KR101435715B1

KR101435715B1 - 감자바이러스 Ｘ의 ＲＮＡ, 외피 단백질과 상호작용하는 기주 단백질 ＮｂＤｎａＪ의 기능 분석

Info

Publication number: KR101435715B1
Application number: KR1020120082311A
Authority: KR
Inventors: 김국형; 조상윤; 조원경; 손성한
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-09-01
Also published as: KR20140014936A

Abstract

본 발명은 NbDnaJ 단백질 및 이를 포함하는 바이러스 저항성 식물 및 이의 이용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 NbDnaJ 단백질 및 이를 암호화하는 유전자, 상기 NbDnaJ 단백질을 일시적으로 발현 또는 형질전환된 바이러스 저항성 식물체, 상기 NbDnaJ 단백질을 이용한 식물체의 바이러스 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 NbDnaJ 단백질을 이용한 바이러스 증식 억제 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

감자바이러스 Ｘ의 ＲＮＡ, 외피 단백질과 상호작용하는 기주 단백질 ＮｂＤｎａＪ의 기능 분석{Functional analysis of the host protein NbDnaJ of Potato virus X RNA and coat protein}

본 발명은 PVX의 기주 식물인 가지과 식물의 바이러스 저항성 품종 육종에 적용된다.

식물 바이러스병의 방제를 위해서는 바이러스의 병 발생 기작을 이해하는 것이 가장 우선적인 과제이다. 바이러스가 기주 내에서 상호작용하는 기주 단백질들을 분석함으로써 식물체와의 상호작용을 이해하고 병 방제에 중요한 요인들을 확인할 수 있다.

Potato virus X(PVX)는 분자의 기능이 집중 연구되고 있는 중요 바이러스 중 하나이다. PVX는 작용 요소(SL1 RNA) 뿐만 아니라 RNA 의존성 RNA 폴리머레이즈(RNA-dependent RNA polymerase; RdRp), CP 및 트리플 유전자 블록 단백질 TGBp1, TGBp2, 및 TGBp3를 포함하고, 이 단백질들 모두가 바이러스 복제, 이동 및 조립(assembly)에 필요하다. 예컨대, 기존 연구에서 PVX CP와 상호작용하는 NbPCIP로 명명된 Nicotiana benthamiana 단백질이 바이러스 복제와 관련된다고 보고되었다. 식물 DnaJ 유사 단백질의 발현 및/또는 결합 행동의 조절의 결과로서 일시적인 또는 영구적인 바이러스 저항성을 갖는 식물 또는 식물 세포에 관한 선행기술이 존재하였지만, 지금까지 SL1 RNA of PVX과 상호작용하는 기주 단백질의 분자적 기능에 대해서는 밝혀진 바가 없었다. 본 발명에서는 SL1 RNA와 상호작용하는 숙주 인자로서 동정된 N. benthamiana 유래의 DnaJ 유사 단백질의 특성을 규명했다.

본 발명의 예비 실험에서는 프로테오믹스 방법을 도입하여 PVX의 RNA와 상호작용하는 기주 단백질들을 스크리닝하였다. PVX RNA 그리고 단백질과의 상호작용함을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo)에서 확인하고 여러 바이러스의 증식에 따른 NbDnaJ 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 그리고 기주 단백질의 돌연변이체를 이용하여 식물체 내에서 PVX의 외피 단백질과 상호작용하는 중요한 도메인을 또한 확인하였다. 이러한 기술들로 PVX와 상호작용하는 NbDnaJ 단백질의 기능 분석 방법을 구축하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 NbDnaJ 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 일시적으로 발현(transient expression)된 것을 특징으로 하는, 바이러스에 대한 저항성이 증가된 식물체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자가 형질전환된 것을 특징으로 하는, 바이러스에 대한 저항성이 증가된 식물체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 NbDnaJ 단백질 유전자를 식물에 형질전환하여 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 일시적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스 저항성 증진 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체내에서 서열번호 1의 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스에 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3의 NbDnaJ 단백질의 C-말단 단백질을 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스에 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물 세포에 임의 물질을 처리하는 단계; 및

