酶抑制剂购买自MedChemExpress(MCE)公司。
本发明中所用的本氏烟(Nicotianan benthamiana)，除特殊说明外，在24/22℃(白天/夜晚)和16h光照/8小时避光循环的生长室中生长。
本发明中所使用的马铃薯Y病毒为PVY N605分离物(GenBank:X97895.1)。
实施例1：NbVAP1与马铃薯Y病毒6K2蛋白体内互作研究
1、试验方法：
(1)载体构建：
根据NbVAP1基因的编码区序列，设计特异性引物NbVAP1-Xba1-F和NbVAP1-BamH1-R，其序列如下：
NbVAP1-Xba1-F：GCTCTAGAATGACAAGTGAAGAACTTCTAATTATCGAT；(SEQ ID NO.3)
NbVAP1-BamH1-R：CGGGATCCAAAGTTTCTGACAATGTACCCCAAAA。(SEQ ID NO.4)
注：前两位碱基是酶切位点的保护碱基，斜体部分分别为XbaⅠ及BamHⅠ两个限制性内切酶位点。
利用上述特异性引物进行扩增，将扩增片段酶切后连接到瞬时表达载体p35SUTRMyc(该瞬时表达载体是基于农杆菌双元表达载体pCAMBIA0390构建，在MCS前插入35S启动子，TVBMV的5'-UTR，在MCS后插入3×MYC编码序列；该瞬时表达载体包含35S启动子，5'-UTR TVBMV和3×MYC编码序列)上，构建得到重组表达载体NbVAP1-3MYC。
将扩增片段酶切后连接到载体pYFPn(GenBank:EU796373.1)上，构建得到重组表达载体NbVAP1-YFPn。
根据NbVAP1基因的编码区序列，设计特异性引物AD-NbVAP1-F和AD-NbVAP1-R，其序列如下：
AD-NbVAP1-F：GATTACGCTCATATGACAAGTGAAGAACTTCTAATTATCGAT；(SEQ ID NO.5)
AD-NbVAP1-R：CATCTGCAGCTCGAGTCAAAAGTTTCTGACAATGTACCC。(SEQ ID NO.6)
注：斜体部分为载体与片段的同源臂。
扩增NbVAP1基因后同源重组到瞬时表达载体pGADT7上，构建得到重组表达载体AD-NbVAP1。
根据NbVAP1基因的编码区序列，设计特异性引物NbVAP1-cluc-F和NbVAP1-cluc-R，其序列如下：
NbVAP1-cluc-F：GGGGCGGTACCCGGATGACAAGTGAAGAACTTCTAATTATC GAT；(SEQ IDNO.7)
NbVAP1-cluc-R：CTGCAGGTCGACAAAGTTTCTGACAATGTACCC。(SEQ ID NO.8)
注：斜体部分为载体与片段的同源臂。
扩增NbVAP1基因后同源重组到瞬时表达载体pcluc(pCambia1300-cluc)上，构建得到重组表达载体cluc-NbVAP1。
设计特异性扩增引物PVY6K2-Xba1-F和PVY6K2-BamH1-R，其序列如下：
PVY6K2-Xba1-F：GCTCTAGAATGGCAACAACTTCACTCGC；(SEQ ID NO.9)
PVY6K2-BamH1-R：CGGGATCCTTACTGGTGAGACACAGTTTCAAC。(SEQ ID NO.10)
注：前两位碱基是酶切位点的保护碱基，斜体部分分别为XbaⅠ及BamHⅠ两个限制性内切酶位点。
利用上述特异性引物进行扩增，将扩增片段酶切后连接到瞬时表达载体p35SUTReGFP(该瞬时表达载体基于农杆菌双元表达载体pCAMBIA0390构建，在MCS前插入35S启动子，TVBMV的5'-UTR，在MCS后插入eGFP编码序列；瞬时表达载体包含35S启动子、TVBMV 5'非翻译区和eGFP编码序列)上，构建得到重组表达载体PVY6K2-eGFP。
将扩增片段酶切后连接到载体pYFPc(GenBank:EU796361.1)上，构建得到重组表达载体PVY6K2-YFPc。
设计特异性扩增引物BD-PVY6K2-F和BD-PVY6K2-R，其序列如下：
BD-PVY6K2-F：GAGGACCTGCATATGATGGCAACAACTTCACTCGC；(SEQ ID NO.11)
BD-PVY6K2-R：CAGGTCGACGGATCCTTACTGGTGAGACACAGTTTCAAC。(SEQ ID NO.12)
注：斜体部分为载体与片段的同源臂。
扩增PVY6K2后同源重组到瞬时表达载体pGBKT7上，构建得到重组表达载体BD-PVY6K2。
设计特异性扩增引物nluc-PVY6K2-F和Nluc-PVY6K2-R，其序列如下：
