CN116637104A - 东革内酯在制备抑制白色念珠菌产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了东革内酯在制备抑制白色念珠菌产品中的应用，涉及生物医药技术领域。东革内酯能够有效抑制白色念珠菌的菌丝形成、生物膜形成，降低白色念珠菌在细胞上的粘附力，低浓度化合物对白色念珠菌生长无影响，从而有效治疗白色念珠菌感染或由白色念珠菌感染导致的疾病，其在新型抗真菌药物的开发，尤其是抗白色念珠菌感染药物的开发方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及东革内酯在制备抑制白色念珠菌产品中的应用。
背景技术
白色念珠菌是一种常见的共生真菌，寄生于口咽腔、胃肠道和阴道以及健康人的皮肤。人体内白色念珠菌的主要来源是胃肠道，感染的发生是由于寄居微生物区系的失调、免疫功能障碍和粘肠屏障的破坏。在健康人体黏膜表面，如口腔、肠道，白色念珠菌通常不会引起病害，但在免疫系统受到损害或抑制的病人(如化疗病人、器官移植病人或艾滋病人)体内，会引起严重的系统性感染，其致死率高达40％。
目前在临床上抗真菌药物种类有限，其中唑类药物(氟康唑)应用广泛，氟康唑通过抑制真菌复制起到抑菌作用。但是随着抗生素的滥用，耐药性的现象越来越严重。因此，需要提供新的具有较好抑制白色念珠菌作用的药物。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出东革内酯或其药学上可接受的盐的应用，东革内酯能够有效抑制白色念珠菌的菌丝形成、生物膜形成，降低白色念珠菌在细胞上的粘附力及细胞毒力，从而有效防治白色念珠菌感染或由白色念珠菌感染导致的疾病。
本发明还提供包括东革内酯或其药学上可接受的盐的产品。
本发明还提供一种非疾病诊断治疗目的地抑制白色念珠菌活性的方法。
根据本发明的第一方面实施例的东革内酯或其药学上可接受的盐在A1至A4任一项中的应用，
A1、制备抑制白色念珠菌活性的产品；
A2、制备用于抗白色念珠菌感染的产品；
A3、非疾病诊断治疗目的地抗白色念珠菌感染；
A4、制备用于预防和/或治疗由白色念珠菌感染导致的疾病的产品。
东革内酯的结构式如式I所示。
根据本发明的一些实施例，所述应用通过抑制白色念珠菌的菌丝形成、生物膜形成、降低白色念珠菌细胞粘附力和细胞毒力中的至少一种实现。
根据本发明的一些实施例，所述东革内酯或其药学上可接受的盐的有效作用浓度可以为12.5～100μM。例如：可以为12.5、20、30、40、50、60、70、80、90、100μM。
根据本发明的第二方面实施例的东革内酯或其药学上可接受的盐在B1或B2中的应用，B1、制备抑制白色念珠菌菌丝形成的产品；
B2、非疾病诊断治疗目的地抑制白色念珠菌的菌丝形成。
根据本发明的第三方面实施例的东革内酯或其药学上可接受的盐在C1或C2中的应用，C1、制备降低白色念珠菌细胞粘附力的产品；
C2、非疾病诊断治疗目的地降低白色念珠菌细胞粘附力。
根据本发明的第四方面实施例的东革内酯或其药学上可接受的盐在D1或D2中的应用，D1、制备抑制白色念珠菌生物膜形成的产品；
D2、非疾病诊断治疗目的地抑制白色念珠菌生物膜形成。
根据本发明的一些实施例，所述东革内酯或其药学上可接受的盐的有效作用浓度高于12.5μM。优选的为12.5～100μM.