상기 식물세포 내 NbDnaJ 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물성 바이러스 억제물질 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위하여, 본 발명의 제 1 형태는 서열번호 1의 NbDnaJ 단백질을 제공한다. NbDnaJ 단백질은 본 발명자들이 SL1 RNA와 상호작용하는 기주 인자로 동정한 N. benthamiana 유래의 DnaJ 유사 단백질이다. NbDnaJ의 유전자 서열(GenBank ID:AEE92843.1)은 NCBI의 GenBank에 2012년 3월 1일 등록되었다. 상기 NbDnaJ 단백질은 이의 “기능적 동등물”을 포함한다. 상기 NbDnaJ 단백질 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 상기 NbDnaJ 단백질의 기능을 유지하는 것 모두를 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 상기 NbDnaJ 단백질의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명의 제 2 의 형태는 서열번호 1의 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 바람직하게는 서열번호 2의 서열을 가진 유전자이다. 서열번호 1을 암호화하는 유전자는 코돈 축퇴성 서열을 포함한다. "코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 NbDnaJ 단백질과 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 의미한다.

본 발명의 제 3 의 형태는 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또 다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명의 제 4 의 형태는 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 일시적으로 발현(transient expression)된 것을 특징으로 하는, 바이러스에 대한 저항성이 증가된 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 이에 한정되는 것은 아니나 작용식물일 수 있고, 바람직하게는 가지과 작물인 토마토, 고추 또는 감자일 수 있으며, 기타 곡류인 벼, 옥수수 또는 면화에 적용될 수 있다. 보다 더 구체적으로는 토마토 또는 담배이다. 보다 더 바람직하게는 상기 식물체는 N. benthamiana이다.

본 발명의 제 5 의 형태는 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자가 형질전환된 것을 특징으로 하는, 바이러스에 대한 저항성이 증가된 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 이에 한정되는 것은 아니나 작용식물일 수 있고, 바람직하게는 가지과 작물인 토마토, 고추 또는 감자일 수 있으며, 기타 곡류인 벼, 옥수수 또는 면화에 적용 될 수 있다. 보다 더 구체적으로는 토마토 또는 담배이다. 보다 더 바람직하게는 상기 식물체는 N. benthamiana 이다. 본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다. 적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 식물세포를 이용한다.

본 발명의 제 6 의 형태는 NbDnaJ 단백질 유전자를 식물에 형질전환하여 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 바이러스 저항성은 바이러스의 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는, 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법일 수 있다. 상기 바이러스 저항성은 바이러스의 복제를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법일 수 있다. 상기 바이러스는 PVX 또는 TMV일 수 있다. 식물 형질전환을 위한 필수적인 조건은 식물체의 조직 일부에서 정상적인 식물체로 재분화시키는 기술이다. 특히 고빈도의 식물체 재분화 조건일 때 형질전환이 보다 용이하므로 이러한 재분화 체계의 확립은 매우 중요하다. 현재 식물의 형질전환 기술은 식물 병원성균인 아그로박테리움(Agrobacterium)과 식물조직 절편을 공동 배양하여 아그로박테리움 내에 있는 일부 유전자(T-DNA)가 식물 세포 내로 전이되어 식물의 염색체 내에 삽입되는 현상을 이용하는 방법으로서, 도입하고자하는 유용유전자와 형질전환된 세포를 선발할 수 있는 항생제 저항성 유전자를 T-DNA 사이에 삽입한 유전자 운반체를 제작하여 사용하고 있다. 즉, 아그로박테리움은 그들의 Ti(tumor-inducing) 또는 Ri(root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부 T-DNA를 감염된 식물 세포내로 전이시키는 능력을 갖고 있기 때문에, 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합 한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동배양하면 식물세포의 형질전환이 가능하다[Binns et al., Ann Rev Microbiol. 42:575-606, 1988].

본 발명의 제 7 의 형태는 상기 NbDnaJ 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 일시적 발현(transient expression)시키는 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스 저항성 증진 방법을 제공한다. 일시적 발현(transient expression) 기술은 원하는 유전자의 산물(단백질)을 형질 전환 과정 없이 담배 잎과 같은 식물을 통해 대량으로 발현시켜 유전자 재조합 산물을 얻을 수 있는 기술이다.