nluc-PVY6K2-F：GAGCTCGGTACCCGGGATCCATGGCAACAACTTCACTCGC；(SEQ ID NO.13)
nluc-PVY6K2-R：CGAGATCTGGTCGACTTACTGGTGAGACACAGTTTCAAC。(SEQ ID NO.14)
注：斜体部分为载体与片段的同源臂。
扩增PVY6K2以后同源重组到瞬时表达载体pnluc(pCambia1300-nluc)上，构建得到重组表达载体PVY6K2-nluc。
(2)核酵母双杂交试验：
酵母双杂交(Y2H)检测采用GAL4系统进行，将重组表达载体AD-NbVAP1、BD-PVY6K2用醋酸锂法转化到Y2H酵母菌株中。将转化好的酵母细胞平涂到酵母培养板SD/-Trp/-Leu(二缺)上；培养2-3d后，再次活化到酵母培养板SD/-Trp/-Leu/-His(三缺)上，2-3d后观察是否长斑。醋酸锂转化法如下：
A：酵母感受态的制备：
1)从保存在离心管中的酵母菌液中蘸取少量的酵母，在YPDA固体培养基上划线，30℃培养2-3d至单菌落出现。
2)挑取单菌落于2mL液体YPDA培养基中，30℃，220rpm培养1d。
3)取2mL酵母菌液加入到100mL YPDA培养基中(使用之前加入0.2％ Ade 1.5mL，40％ D-无水葡萄糖5mL)，30℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.5。
4)将酵母菌液转移至两个100mL离心管中，700×g，室温离心5min。
5)弃上清，每管加入30mL灭菌水，重悬菌体，700×g，室温离心5min。
6)弃上清，每管加入1.5mL 1.1×TE/LiAc溶液重悬菌体。TE/LiAc溶液配制如下：
表1：1.1×TE/LiAc的配制体系
7)重悬后转移至两个2mL离心管中，12000rpm离心15s。
8)弃上清，每管加入600μL 1.1×TE/LiAc溶液重悬菌体。
B：酵母转化：
1)在灭菌的离心管里加入两种质粒DNA各1μL，变性的鲑鱼精(95-100℃处理5min，冰上5min，重复两次)6μL，充分混匀。
2)加入制备好的感受态细胞50μL，轻轻混匀。
3)加入PEG/LiAc溶液500μL，轻轻混匀。PEG/LiAc溶液配制如下：
表2：PEG/LiAc的配制体系
4)30℃孵育30min，每10min翻转5-6次。
5)加入20μL DMSO(提高转化效率)，充分混匀。
6)42℃孵育15min，每5min翻转5-6次。
7)12000rpm离心15s，弃上清(用移液器吸净上清)。
8)加入100μL 0.9％ NaCl溶液重悬菌体。
9)用涂布器涂布在适当的培养基上，30℃培养2-3d。
(3)免疫共沉淀(Co-IP)和Western blot分析：
选取验证互作的两个蛋白(NbVAP1和PVY6K2)作为试验组，两个蛋白分别与对方标签作为两组阴性对照，农杆菌共浸润接种到本氏烟中，3天后采样进行检测。沿农杆菌浸润处将叶片剪下，称取2g新鲜叶片样品置于研钵中，加入液氮后研磨样品至粉末状。将研磨后的样品加入100mL离心管中，按1：1.5加入3mL蛋白提取液(25mM Tris-HCL PH7.4、150mMNaCl、0.5％ NP-40、0.5％蛋白酶抑制剂、10％甘油)，充分振荡混匀后置于冰上静置20min。12000×g，4℃离心20min，此时蛋白在上清液中，将上清转移到新的100mL离心管中重复离心，直至去除沉淀。使用0.22μM水系滤器过滤上清，去除不必要的杂质。将处理后的蛋白溶液置于10mL离心管中，加入20μL GFP-beads，将离心管置于冰上振荡孵育约30min，使6K2-eGFP与GFP-beads相结合。2500×g，4℃离心5min，小心吸取上清至废液缸，在离心管中加入1×PBS清洗GFP-beads，重复5次。2500×g，4℃离心5min，小心吸取上清至废液缸，加入50μL2×SDS上样缓冲液，封口后沸水浴5min，置于冰上。然后通过Western blot检测互作情况。
(4)萤火素酶互补试验(LUC)：
为了进一步研究两个蛋白是否在体内相互作用，可以选取萤火素酶互补试验进行验证。将需要验证互作的两个蛋白作为对照组，分别与对应的nLuc及cLuc作为阴性对照组。选取4周苗龄的本氏烟幼嫩叶片，在一片叶片中选取3个块区域农杆菌浸润分别接种菌液组合并做好记录，48h后进行活体成像观察蛋白互作强度，具体如下：