根据本发明的第五方面实施例的东革内酯或其药学上可接受的盐在E1或E2中的应用，E1、制备降低白色念珠菌细胞毒力的产品；
E2、非疾病诊断治疗目的地降低白色念珠菌细胞毒力。
根据本发明的第六方面实施例的一种产品，包括东革内酯或其药学上可接受的盐；
所述产品具有F1至F7中的至少一种作用：
F1、抗白色念珠菌感染；
F2、预防和/或治疗由白色念珠菌感染导致的疾病；
F3、抑制白色念珠菌菌丝形成；
F4、降低白色念珠菌粘附力；
F5、抑制白色念珠菌生物膜形成；
F6、降低白色念珠菌细胞毒力。
根据本发明的一些实施例，所述产品为致病毒力抑制剂或药物。
根据本发明的一些实施例，所述产品还包括药物学上可接受的辅料。
根据本发明的一些实施例，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述产品的剂型选自乳剂、膏剂、气雾剂、悬浮剂、可湿性粉剂、粉剂、粒剂、水剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述产品以所述东革内酯或其药学上可接受的盐作为有效活性成分。
根据本发明的一些实施例，所述东革内酯或其药学上可接受的盐的有效作用浓度可以为12.5-100μM。
本发明至少具有如下有益效果：
酵母-菌丝二相性是白色念珠菌特有的特性。游离的酵母态在感染期间对于宿主是没有致病性的，主要行使粘附于受体组织的作用，随后进行由酵母态向菌丝态的转变以促进入侵，之后以菌丝态的形式侵染寄主组织，进一步发挥致病毒力作用。酵母-菌丝的形态转变是白色念珠菌发挥毒力的重要过程。而东革内酯能够有效抑制白色念珠菌的菌丝形成、生物膜形成、减少白色念珠菌在细胞上的粘附及细胞毒力，从而有效治疗白色念珠菌感染或由白色念珠菌感染导致的疾病，并且其不容易产生耐药性，对人体细胞无毒。东革内酯在新型抗真菌药物的开发，尤其是抗白色念珠菌感染药物的开发方面具有很好的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例1的DMSO对照组(A)和100μM东革内酯处理组(B)的白色念珠菌菌丝形成照片；
图2是本发明实施例1的东革内酯对白色念珠菌菌丝形成率的影响；其中，**表示与DMSO对照组相比存在显著性差异，p≤0.01，***表示与DMSO对照组相比存在极显著性差异，p≤0.001；
图3是本发明实施例2的东革内酯对白色念珠菌粘附力的影响；其中，*表示与DMSO对照组相比具有显著性差异，p≤0.05，***表示与DMSO对照组相比存在极显著性差异，p≤0.001；
图4是本发明实施例3的东革内酯对白色念珠菌的生物膜形成的影响；***表示与DMSO对照组相比存在极显著性差异，p≤0.001；
图5是本发明实施例4的东革内酯对白色念珠菌的生长的影响；
图6是本发明实施例5的东革内酯对白色念珠菌毒力的影响；其中A为东革内酯本身对A549细胞的细胞毒性检测结果，B为东革内酯对白色念珠菌毒力的影响检测结果；其中，**表示与DMSO对照组相比存在显著性差异，p≤0.01，***表示与DMSO对照组相比存在极显著性差异，p≤0.001；
图7是本发明实施例6的各处理组小鼠舌头的病理切片照片。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下述实施例中所用的东革内酯(Eurycomalactone)，CAS号为23062-24-0，由MCE提供。
下述实施例中所用的白色念珠菌为白色念珠菌标准菌株SC5314(也称为ATCCMYA-2876)。白色念珠菌的活化步骤为：将白色念珠菌接种于LB固体培养基(配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L，溶剂为双蒸水)上活化，置于30℃培养箱培养过夜。
下述实施例中复苏及培养人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的方法为：将冻融的A549细胞转移至含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，于37℃、5％ CO2条件下过夜培养。
下述实施例中所用的GMM培养液的配方为：6.7g/L YNB、0.2％葡萄糖。
下述实施例中所用的细胞维持液为含1％(v/v)FBS的DMEM培养基。
实施例1(东革内酯对白色念珠菌菌丝的影响)
测试方法如下：
挑取活化后的白色念珠菌接种于GMM培养液中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600，用GMM培养液将菌液稀释至OD600＝0.1。取500μL菌液于1.5mL EP管中，加入东革内酯(溶剂为DMSO，终浓度设置为100μM、50μM、25μM、12.5μM)；以加入不含东革内酯的等体积DMSO进行相同处理，作为DMSO对照组(记为：DMSO)。每个组重复三次。震荡混匀，置于37℃水浴锅中孵育6h后，5000rpm离心10min，弃上清，加入40μL GMM培养液重悬菌体，于ZeissAxioplan 2显微镜下观察菌丝的形成，取不同视野拍摄照片，每个样品拍3张照，统计照片上的菌丝，以DMSO对照组形成的菌丝为100％，并计算菌丝形成率。
东革内酯对白色念珠菌菌丝形成影响的照片如图1所示。东革内酯对白色念珠菌菌丝形成率的影响如图2所示。
DMSO不影响白色念珠菌菌丝的形成。通过统计菌丝，发现东革内酯对白色念珠菌有明显的菌丝抑制作用，具有一定的浓度依赖性，经50μM、25μM、12.5μM东革内酯处理后的菌丝形成率分别为16％、48％和71％；其中，经过100μM东革内酯处理后，白色念珠菌基本没有菌丝形成。