본 발명의 제 8 의 형태는 식물체 내에서 상기 NbDnaJ 단백질의 유전자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스에 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 유전자의 발현은 상기 유전자에 작동가능하도록 강한 프로모터를 삽입하여 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명에서는 현재 식물 유전자 과발현에 많이 사용하는 Caulimovirus 35S 프로모터를 사용하였다. 상기 유전자의 발현은 상기 유전자의 복제수를 증가시켜 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스에 저항성을 증가시키는 방법이다. 상기 유전자의 발현은 상기 유전자의 mRNA의 안정성을 증가시켜서 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현은 상기 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 안정성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 제 9 의 형태는 서열번호 3의 NbDnaJ 단백질의 C-말단 단백질을 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 식물체 바이러스에 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 서열번호 3의 NbDnaJ 단백질의 C-말단은 캡시드 단백질(CP)와 결합에 관여하는 것으로 서열번호 3으로도 본 발명의 효과가 예상이 된다.

본 발명의 제 10 의 형태는 식물 세포에 임의 물질을 처리하는 단계; 및

상기 식물세포 내 NbDnaJ 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물성 바이러스 억제물질 스크리닝 방법을 제공한다. 보다 더 구체적으로 상기 스크리닝 방법은 상기 증가된 NbDnaJ 단백질이 바이러스의 캡시드 단백질(capsid protein; CP)와 상호결합하는 것을 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 단백질의 발현의 증가는 면역침전법, 전기영동법, 전기 영동적 이동성의 변화 분석(electrophoretic mobility gel shift assay; EMSA)법 PCR법 등을 이용하여 확인할 수 있다. 단백질-단백질 상호작용의 확인은 이스트-하이브리다이제이션법, 생체분자 형광 상보 분석법(bimolecular fluorescence complementation analysis; BiFC)법 등을 이용할 수 있다.

PVX의 SL1 RNA는 바이러스의 RNA 축적, 감염력 및 이동성과 관련이 있다. 따라서, SL RNA와 상호작용하는 기주 인자를 찾는 것과 바이러스 감염과 바이러스감염과 연관된 기주 단백질의 기능을 밝히는 것은 매우 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 PVX SL RNA와 결합하는 다수의 기주 단백질을 동정했다. 또한 초기에 SL1 RNA와 상호작용하는 단백질로서 동정된, NbDnaJ라 명명한 기주 단백질을 분리하여 특성을 규명했다.

NbDnaJ와 SL1 RNA 및 PVX CP와의 상호작용이 PVX 감염이 일어날 때, NbDnaJ의 기능에 관련된 것일수 있다. NbDnaJ 기능의 손실은 PVX-sGFP 이동성을 증가시킨 반면에, NbDnaJ의 과발현은 그 이동성을 감소시켰다. 이러한 실험결과는 PVX 이동을 억제하는데 있어서 NbDnaJ가 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 분리된 원형질체를 사용한 PVX 복제 분석법이 SL1 RNA가 바이러스의 복제 및 이동에 필요하다는 것을 보여주었기 때문에 본 발명에서는 NbDnaJ가 PVX 복제의 음성 조절자이다.

일반적으로, 바이러스 감염은 Hsp70 및 Hsp40(DnaJ 유사 단백질)을 포함하는 많은 열충격 단백질(heat shock protein; Hsp)을 유도한다. 흥미롭게도, PVX 감염은 NbDnaJ의 전사 수준을 일시적으로 증가시켰고, 이것은 NbDnaJ가 PVX 감염의 초기 단계에 필요하다는 것을 나타낸다. 본 발명에 따르면 식물체의 열충격 단백질(heat shock protein; Hsp) 관련 단백질(스트레스 관련 단백질)이 PVX의 RNA 그리고 외피 단백질과 상호작용하여 바이러스의 이동을 저해한다는 결과를 얻었다. 또한 외피 단백질과 상호작용함에 있어서 NbDnaJ 단백질의 3´말단 부분도 중요함을 확인하였다. 결론적으로 본 발명에서는 새롭게 동정된 NbDnaJ가 초기 바이러스 감염 단계에서 PVX 복제 및 이동의 음성 조절자이고 NbDnaJ가 PVX SL RNA와 상호작용을 한다는 사실을 제공한다. 따라서, 이러한 기능 분석을 통해서 규명한 물질과 방법을 가지과 작물에 적용하면 바이러스병의 방제에 도움을 줄 수 있는 저항성 품종을 제공할 수 있다.