取接种后48h的本氏烟，将浸润叶片剪下，叶片背面向上放置于白色A4纸上，将配好的10mM D-Luciferin free acid母液用水稀释10倍，小喷壶喷洒到叶片背面，用手套轻轻将底物涂抹均匀。避光处理5min后活体成像仪中进行观察。
(5)双分子荧光互补试验(BiFC)
为了两个蛋白是否在体内相互作用，将含有不同BiFC载体的两个蛋白农杆菌共浸润到本氏烟叶片中，取接种后48h的本氏烟叶片，用刀片在叶片接种区域内切取2mm大小的正方形小块。在干净的载玻片上滴一滴清水，用镊子将切取的叶片背面向上置于载玻片的水滴上，从一侧缓慢盖上盖玻片，赶走多余气泡。将准备好的样品拿到蔡司LSM800共聚焦显微镜下观察是否有荧光。
2、试验结果：
核酵母双杂交试验结果显示：AD-NbVAP1与BD-PVY 6K2共存时在三缺培养基(SD-LWH)上可以形成阳性菌落；而两者分别与空对照共存时不能在三缺培养基形成阳性菌落(图1)。
为了验证NbVAP1与PVY 6K2是否在植物体内互作，首先进行了免疫共沉淀试验。构建了NbRVAP1-3MYC及PVY 6K2-eGFP，分别使用3MYC与PVY 6K2-eGFP组合及eGFP与NbVAP1-3MYC组合作为阴性对照，农杆菌共浸润接种本氏烟叶片。如图2所示，捕获PVY6K2-eGFP后使用MYC抗体能够成功检测到NbVAP1-3MYC，而捕获eGFP则不能检测到相应条带，说明NbVAP1与PVY 6K2在植物体内互相作用。
为了进一步验证NbVAP1与PVY 6K2在植物体内互作，进行了萤火素酶互补试验。利用pCAMBIA1300-nLuc和pCAMBIA1300-cLuc中的酶切位点，构建了pPVY 6K2-nLuc及pcLuc-NbVAP1，浸润接种本氏烟叶片。接种后48h，取接种叶片，使用含有1mmol·L–1萤火素底物D-luciferin的反应液均匀喷洒在叶片背面，并涂抹均匀，避光处理5分钟后置于活体成像系统进行观察。如图3所示，只有PVY 6K2-nLuc与cLuc-NbVAP1组合能够采集到发光图像，PVY6K2-nLuc与cLuc组合及nLuc与cLuc-NbVAP1组合均没有采集到发光图像图，表明NbVAP1与PVY 6K2在体内互作。
之后又进行了双分子荧光互补试验。构建了pNbVAP1-YFPn和pPVY 6K2-YFPc，按图中所示组合农杆菌浸润接种本氏烟叶片。接种后48h，制片，利用共聚焦显微镜进行观察。如图4所示，只有NbVAP1-YFPn与PVY 6K2-YFPn组合能激发黄色荧光，NbVAP1-YFPn与YFPc组合以及YFPn与PVY 6K2-YFPn组合不能激发黄色荧光，也进一步说明NbVAP1与PVY 6K2在体内互作。
综合上述试验结果可以看出：NbVAP1与PVY 6K2在体内互作。
实施例2：NbVAP1对PVY侵染影响的研究
1、试验方法：
(1)NbVAP1基因沉默对PVY侵染的影响：
将NbVAP1完整序列置于Sol Genomics Network网站(https://www.sgn.cornell.edu/)的序列分析工具VIGS TOOL中，选择本氏烟数据库，设置片段长度为300bp，预测出作为RNA沉默的最优片段，将预测出的300bp NbVAP1片段(SEQ ID NO.15所示)克隆到TRV2载体。具体如下：
首先利用本氏烟cDNA扩增出的完整NbVAP1片段作为模板，设计扩增长度为300bpNbVAP1沉默片段的引物TRV2-NbVAP1-F：GCTCTAGAGGGGTAGACCCAGGGTTC；(SEQ ID NO.16)；TRV2-NbRNF170L-R：CGGGATCCATGACAAGTGAAGAACTTCT AATTATCGA(SEQ ID NO.17)；序列中前两位碱基为酶切位点的保护碱基，斜体部分分别为XbaⅠ及BamHⅠ两个限制性内切酶位点。利用酶切位点XbaⅠ和BamHⅠ将TRV2载体线性化，然后与扩增好的NbVAP1沉默片段进行T4连接，构建得到TRV2-Nb VAP1。
选取2-3周苗龄的幼嫩本氏烟，将TRV2-NbVAP1与TRV1调整农杆菌终浓度OD600＝1.0后按体积比1：1共浸润到本氏烟下部叶片。GUS基因为β-葡萄糖苷酸酶，存在于细菌基因组内，利用pTRV2-GUS与pTRV1共浸润的烟草作为阴性对照。PDS基因为八氢番茄红素脱氢酶，沉默PDS基因会使植株发生白化，以pTRV2-PDS与TRV1共浸润的烟草白化程度作为后续试验指示。