实施例2(东革内酯对白色念珠菌的粘附力的影响)
测试方法如下：
(1)将A549细胞复苏培养后，按0.5×103个/孔的细胞浓度接种于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％时，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。
(2)接种白色念珠菌于GMM培养液中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600。随后用细胞维持液将菌液稀释至OD600＝0.5，得到稀释后的菌液。将分别含10mM、5mM、2.5mM、12.5mM东革内酯的DMSO分别与稀释后的菌液按体积比1:99混合，震荡混匀，得到测试液A(东革内酯终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM)。
(3)将测试液A按100μL/孔加入步骤(1)的96孔板中，每个处理设置3个重复。不经东革内酯处理的组作为DMSO对照组(记为：DMSO)。将96孔板静置于37℃中孵育1.5h后弃掉培养液，每孔加入100μL浓度为0.5％(w/v)的结晶紫溶液，室温作用45min；弃结晶紫溶液，并用冰ddH2O洗10次，加入100μL 75％(v/v)乙醇溶液，室温放置30min，测定OD570，用GraphPad Prism 6软件处理数据。
检测结果如图3所示。
以DMSO对照组为参照，经100μM、50μM、25μM、12.5μM的东革内酯处理后的白色念珠菌的细胞黏附率分别为40％、68％、77％和87％；其中，经终浓度为100μM的东革内酯处理后的白色念珠菌在细胞上的粘附力，降低50％以上。这表明东革内酯显示了对白色念珠菌的粘附力有抑制作用。
实施例3(东革内酯对白色念珠菌的生物膜形成的影响)
测试方法如下：
接种白色念珠菌于GMM培养液中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600，用GMM培养液将菌液稀释至OD600＝0.1，得到稀释后的菌液。将分别含10mM、5mM、2.5mM、1.25mM东革内酯的DMSO分别与稀释后的菌液按体积比1:99混合，震荡混匀，得到测试液B(东革内酯终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM)。将测试液B按100μL/孔加入96孔板中，每个处理设置3个重复。不经东革内酯处理的组作为DMSO对照组(记为：DMSO)。将96孔板静置于37℃中孵育8h后，弃掉培养液，加入100μL浓度为0.5％(w/v)的结晶紫溶液，室温作用45min；弃结晶紫溶液，并用预冷的ddH2O洗10次，加入100μL 75％(v/v)乙醇溶液，室温放置30min，测定OD570，用GraphPad Prism 6软件处理数据。
检测结果如图4所示。
以DMSO对照组为参照，经100μM、50μM、25μM、12.5μM东革内酯处理后的白色念珠菌的生物膜形成率分别为9.45％、14.46％、15.63％和21.38％；其中，经100μM东革内酯处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯上的生物膜形成率降低90％以上。这表明东革内酯对白色念珠菌的生物膜形成有很好的抑制作用。
实施例4(东革内酯对白色念珠菌的生长的影响)
测试方法如下：
接种白色念珠菌于GMM培养液中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600，用GMM培养液将菌液稀释至OD600＝0.05，得到稀释后的菌液。将分别含10mM、5mM、2.5mM、1.25mM东革内酯的DMSO分别与稀释后的菌液按体积比1:99混合，震荡混匀，得到测试液C(东革内酯终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM)。将测试液C按300μL/孔加入到100孔板中，每个处理设置3个重复。不经东革内酯处理的组作为DMSO对照组(记为：DMSO)。将100孔板置于生长曲线测定仪中，培养条件为30℃、200rpm，每2h测定一次OD600，培养20h后观察实验结果，用GraphPad Prism 6软件处理数据。
检测结果如图5所示。
以DMSO对照组为参照，经100μM、50μM东革内酯处理，对白色念珠菌的生长有一定的抑制作用，但是12.5μM、25μM东革内酯处理下对白色念珠菌的生长抑制作用微弱。这也表明东革内酯对白色念珠菌的抑制作用并不是主要通过杀死真菌细胞实现的，不易产生耐药性。
实施例5(东革内酯对白色念珠菌毒力的影响)
测试方法如下：
(1)将A549细胞复苏培养后，按1.5×104个/孔的细胞浓度接种于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％时，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。
(2)接种白色念珠菌于GMM培养液中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600。随后用细胞维持液将菌液稀释至OD600＝1.0，再用细胞维持液继续稀释10倍，得到稀释后的菌液。
(3)①东革内酯对A549细胞的细胞毒性检测：