도 1은 SL1 RNA(-)가닥과 상호작용하는 NbDnaJ 단백질의 분리를 보인다. (a) NbDnaJ 유전자의 아미노산 서열. 밑줄 및 회색으로 칠해진 아미노산은 각각 J 도메인 및 C-말단 부위를 나타낸다. 2개의 흰색으로 칠해진 서열은 라이신-풍부 모티프이다. (b) NbDnaJ와 상동성을 갖는 17가지 식물종에서 유래된 서열의 계통수. DnaJ 유사 단백질의 과잉성 때문에, MEGA 4.1을 사용하여 구축된 계통수를 만들기 위해 각 식물종으로부터 최적 매치된 단백질만을 이용했다. 1000개의 복제체로부터 수득된 부트스트랩값을 각 분지에 나타냈다. (c) NbDnaJ 및 SL1 RNA간의 상호작용을 확인하기 위한 EMSA. ³²P로 표지된 SL1(+)(1-3번 레인) 및 SL1(-)(4-6번 레인) 전사체를 버퍼(1 및 4번 레인), 말토오스 결합 단백질(MBP, 2 및 5번 레인) 및 MBP와 융합된 NbDnaJ(3 및 6번 레인)와 혼합했다. 위쪽 화살표는 RNA-단백질 복합체를 나타낸다.
도 2는 바이러스 감염 후, NbDnaJ 및 바이러스의l RNA 수준의 정량적 RT-PCR 분석을 보인다. 정제된 PVX(a 및 b), TMV (c) 및 CMV (d)로 N. benthamiana 잎을 감염시킨 후 0 내지 60 시간 내의 다양한 시점에서 RNA 축적량을 qRT-PCR로 측정했다. NbDnaJ의 수준을 NbDnaJ(사각형) 및 신장인자-1α(삼각형)에 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 qRT-PCR로 측정했다. N. benthamiana 잎에 PVX, TMV 및 CMV를 감염시킨 후, 감염된 PVX(채워진 사각형 및 삼각형) 및 정상 N. benthamiana(개방형 사각형 및 삼각형)로부터 전체 RNA를 제조했다. 에러바는 3번 중복실험의 표준편차를 나타낸다.
도 3은 BiFC로 측정된 NbDnaJ 및 PVX 단백질간의 상호작용을 보인다. NbDnaJ 및 PVX 단백질간의 상호작용을 공동발현된 BiFC 구조물(각각의 이미지에 묘사됨)로 조사했다. 이미지 (A) 및 (B)는 각각 음성 및 양성 대조군이다. (CF) NbDnaJ 및 네 가지의 PVX 단백질간의 상호작용 (GI) NbDnaJ 결실 돌연변이체 및 PVX CP간의 상호작용. (J) NbDnaJ 결실 돌연변이체의 도식적 설명. 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.
도 4는 NbDnaJ를 일시적으로 과발현 및 저발현시키는 식물에서의 PVX 복제 및 이동성을 보인다. 대조군 벡터(pPZP)뿐만 아니라, NbDnaJ를 위해 과발현(pPZP-NbDnaJ)(a) 및 침묵(pPZP-NbDJ 3)(b)시킨 구조물을 N. benthamiana 잎으로 아그로인필트레이션(agroinfiltration)을 하였다. 각각의 주입(infiltrated)된 식물에서 NbDnaJ의 전사체량을 측정하기위해서, qRT-PCR을 이용했다. (c) PVX RNA의 축적량은 일시적인 과발현, 침묵, 야생형으로부터 분리한 원형질체를 사용하여 측정했다. 에러바는 표준편차를 의미하고, 유의성은 스튜던트 t 검정(^*P < 0.05)에 의해 평가되었다(d 및 e). PVX 이동성을 측정하기위해, pPZP를 발현하는 식물(도 4d 및 도 4e에서 a), pPZP-NbDnaJ(도 4d에서 b) 또는 pPZP-Nb2P3(도 4e에서 b)을 pSPVX-sGFP로 접종(challenge-inoculate)하였다. 10일 후, pSPVX-sGFP의 이동성을 UV 손램프로 관찰했다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다. 또한, "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 또는 소자에 대한 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

<실시예 1> NbDnaJ의 SL1 RNA의 (-)가닥에 결합

하기 실시예들을 위해 사용된 물질 및 방법은 하기와 같다.