沉默后10天左右，根据沉默PDS的本氏烟草上部系统叶片白化情况，取沉默目的基因植株的系统叶片，提取植物总RNA检测沉默效率。选取沉默效率较高的本氏烟摩擦接种PVY病毒，具体接种方法为：
称取-80℃冰箱保存的PVY-GFP毒源(将全长的PVYN605序列克隆到pCB301载体上，GFP基因插入在NIb和CP基因之间)0.5g，放入磨样袋中，按照毒源：超纯水＝1:4进行稀释，充分稀释。选取大小合适的需要摩擦接种病毒的本氏烟苗，将金刚砂均匀地撒在植株，在每个需要接种的系统叶片上用移液器滴加80μL毒源。佩戴乳胶手套将毒源在叶片上轻轻涂抹均匀，一定小心不要破坏叶片。
摩擦接种病毒后第三天开始每天用手持紫外等观察病毒发病情况并用相机拍照，取系统叶片采样，使用anti-GFP抗体Western blot检测病毒积累量。以接种pTRV-GUS烟草作为对照，明确沉默后是否会对病毒侵染造成影响。
(2)NbVAP1基因过表达对PVY侵染的影响：
将PVY的P3N-PIPO第177位的K和第200位的Q这两个氨基酸密码子同时突变成终止密码子，产生移动缺陷型突变体PVYPIPOSTOP。所构建的PVY移动缺陷型突变体，不能移动，只有复制能力。过表达NbVAP1-3MYC以后接种PVYPIPOSTOP，以PVYPIPOSTOP与单独表达3MYC的空载体作为阴性对照，检测过表达NbVAP1-3MYC是否影响PVY的复制。具体方法如下：
使NbVAP1-3MYC农杆菌终浓度OD600＝1.0、PVYPIPOSTOP农杆菌终浓度OD600＝0.5，浸润接种后第三天开始观察PVYPIPOSTOP的表达情况并拍照记录。观察过程中选取不同的时间点取叶采样，使用PVY-GFP抗体进行Western blot检测病毒积累量。明确过表达NbVAP1后是否会对PVY的复制造成影响。
2、试验结果：
为了研究NbVAP1的功能及NbVAP1对PVY侵染的影响，利用Sol Genomics Network网站VIGS TOOL工具预测了NbVAP1的沉默序列，进而利用TRV诱导的基因沉默降低NbVAP1基因表达，构建NbVAP1沉默载体TRV2-NbVAP1，以TRV2-GUS作为阴性对照。将TRV2-NbVAP1及TRV2-GUS分别与TRV11：1共浸润接种本氏烟。接种后第10天对系统叶片进行采样，提取植物总RNA，反转录后实时荧光定量PCR检测NbVAP1的mRNA积累水平，与对照相比，沉默NbVAP1的本氏烟中NbVAP1的mRNA水平显著降低，沉默效率高达85％(图5)。
对沉默NbVAP1的本氏烟及对照摩擦接种PVY-GFP，接种后第五天，沉默NbVAP1的本氏烟叶片表现出更为严重的PVY侵染症状且GFP表现出的荧光更强(图6)。取系统叶片，提取植物总蛋白，通过Western blot检测GFP积累量。与对照相比，沉默NbVAP1本氏烟中病毒积累量更高(图7)。结果表明，沉默NbVAP1促进PVY的侵染。
为了研究过表达NbVAP1对病毒侵染的影响。以3MYC空载体为阴性对照，过表达NbVAP1-3MYC后72h在过表达区域农杆菌浸润接种PVY-PIPOSTOP，接种后第4天紫外灯下进行观察，与对照相比，过表达NbVAP1的区域GFP荧光强度更弱，说明其病毒积累水平可能较低(图8)。接种60h后对接种区域进行取样，提取植物总RNA，反转录后实时荧光定量PCR检测PVY CP的mRNA积累水平，与对照相比，沉默NbVAP1的本氏烟中PVY CP的mRNA水平显著降低(图9)。接种5天后对接种区域进行取样，提取植物总蛋白后Western blot检测病毒积累水平，结果显示过表达NbVAP1的本氏烟中病毒积累水平显著低于对照(图10)，以上结果表明：过表达NbVAP1能够抑制PVY侵染。
上述结果表明：NbVAP1负调控PVY侵染。
实施例3：NbVAP1中决定6K2与VAP1互作以及调控PVY的侵染的关键氨基酸位点确定
1、蛋白结构域预测：
首先使用TMHMM Server v.2.0网站预测NbVAP1的跨膜区，使用SMART网站预测该蛋白结构域。
NbVAP1-2蛋白结构域的预测结果显示：NbVAP1的N-端有一个motile sperm(MSP)结构域，是VAP家族蛋白的典型特征，在调节内质网形态中发挥作用。另外，NbVAP1的C-端有一个跨膜结构域，表明该蛋白可能为膜相关蛋白(图11)。
2、NbVAP1关键区域的确定：
