CN116637406A - 一种两步法制备富血小板血浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两步法制备富血小板血浆的方法。本发明一种两步法制备富血小板血浆，包括如下步骤：(1)螺口注射器Ⅰ吸取抗凝剂后采血，将螺口注射器Ⅰ折断推杆后密封，倒置进行第一次离心分离后，将螺口注射器Ⅰ通过两通连接管Ⅰ与螺口注射器Ⅱ密闭连接，螺口注射器Ⅱ取上层血浆层，并微量抽吸分层交界面的红细胞，螺口注射器Ⅰ中剩余下层红细胞层废弃；(2)将步骤(1)中含血浆层的螺口注射器Ⅱ倒置进行第二次离心分离，通过与两通连接管Ⅱ与注射器Ⅲ密闭连接，注射器Ⅲ转移上层贫血小板血浆层，并废弃；剩余螺口注射器Ⅱ中血浆即得到富血小板血浆。本发明制备的PRP质量高、稳定性好，制备方法能降低空气污染风险。
Description
技术领域
本发明属于生物医药中再生医学技术领域，涉及一种两步法制备富血小板血浆的方法。
背景技术
目前临床使用的富血小板血浆(PRP)制备主要分两种：一种是商业套装制备；另一种是实验室手工制备。商业套装制备价格昂贵，患者负担重，难以全面临床推广使用。商业制备套装又分两种：一种是带分离胶的制备套装；一种是不带分离胶的自然离心法套装。分离胶制备套装以瑞珍为代表，抽血量少，但是分离制备出PRP浓度低，其次分离胶有碎裂或微粒释放风险，打入人体可能引起异物排斥反应。不带分离胶套装是威高为代表，抽血量大，制备出来的PRP质量可靠、稳定，但价格高。
实验室手工制备方法原理和威高商业套装制备原理类似，两步离心法，价格低廉，但是传统手工制备方法在分离转移血浆过程中存在潜在感染风险。顺置法手工制备过程中需把注射器橡皮筛子拔掉，用注射器针头分离转移血浆，血液成份部分暴露于空气中，有感染风险。其次，第一步离心后，将试管下半部分的红细胞用一次性针管从底部抽取分离过程中，很难准确把握红细胞和富血小板血浆交界面，操作稍有不慎，部分富血小板血浆就会被误吸移走，导致制备出的富血小板血浆质量下降。
环境温度可影响血液细胞活性，制备室环境温度过低或过高都会影响血液中血细胞稳定性和活性，进而导致临床治疗疗效差异，20-26℃是制备富血小板血浆最佳环境温度。
发明内容
本发明的目的是提供一种两步法制备富血小板血浆的方法。本发明制备的PRP质量高、稳定性好，制备方法能降低空气污染风险。
本发明提供了一种两步法制备富血小板血浆，其特征在于，包括如下步骤：(1)螺口注射器Ⅰ吸取抗凝剂后采血，将所述螺口注射器Ⅰ折断推杆后密封，倒置进行第一次离心分离后，将所述螺口注射器Ⅰ通过两通连接管Ⅰ与螺口注射器Ⅱ密闭连接，所述螺口注射器Ⅱ取上层血浆层，并微量抽吸分层交界面的红细胞，所述螺口注射器Ⅰ中剩余下层红细胞层废弃；
(2)将步骤(1)中含血浆层的所述螺口注射器Ⅱ倒置进行第二次离心分离，通过与两通连接管Ⅱ与注射器III密闭连接，所述注射器III转移上层贫血小板血浆层，并废弃；剩余所述螺口注射器Ⅱ中血浆即得到富血小板血浆。
上述的方法中，步骤(1)中所述微量抽吸分层交界面的红细胞的量可为0.5·ml。
本发明步骤(1)中，所述上层血浆层呈淡黄色，包括贫血小板血浆和富血小板血浆。
本发明中，所述注射器III可为普通注射器或者螺口注射器。
上述的方法中，步骤(2)中所述富血小板血浆与步骤(1)中起始含抗凝剂的采血量的体积比可为2～3：20；具体可为2.5：20，如一次采全血20ml(含抗凝剂的量)最后得到2.5mlPRP。
上述的方法中，所述第一次离心分离的参数如下：室内温度为20℃～26℃，离心速率为1800rpm/min，724×g，时间为10分钟。
上述的方法中，所述第二次离心分离的参数如下：室内温度为20℃～26℃，离心速率为2450rpm/min，1343×g，时间为10分钟。
本发明中，保持室内温度，以使环境适中，防止环境温度下降或过高导致血液细胞成份活性下降，降低PRP疗效。
上述的方法中，步骤(1)中，所述抗凝剂与所述采血的量体积比为1:9；
所述抗凝剂包括枸橼酸钠抗凝剂。
上述的方法中，步骤(1)-(2)中离心分离的环境，在所述离心分离前后进行紫外线环境消毒1小时。
上述的方法中，所述注射剂采血后采用一次性无菌堵头封堵头端，摇匀，用一次性无菌密封袋封装所述注射器；
所述螺口注射器Ⅱ离心之前推杆折断并采用一次性无菌密封袋封装。
上述的方法中，所述第一次离心分离和所述第二次离心分离采用的离心机所用的离心机挂杯在使用前环氧乙烷消毒。
本发明具有如下优点：
(1)降低感染风险；PRP制备过程中血浆的转移采用两通连接管，整个过程完全在密闭环境中，极大地降低了感染风险；其次，由于PRP制备在专用制备室内制作，环境条件好，达到国家规定的医院消毒卫生国标中的Ⅱ类环境标准要求。