1. N. benthamiana 유래의 DnaJ 유사 단백질을 암호화하는 cDNA의 분리

담배 BY-2 현탁 세포 유래의 DnaJ 유사 단백질을 S100 단백질 추출물을 이용하여, 2차원 젤 전기영동법으로 동정했다. PVX SL1(-) RNA 프로브로 노스웨스턴 블로팅 분석을 수행했다. DnaJ 유사 단백질에 대한 전장구조 cDNA를 분리하기 위해, N. benthamiana 잎으로부터 전체 RNA를 추출하고, 상술한 바와 같이, NtDnaJ 5‘ NTR_F (5’-TATTGAAGGAAAACCAAATAGGTCA-3‘, 서열번호 4) 및 NtDnaJ 3’ NTR_R (5‘-ACACATCACAACAAACCAGCTTTAA-3’, 서열번호 5)을 포함하는 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행했다. 프라이머를 공지된 Nicotiana tabacum DnaJ 유사 단백질 유전자 염기서열(GenBank ID: BAH70368)에 기초해 설계했다. 동정된 NbDnaJ의 뉴클레오타이드 서열을 NCBI의 Genbank에 등록하였다.

2. 전기 영동적 이동성의 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay analysis; EMSA)

SL1 RNA 단편을 PCR로 증폭하였고, T7 프로모터로 시험관내에서 전사시켰다. 각각의 표지된 프로브의 방사성을 액체 섬광계수기를 이용하여 측정했고, 분당 20000 카운트를 나타내는 RNA 프로브만을 EMSA에 사용했다. 말토오스 결합 단백질(MBP) 융합 단백질을 생산하기 위해서, EcoRI에 삽입된 NbDnaJ cDNA를 pMAL-c2X 벡터(New England Biolabs, USA) 내로 클로닝하여 E. coli BL21 세포에서 발현시켰다. 제조자(NEB, USA)의 지시에 따라 MBP와 융합된 NbDnaJ를 친화력 정제법에 의해 정제했다. EMSA를 상술한 것처럼 수행했다. 단백질을 0.5X TBE에 버퍼에서 5% 비변성 폴리아크릴 젤 상에 충진시켰다. 혼성화 후, Fujifilm Bio-Imaging Analyzer Systems(BAS-2500, Fujifilm, Japan)를 이용하여 방사능 사진촬영 결과를 수득했다.

3. 실시간 정량분석 RT-PCR(qRT-PCR)

하기 프라이머를 qRT-PCR 분석에 이용했다.

PVX 54_F(5'-ACACACCCGCTTGAAAAAGC-3', 서열번호 6),

PVX 111_R (5'-TTGGTAAACCTCGCGCACTT-3', 서열번호 7),

CMV CP (Fny) 147_F (5'-TCGTCCAACTATTAACCACCCAACC-3', 서열번호 8),

CMV CP (Fny) 252_R (5'-AGACCCACGGTCTATTTTTGGTGGC-3', 서열번호 9),

TMV 135_F (5'-AGTTTCAAACACAACAAGCGCGAAC-3', 서열번호 10),

TMV 240_R (5'-ACCTTAAAGTCACTGTCAGGGAACC-3', 서열번호 11),

NbDnaJ 914_F, (5'-TTCCAAAAGACCCGACAAAGA-3', 서열번호 12) 및

NbDnaJ977_R (5'-CGAACAGGGAACTTGATGTCAAA-3', 서열번호 13).

Applied Biosystems(Applied Biosystems, USA)로부터 유래된 표준 프로토콜에 따라, SYBR Green PCR Master Mix를 갖는 ABI PRISM 7500 Sequence Detection System을 이용했다. 유비퀴틴3(ubi3) 및 신장인자 1B(EF-1B)로 정상화한 후 NbDnaJ 유전자 발현 수준을 수득했다.