将含10mM东革内酯的DMSO分别与细胞维持液按体积比1:99混合，得到测试液D(东革内酯终浓度分别为100μM)。不经东革内酯处理的组作为DMSO对照组(记为：DMSO)。将测试液D按100μL/孔加入步骤(1)的96孔板中于37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养8h，每处理3个重复。
以裂解液组的LDH释放量作为参照(记为100％)，以规范加入东革内酯处理后的LDH释放比例。
②东革内酯对白色念珠菌毒力的影响：
将含10mM、5mM、2.5mM、1.25mM东革内酯的DMSO分别与稀释后的菌液按体积比1:99混合，得到测试液E(东革内酯在测试液E中的终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM)。将测试液E按100μL/孔加入步骤(1)的96孔板中于37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养8h，每处理3个重复。
(4)参照Promega公司CytoTox NonRadioactive Cytotoxicity Assay操作方法测定细胞毒性，随后用GraphPad Prism 6处理数据。
以DMSO对照组的LDH释放量作为参照(记为100％)，以规范加入东革内酯处理后的LDH释放比例。
测试结果如图6所示。
在没有白色念珠菌的条件下，100μM东革内酯对A549细胞没有毒性，说明东革内酯本身是没有细胞毒性的。在加入白色念珠菌的条件下，东革内酯对细胞有很好的保护作用；经100μM、50μM、25μM、12.5μM东革内酯处理后，细胞毒性分别为11％、22％、33％和46％；尤其，100μM东革内酯处理下，白色念珠菌的毒力降低了80％以上。这表明东革内酯对白色念珠菌的细胞毒力有很好的抑制作用。
实施例6(东革内酯对白色念珠菌小鼠口腔侵染的影响)
测试方法如下：
(1)将BALB/c小鼠(6～8周龄，雄性，购于广东省实验动物中心)于华南农业大学实验动物中心饲养，随机分组，每组8只，称重记录并给每只小鼠做好标记。
(2)接种白色念珠菌于GMM培养液中，30℃、200rpm振荡培养过夜，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，用预冷的无菌PBS洗涤2次，通过血细胞计数法计数，用PBS将白色念珠菌制备成菌密度为3×106CFU/mL的菌悬液。
(3)将含10mM、5mM东革内酯的DMSO与PBS按体积比1:99混合，得到测试液F(东革内酯终浓度分别为100μM、50μM)。
(4)小鼠口腔侵染实验：小鼠感染前一天称重并每只注射0.1mL/10g的氢化可的松(22.5mg/mL)，接种前，先用10％的水合氯醛麻醉小鼠，被麻醉的小鼠平放在37℃恒温环境中，用无菌棉球浸透步骤(2)的菌悬液3min后，放在小鼠舌头下90min。以浸透PBS溶液的无菌棉球处理的小鼠作为空白对照组(记为：PBS)。分别在第1、3、5天按100μL/10g给每只小鼠灌胃测试液F。将含有0μM东革内酯的测试液F处理的小鼠作为阳性对照组(记为：+C.albicans&DMSO)；100μM、50μM东革内酯处理组分别记为：+C.albicans&Eurycomalactone(100μM)和+C.albicans&Eurycomalactone(50μM)。于第6天处死小鼠，把小鼠舌头进行解剖并进一步进行病理切片观察。
检测结果如图7所示。
通过观察小鼠舌头上白色念珠菌形成情况，发现阳性对照组的小鼠舌头形成一层厚厚的白色念珠菌菌丝层，而空白对照组和东革内酯处理组的小鼠舌头没有菌丝形成。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (9)
1.东革内酯或其药学上可接受的盐在A1至A3任一项中的应用，
A1、制备用于抗白色念珠菌感染的产品；
A2、非疾病诊断治疗目的地抗白色念珠菌感染；
A3、制备用于预防和/或治疗由白色念珠菌感染导致的疾病的产品。
2.东革内酯或其药学上可接受的盐在B1或B2中的应用，
B1、制备抑制白色念珠菌菌丝形成的产品；
B2、非疾病诊断治疗目的地抑制白色念珠菌的菌丝形成。
3.东革内酯或其药学上可接受的盐在C1或C2中的应用，
C1、制备降低白色念珠菌细胞粘附力的产品；
C2、非疾病诊断治疗目的地降低白色念珠菌细胞粘附力。
4.东革内酯或其药学上可接受的盐在D1或D2中的应用，
D1、制备抑制白色念珠菌生物膜形成的产品；
D2、非疾病诊断治疗目的地抑制白色念珠菌生物膜形成。
5.东革内酯或其药学上可接受的盐在E1或E2中的应用，
E1、制备降低白色念珠菌毒力的产品；
E2、非疾病诊断治疗目的地降低白色念珠菌毒力。
6.一种产品，其特征在于，包括东革内酯或其药学上可接受的盐；
所述产品具有F1至F6中的至少一种作用：
F1、抗白色念珠菌感染；
F2、预防和/或治疗由白色念珠菌感染导致的疾病；
F3、抑制白色念珠菌菌丝形成；
F4、降低白色念珠菌在细胞上的粘附力；
F5、抑制白色念珠菌生物膜形成；
F6、降低白色念珠菌细胞毒力。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品为致病毒力抑制剂或药物。
8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品还包括药物学上可接受的辅料。
9.一种非疾病诊断治疗目的地抑制白色念珠菌活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用东革内酯或其药学上可接受的盐，或权利要求6至8任一项所述的产品抑制白色念珠菌致病毒力。
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