(2)制备的PRP质量高、稳定性好：适宜温度下，由于倒置法PRP血浆分离能精准分离红细胞、富血小板血浆及贫血小板血浆，极大的提升了产品稳定性。本发明统计了29份采血样本通过倒置法制备PRP检验统计结果显示：术前血小板平均值189.19±36.37×109/L，PRP测得血小板平均值1014.00±210.56×109/L，PRP平均浓度倍数5.32±1.21倍；另外富血小板血浆中为富白细胞或低白细胞PRP。
(3)环境温度控制：安装温度计，监测环境温度，PRP制备将环境温度控制在适宜温度。
附图说明
图1为采血后一次性无菌密封袋封装。
图2为本发明第一次离心分离的过程图，其中图2中(a)表示离心分离后的分层图，图2中(b)表示与两通连接管Ⅰ密闭连接取上层血浆层的示意图，图2中(c)注射器中剩余下层红细胞层。
图3为本发明第二次离心分离的过程图，其中图3中(a)离心分离后的图，图3中(b)表示与两通连接管Ⅱ密闭连接转移上层贫血小板血浆层，图3中(c)表示留取的底层血浆，图3中(d)表示最终获得的PRP。
图4为本发明实施例1得到的富血小板血浆测得的血小板及白细胞数量结果。
图5为本发明实施例2中实验组得到的富血小板血浆测得的血小板及白细胞数量结果。
图6为本发明实施例2中对照组得到的富血小板血浆测得的血小板及白细胞数量结果。
图7为本发明实施例2中对照组得到的PRP。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，离心机采用江苏常州良友医疗器械有限公司生产的TD5Z低速离心机，水平转子；
抗凝剂采用天津金耀医药有限公司生产的输血用枸橼酸钠，规格：10ML：0.25g/支；
注射器采用20ML螺口注射器或普通注射器。
本发明提供了一种两步法制备富血小板血浆，包括如下步骤：(1)螺口注射器Ⅰ吸取抗凝剂后采血，将所述螺口注射器Ⅰ折断推杆后密封，倒置进行第一次离心分离后，将所述螺口注射器Ⅰ通过两通连接管Ⅰ与螺口注射器Ⅱ密闭连接，所述螺口注射器Ⅱ取上层血浆层，并微量抽吸分层交界面的红细胞，所述螺口注射器Ⅰ中剩余下层红细胞层废弃；
(2)将步骤(1)中含血浆层的所述螺口注射器Ⅱ倒置进行第二次离心分离，通过与两通连接管Ⅱ与注射器III密闭连接，所述注射器III转移上层贫血小板血浆层，并废弃；剩余所述螺口注射器Ⅱ中血浆即得到富血小板血浆。
本发明采用倒置法两次离心制备富血小板血浆，与外界空气隔绝，大大降低了空气污染风险，得到的PRP产品稳定性高。
实施例1
(1)专门独立PRP制作室，制备前环境紫外线消毒1小时，确保室内环境达到医院消毒卫生国标中的Ⅱ类环境标准要求。
离心机挂杯及注射器试管保护套环氧乙烷消毒，确保无菌。
20ml螺口注射器专用密封袋，环氧乙烷灭菌消毒包装。
抗凝剂配比：按9:1比例配，取20ml螺口注射器两支，每支20ml螺口注射器抽取枸橼酸钠抗凝剂2.0ml，每支20ml螺口注射器取患者肘静脉血18ml，共取两支。
(2)螺口注射器Ⅰ采血完毕用一次性无菌堵头封堵注射器头端，后充分摇匀，用一次性无菌密封袋封装螺口注射器Ⅰ(如图2所示)，放入离心机挂杯内，对称放置，倒置进行第一次离心分离，室内温度控制在20℃左右，第一次离心参数：1800rpm/min，724×g，时间10分钟，离心后的螺口注射器Ⅰ分层如图2中(a)所示。通过两通连接管Ⅰ与螺口注射器Ⅱ密闭连接取上层血浆层，并微量(约0.5ml)抽吸分层交界面的红细胞(如图2中(b)所示)，螺口注射器Ⅰ中剩余下层红细胞层废弃(如图2中(c)所示)；
(3)将步骤(1)中含血浆层的螺口注射器Ⅱ倒置进行第二次离心分离，第二次离心参数：2450rpm/min，1343×g，时间10分钟，离心后如图3中(a)所示。通过两通连接管Ⅱ与普通注射器III密闭连接转移上层贫血小板血浆层(如图3中(b)所示)，并废弃；螺口注射器Ⅱ内剩余底层2.5ml(20ml全血一般最后得到2-3mlPRP，具体可为2.5ml)血浆即为PRP(如图3中(c)所示)，共获得5.0ml PRP(呈淡红色，如图3中(d)所示)。取1.0ml PRP送检，测血小板数量如图4所示。由图4中结果可知，本发明制备的富血小板血浆中血小板的计数为1053×109/L，因此，本发明制备的富血小板血浆中血小板的浓度高，因此说明本发明能精准分离红细胞、富血小板血浆及贫血小板血浆。且通过上述方法操作可知，本发明能降低感染风险的几率，是简单易操作的方法。
本发明还统计了29例健康志愿者的采血样本，采用血常规检验统计结果显示：血小板平均计数189.19±36.37×109/L；采用上述倒置法制备PRP检验统计结果显示：采用本发明PRP测得血小板平均值1014.00±210.56×109/L，上述对比可知PRP平均浓度倍数4.67±1.26倍，上述结果可知本发明两步法制备富血小板血浆的质量高、稳定性好。