为了寻找NbVAP1中决定6K2和VAP1之间的互作的关键位点，首先将连续的五个位点全部变为丙氨酸作为F和R引物的重叠区，然后在重叠区前后分别选择F和R引物的非重叠区，设计出突变引物，再经过突变PCR构建了pGADT7-NbVAP1、cLuc-NbVAP1、NbVAP1-YFPn五位点连续丙氨酸突变载体，然后分别进行核酵母双杂交试验、萤火素酶互补试验和双分子荧光互补试验，试验方法同实施例1，确定NbVAP1与6K2互作的关键区域。
结果都表明：NbVAP1的11-20位氨基酸是二者互作的关键区域(图12)。
3、NbVAP1关键氨基酸位点的确定
将pGADT7-NbVAP1互作的关键区域中的氨基酸进行单位点丙氨酸突变，然后与野生型的pGBKT7-PVY6K2和共转酵母菌株Y2H，待SD/-Trp/-Leu(二缺)长斑后转移至SD/-Trp/-Leu/-His(三缺)上，根据在三缺上能否形成阳性菌落初步确定关键氨基酸位点。
结果显示BD-PVY6K2与AD-NbVAP1F15A在三缺上共存时不能形成阳性菌落(图13)。
然后为了进一步确定二者互作的关键位点，进行了萤火素酶互补试验，构建了突变体cLuc-NbVAP1F15A，与野生型PVY6K2-nluc共浸润接种本氏烟，48h利用于活体成像系统进行观察。
结果显示突变体的互作强度明显低于野生型(图14)。这些结果都表明NbVAP1的第15位氨基酸残基决定6K2和VAP1之间的互作。
4、NbVAP1关键氨基酸位点对PVY侵染的影响考察
为了确定NbVAP1第15位苯丙氨酸对PVY侵染的影响，以NbVAP1-3MYC为对照(WT)，过表达NbVAP1F15A-3MYC后72h在过表达区域农杆菌浸润接种PVY-GFP，接种后第3天紫外灯下进行观察，对接种区域进行取样，提取植物总蛋白后Western blot检测病毒积累水平。
与对照相比，过表达NbVAP1-2F15A的区域GFP荧光强度更强，说明其病毒积累水平可能更高(图15)。对接种区域进行取样，提取植物总蛋白后Western blot检测病毒积累水平，结果显示过表达NbVAP1F15A的本氏烟中病毒积累水平高于对照(图16)。都说明NbVAP1的第15位氨基酸残基(是从起始密码子编码的后一个氨基酸开始计数)是调控PVY侵染的关键氨基酸位点。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控马铃薯Y病毒的侵染；
(2)调控植物对马铃薯Y病毒的抗性；
所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1通过与马铃薯Y病毒中的6K2蛋白互作来调控马铃薯Y病毒的侵染。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1调控马铃薯Y病毒侵染的关键氨基酸位点为第15位氨基酸苯丙氨酸。
4.囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对马铃薯Y病毒的抗性；
(2)培育抗马铃薯Y病毒的植物品种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因为如下(i)或(ii)所示的核酸分子：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
(ii)除(i)以外的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸分子。
6.含有囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因的重组表达载体或工程菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控植物对马铃薯Y病毒的抗性；
(2)培育抗马铃薯Y病毒的植物品种。
7.一种提高植物对马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使植物中囊泡相关膜蛋白的相关蛋白VAP1的编码基因过表达。
8.一种培育抗马铃薯Y病毒的转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将VAP1基因导入野生型植物中，获得VAP1基因过表达植物；所获得的VAP1基因过表达植物对马铃薯Y病毒的抗性高于野生型植物；
所述VAP1基因为如下(i)或(ii)所示的核酸分子：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