4. NbDnaJ 를 위한 과발현 및 침묵 구조물의 발생

NbDnaJ를 위해 증폭된 전장구조 cDNA를 과발현을 위해 개조된 pPZP212에 클로닝을 하였다. 침묵 구조물을 생성시키기 위해, 프라이머 NbDnaJ 101 MluI_F(5'-CGACGCGT TCCTGATAAGAACCC-3', 서열번호 14) 및 NbDnaJ 300 MluI_R(5'-CGACGCGT GGGCCTTCCCCGGTA-3', 서열번호 15)를 사용하여 NbDnaJ의 일부 서열을 PCR로 증폭했다. 일부 서열 중의 3개의 복제체를 개조된 pPZP212 벡터에 클로닝을 했다. 발생된 2개의 구조물을 Agrobacterium tumefaciens strain GV2260에 형질전환시켰다. 일시적인 과발현을 위해서 pPZP-NbDnaJ 및 Tomato bushy stunt 바이러스의 p19(pTBSV-p19)를 공-주입(co-infiltration)시켰다.

5. 공초점 레이저 스캐닝 현미경( Confocal laser scanning microscopy )

LSM510 공초점 레이저 스캐닝 현미경 시스템(LSM 510, Carl Zeiss, Germany)을 YFP의 형광을 측정하기 위해 사용했다. YFP 축적에 대한 여기 및 방출 파장은 488/51040 nm이었다.

6. 생체분자의 형광 상보 분석( Bimolecular fluorescence complementation analysis ; BiFC )

NbDnaJ을 위해 StuI에 삽입된 전장구조 또는 결실 돌연변이체를 노란색 형광 단백질(YFPN)의 N-말단 지역을 포함하는 BiFC 벡터에 클로닝을 하였다. PVX 단백질(CP, TGB1, TGB2 및 TGB3) 및 NbDnaJ를 암호화하는 유전자를 YFP의 C-말단 부위(YFPC)를 포함하는 벡터에 클로닝을 하였다. YFPN-NbPCIP 및 YFPC-PVX CP 간의 상호작용을 양성 대조군으로서 이용했다. 모든 구조물을 A. tumefaciens strain GV2260에 형질도입하였다. N. benthamiana 잎에 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 한 3일 후에 형광 신호를 CLSM으로 측정했다.

7. PVX - sGFP 이동성 분석

pPZP-NbDnaJ(과발현), pPZP-NbDJ39(침묵) 및 pPZP(공벡터) 구조물을 N. benthamiana 잎에 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 하였다. 아그로-인필트레이션을 한지 3일 및 10일 후 pSPVXsGFP는 상위잎에 접종 하였다. 10일 후에 잎을 Dark Reader HL28T UV 램프 하에서 녹색 형광을 측정하기 위해 관찰하였다(Clare Chemical Research, USA).

8. 결과

발명자들은 PVX SL1 RNA와 상호작용하는 기주 인자를 동정하기 위해서, 노스웨스턴 블로팅 분석법으로 2차원 전기영동법을 수행했다. SL1 RNA (-)가닥(SL1-)에 결합하는, 동정된 기주 단백질들 중의 하나인 DnaJ 유사 단백질을 추가로 특성 분석하였다. N. benthamiana 유래의 DnaJ 유사 단백질 유전자의 전장구조 cDNA를 분리하기 위해서, N. tabacum의 DnaJ 유사 단백질 유전자 염기서열에 기초한 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행했다. 우리는 그 생성물을 N. benthamiana 유래의 DnaJ 유사 단백질(NbDnaJ; GenBank ID: JF694761)이라고 명명했다. NbDnaJ의 서열은 J 도메인(3-62 아미노산) 및 보존된 C-말단 부위(211-340 아미노산)를 갖는 343개의 아미노산으로 구성되어 있다(도 1a). NCBI 단백질 데이터베이스에서 블라스트P 검색을 이용하여 NbDNnaJ와 상동성을 갖는, 17개의 서로 다른 서열로 대표되는 다수의 단백질 서열을 밝혀냈다. 이러한 서열로 구축된 계통수는 NbDnaJ가 NtDnaJ, 뒤이어서 토마토 유래의 DnaJ 유사 단백질과 가장 밀접하게 연관되어 있다는 것을 보여주었다(도 2b).