实施例2
样本与抗凝剂配比：按9:1比例配，取20ml螺口注射器两支，每支20ml螺口注射器抽取枸橼酸钠抗凝剂2.0ml，每支20ml螺口注射器取同一患者肘静脉血18ml，共取两支。其中一支作为实验组，另一支作为对照组。制备实施前患者血常规检验基础血小板计数201×109/L，白细胞计数7.24×109/L。实验组按照本发明实施例1中方法，获得2.5ml PRP，取1.0ml PRP送检，测血小板数量如图5所示，由图5中结果可知，实验组制备的富血小板血浆中血小板的计数为1177×109/L，白细胞计数9.2×109/L。对照组按照本发明实施例1中方法，但对照组步骤(2)中通过两通连接管Ⅰ与螺口注射器Ⅱ密闭连接，仅取上层血浆层，不进行微量抽吸分层交界面的红细胞；最终获得1.5ml PRP(呈淡黄色，如图7所示)，取1.0mlPRP送检，测血小板数量如图6所示，由图6中结果可知，对照组制备的富血小板血浆中血小板的计数为663×109/L，白细胞计数0.9×109/L。
上述实验结果可知，本发明实验组制备富血小板血浆中血小板PRP量(2.5ml)，对照组方法制备的PRP量更少(1.5ml)，但实验组中血小板含量更高；另外，本发明实施例2中实验组方法制备出来的PRP较对照组制备出来的PRP白细胞含量更高。
Claims (9)
1.一种两步法制备富血小板血浆，其特征在于，包括如下步骤：(1)螺口注射器Ⅰ吸取抗凝剂后采血，将所述螺口注射器Ⅰ折断推杆后密封，倒置进行第一次离心分离后，将所述螺口注射器Ⅰ通过两通连接管Ⅰ与螺口注射器Ⅱ密闭连接，所述螺口注射器Ⅱ取上层血浆层，并微量抽吸分层交界面的红细胞，所述螺口注射器Ⅰ中剩余下层红细胞层废弃；
(2)将步骤(1)中含血浆层的所述螺口注射器Ⅱ倒置进行第二次离心分离，通过与两通连接管Ⅱ与注射器Ⅲ密闭连接，所述注射器Ⅲ转移上层贫血小板血浆层，并废弃；剩余所述螺口注射器Ⅱ中血浆即得到富血小板血浆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述微量抽吸分层交界面的红细胞的量为0.5·ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述富血小板血浆与步骤(1)中起始含抗凝剂的采血量的体积比为2～3：20。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次离心分离的参数如下：室内温度为20℃～26℃，离心速率为1800rpm/min，724×g，时间为10分钟。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次离心分离的参数如下：室内温度为20℃～26℃，离心速率为2450rpm/min，1343×g，时间为10分钟。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗凝剂与所述采血的量体积比为1:9；
所述抗凝剂包括枸橼酸钠抗凝剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)-(2)中离心分离的环境，在所述离心分离前后进行紫外线环境消毒1小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述注射剂采血后采用一次性无菌堵头封堵头端，摇匀，用一次性无菌密封袋封装所述注射器；
所述螺口注射器Ⅱ离心之前推杆折断并采用一次性无菌密封袋封装。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第一次离心分离和所述第二次离心分离采用的离心机所用的离心机挂杯在使用前用环氧乙烷消毒。
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| CN114010659A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-02-08 | 新疆维吾尔自治区人民医院 | 一种富血小板血浆的制备方法 |
| CN114010659B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-09-29 | 新疆维吾尔自治区人民医院 | 一种富血小板血浆的制备方法 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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