(ii)除(i)以外的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸分子。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102822196A (zh) * | 2010-01-25 | 2012-12-12 | 阿勒根公司 | 将单链蛋白质细胞内转化成它们的双链形式的方法 |
| WO2015023639A2 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | New York University | Transgenic plants and a transient transformation system for genome-wide transcription factor target discovery |
| GB202103256D0 (en) * | 2021-03-09 | 2021-04-21 | Tropic Biosciences Uk Ltd | Method for silencing genes |
| CN113840925A (zh) * | 2019-03-14 | 2021-12-24 | 热带生物科学英国有限公司 | 修饰非编码rna分子对于在真核细胞中的沉默基因的特异性 |
| CN113906138A (zh) * | 2019-03-14 | 2022-01-07 | 热带生物科学英国有限公司 | 将沉默活性引入多个功能性失调的rna分子并修饰其对一感兴趣的基因的特异性 |
| CN114854785A (zh) * | 2021-02-05 | 2022-08-05 | 山东农业大学 | 一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用 |
| CN116063439A (zh) * | 2023-02-28 | 2023-05-05 | 山东农业大学 | 植物14-3-3h蛋白及其编码基因在抗马铃薯Y病毒中的应用 |
-
2023
- 2023-05-10 CN CN202310521702.3A patent/CN116640196B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102822196A (zh) * | 2010-01-25 | 2012-12-12 | 阿勒根公司 | 将单链蛋白质细胞内转化成它们的双链形式的方法 |
| WO2015023639A2 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | New York University | Transgenic plants and a transient transformation system for genome-wide transcription factor target discovery |
| CN113840925A (zh) * | 2019-03-14 | 2021-12-24 | 热带生物科学英国有限公司 | 修饰非编码rna分子对于在真核细胞中的沉默基因的特异性 |
| CN113906138A (zh) * | 2019-03-14 | 2022-01-07 | 热带生物科学英国有限公司 | 将沉默活性引入多个功能性失调的rna分子并修饰其对一感兴趣的基因的特异性 |
| CN114854785A (zh) * | 2021-02-05 | 2022-08-05 | 山东农业大学 | 一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用 |
| GB202103256D0 (en) * | 2021-03-09 | 2021-04-21 | Tropic Biosciences Uk Ltd | Method for silencing genes |
| CN116063439A (zh) * | 2023-02-28 | 2023-05-05 | 山东农业大学 | 植物14-3-3h蛋白及其编码基因在抗马铃薯Y病毒中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 姬丽云等: "衣壳蛋白参与调控马铃薯Ｙ 病毒在珊西烟上症状的关键氨基酸鉴定", 植物病理学报, vol. 53, no. 5 * |
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