NbDnaJ과 SL RNA (-)가닥과의 상호작용을 확인하기 위해서, 발명자들은 EMSA를 수행했다. 실험결과들은 ³²P로 표지된 SL1(-)RNA 및 NbDnaJ이 ³²P로 표지된 SL1(+) RNA와 비교할 때, 정제된 NbDnaJ만이 SL1(-) RNA와 시험관 내에서(in vitro) 상호작용한다는 것을 의미하는 지연된 이동성을 갖는 복합체를 형성했다는 것을 보였다(도 1c). 젤의 기저로 이동하는 밴드에 의해 나타난 것처럼, MBP나 버퍼만을 포함하는 레인은 SL1 RNA와 어떠한 상호작용도 보이지 않았다.

< 실시예 2> NbDnaJ 의 발현은 바이러스에 일시적으로 발현 될 때 유도됨.

바이러스 감염 후에 NbDnaJ의 mRNA 수준을 측정하기 위해, 발명자들은 N. benthamiana의 잎을 정제된 PVX에 접종했다. 우선, 발명자들은 바이러스 감염 후 다양한 시점에서 PVX RNA의 수준을 분석했다. RT-PCR 실험결과들은 PVX RNA의 수준이 접종한지 20 내지 60시간 후(hour post inoculation; hpi)에 급격하게 증가했다는 것을 나타냈다(도 2a). 동시에, 우리는 NbDnaJ 발현 수준을 측정해서 NbDnaJ 전사체가 PVC 감염 후 12시간이 지난 후 축적되기 시작해서, 24시간 지난 후 최대 수준에 도달했고, 36 시간이 지난 후 정상화되었다는 것을 발견했다(도 2b). 이러한 실험결과들은 NbDnaJ의 발현이 PVX RNA의 축적이 시작될 때 일시적으로 유도되었다는 것을 나타낸다. NbDnaJ 발현의 유도가 바이러스 의존적 방식으로 일어나는지를 알아내기 위해서, 발명자들은 N. benthamiana의 잎을 담배모자이크 바이러스(TMV) 및 오이모자이크 바이러스(CMV)로 접종했다. TMV 및 CMV RNA의 축적은 바이러스에 감염된지 24시간 후 급격히 증가했다. TMV는 감염을 위해서, 24 시간 내지 60 시간에서 NbDnaJ의 발현을 강하게 유도했다. 대조적으로, NbDnaJ의 수준은 CMV 감염에 의해 의미있게 변화되지 않았다(도 2d).

< 실시예 3> NbDnaJ 와 PVX 단백질간의 상호작용

PVX SL1 RNA은 PVX CP와 결합하고, 이러한 상호작용은 PVX 복제 및 이동에 필요하다. 그러므로, 발명자들은 BiFC 분석법을 이용하여 NbDnaJ와 PVX 단백질간의 상호작용을 조사했다. 다양한 조합의 YFPN 및 YFPC 융합 구조물을 코-아그로인필트레이션(co-agroinfiltration)을 한 후 CLSM으로 노락색 형광을 관찰했다. 양성 대조군으로서, 발명자들은 NbPCIP 및 PVX CP를 사용했다(도 3B). 노란색 형광은 PVX CP와 결합한 NbDnaJ에서 관찰되었지만(도 3C), 어떠한 다른 조합에서는 어떠한 형광도 관찰되지 않았다(도 3A 및 D 내지 F). 이러한 결과들은 NbDnaJ만이 PVX CP와 상호작용한다는 것을 나타낸다. PVX CP과의 상호작용을 위해 필수적인 도메인을 동정하기 위해서, J 부위 및 C-말단 도메인(도 3)을 결실시킴으로써 우리는 3차원 구조물을 생성했다(도 3J). BiFC 실험결과들은 J 도메인이 결실된 PVX CP가 DJ 도메인과 상호작용하지만 PVX CP는 DC 또는 DJ + C 와는 상호작용하지 않았다는 것을 보여주었다(도 3G-I). 이러한 데이터는 NbDnaJ의 C-말단 부위가 PVX CP와의 상호작용에 필요하다는 것을 시사한다.

< 실시예 4> PVX 복제 및 이동에 있어서 NbDnaJ 의 관여

DnaJ 유사 단백질은 바이러스의 복제 및 이동에 관여한다. NbDnaJ의 기능을 측정하기 위해, NbDnaJ 유전자에 대한 과발현 및 사일런스(silence) 벡터를 구축했다. 이러한 구조물 및 아그로인필트레이션 방법을 이용하여, NbDnaJ를 일시적으로 과발현하거나 저발현하는 N. benthamiana 식물을 생산했다. qRT-PCR 실험결과는 NbDnaJ에 대한 전사체 수준이 NbDnaJ 과발현 식물에 있어서 급격히 더 높아졌다지만(도 4a), 야생형 식물에서에서 보다 저발현 식물에서 3배가 더 낮아졌다는 것을 나타냈다(도 4b). PVX 복제를 측정하기 위해서, 과발현, 사일런스(silence) 및 야생형 식물로부터 원형질체(protoplast)를 제조했다. pSPVX에 감염시킨 후, PVX RNA의 수준을 qRT-PCR로 분석하여, PVX RNA의 수준이 야생형과 비교하여 과발현 식물에서 감소하고, 사일런스(silence) 식물에서 약간 증가한다는 것을 발견했다(도 4c). 이러한 실험결과는 NbDnaJ이 PVX RNA의 축적을 억제한다는 것을 나타낸다.

NbDnaJ 및 PVX CP간의 강한 상호작용은 NbDnaJ가 PVX 이동에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사한다. PVX 이동에 있어서 NbDnaJ의 기능적 역할을 시험하기 위해서, 우리는 sGFP와 융합된 PVX의 구조물을 이용하여 NbDnaJ 과발현, 사일런스(silence) 및 야생형 식물을 주입 했다. 과발현 식물에서, PVX-sGFP의 이동성은 대조군 식물과 비교해서 억제되었다(도 4d). 대조적으로, PVX-sGFP의 이동성은 사일런스(silence) 식물에서 증가했다(도 4e). 이것은 NbDnaJ가 음성 조절자가 될 수 있다는 것을 시사한다. 종합적으로 말하면, NbDnaJ은 PVX 복제 및 이동에 중요한 역할을 한다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Functional analysis of the host protein NbDnaJ of Potato virus X RNA and coat protein <130> PN120015 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 342 <212> PRT <213> Nicotiana benthamiana <400> 1 Met Gly Val Asp Tyr Tyr Lys Val Leu Gly Val Asp Lys Asn Ala Thr 1 5 10 15 Asp Asp Asp Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Met Lys Trp His 20 25 30 Pro Asp Lys Asn Pro Asn Asn Lys Lys Ala Ala Glu Ala Lys Phe Lys 35 40 45 Gln Ile Ser Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Ser Gln Lys Arg Ala 50 55 60 Val Tyr Asp Gln Tyr Gly Glu Asp Gly Leu Lys Gly Gly Val Pro Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ser Pro Phe Phe Ser Thr Gly 85 90 95 Glu Gly Pro Gln Ser Phe Arg Phe Asn Thr Arg Ser Ala Asp Asp Ile 100 105 110 Phe Ala Glu Phe Phe Gly Phe Ser Ser Pro Phe Gly Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Arg Gly Pro Arg Phe Gly Gly Thr Phe Gly Asp Asp Met Phe Ala Ser 130 135 140 Phe Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Gln Ser Ala 145 150 155 160 Pro Arg Lys Glu Ala Pro 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cgacgcgtgg gccttccccg gta 23

Claims

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서열번호 2의 NbDnaJ 유전자를 식물에 형질전화하여 식물에서 바이러스의 복제를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 바이러스는 PVX 또는 TMV인 것을 특징으로 하는, 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법.
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서열번호 3의 NbDnaJ 단백질의 C-말단 단백질을 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 식물에서 바이러스 저항성을 증진시키는 방법.
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